黃顙魚源銅綠假單胞菌PA-5的分離及其對(duì)寄主抗菌肽基因的影響

閻 華，王 會(huì)，湯尚文，于 博，黃升謀，李云捷，吳進(jìn)菊，李玉奇

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441053)

【研究意義】黃顙魚屬于輻鰭魚綱，鲇形目，鲿科，是一種常見(jiàn)的淡水魚，是食用魚中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚類。其養(yǎng)殖分布廣，產(chǎn)量高，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。肉嫩，味美，少刺多脂。湖北省漢川市已經(jīng)具有相當(dāng)規(guī)模的黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，并在不斷地?cái)U(kuò)大[1]。但是當(dāng)?shù)攸S顙魚養(yǎng)殖戶為了追求更多經(jīng)濟(jì)效益，在其養(yǎng)殖過(guò)程中采用過(guò)度密度養(yǎng)殖，并且投食高蛋白飼料，引發(fā)黃顙魚生長(zhǎng)水環(huán)境急劇惡化。而且許多養(yǎng)殖戶忽視了黃顙魚預(yù)防疾病措施，導(dǎo)致其傳染性疾病趨向嚴(yán)重，發(fā)病率有的養(yǎng)殖場(chǎng)可以達(dá)到75%以上，造成大量魚體死亡，經(jīng)濟(jì)效益受損[2]。在2019年6-9月，湖北省漢川市的幾個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)同時(shí)爆發(fā)黃顙魚疾病，均表現(xiàn)為體表潰瘍，魚體口鼻充血、流血，對(duì)魚體解剖，明顯發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腎臟腫大，并伴有血斑。本研究室對(duì)其病原菌分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，是屬于銅綠假單胞菌的急性感染。銅綠假單胞菌廣泛存在于自然界，是一種革蘭氏陰性菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖主要的條件致病菌。銅綠假單胞菌感染黃顙魚后，會(huì)導(dǎo)致寄主產(chǎn)生腹水病、腐皮病以及敗血癥。銅綠假單胞菌的溶血性毒素致病力強(qiáng)，可以引發(fā)寄主細(xì)胞膜裂解[3]。該病原菌也可以引發(fā)人體產(chǎn)生疾病，可以引起皮膚病，腸炎病和呼吸道疾病，屬于人獸共患病原菌。魚體的抗菌肽在其免疫系統(tǒng)中防御病原體發(fā)揮著重要的作用，眾多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，抗菌肽特征為強(qiáng)堿性、對(duì)熱較為穩(wěn)定和具有廣譜抗菌性能等[4]。魚體內(nèi)發(fā)育成熟的抗菌肽可以抵抗外界細(xì)菌和真菌的感染?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的作用機(jī)制是結(jié)合到細(xì)菌或者真菌的細(xì)胞膜，引發(fā)細(xì)胞膜形成跨膜離子通道，使得細(xì)菌或者真菌細(xì)胞內(nèi)容物破裂，引發(fā)細(xì)菌或者真菌死亡。不同魚類生物的抗菌肽種類不盡相同，產(chǎn)生的位置也相同，但是大部分存在于肝臟，腎臟，皮膚、胃黏膜和小腸細(xì)胞等部位?？咕腜iscidin擁有25個(gè)氨基酸，是雙親性a螺旋構(gòu)造，不同種類抗菌肽氨基酸序列比對(duì)表明其序列同源性不是很高。該族抗菌肽基因結(jié)構(gòu)大致相同，一般存在4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。但是羅非魚和石斑魚等，也存在不同的基因結(jié)構(gòu)，其他形式的基因結(jié)構(gòu)，如3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子或者 5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子等結(jié)構(gòu)[5]。陳大瑋等研究了棕點(diǎn)石斑魚的抗菌肽piscidin，并在原核生物中克隆和表達(dá)?？咕腜iscidin在魚體的不同部位可以形成不同的異構(gòu)體，主要表達(dá)部位為肝臟，腎臟，鰓、皮膚和腸[6]。多種外界刺激病原體，如G+、G-細(xì)菌，病毒、寄生蟲(chóng)等，均可誘導(dǎo)魚體生物的抗菌肽piscidin抗菌肽的特異性表達(dá)。迄今發(fā)現(xiàn)，抗菌肽piscidin具有廣譜抗菌性，尤其對(duì)鏈球菌、假單胞菌、弧菌等具有良好效果[7]。【本研究切入點(diǎn)】本研究對(duì)湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場(chǎng)患病黃顙魚的病原菌進(jìn)行分離鑒定，在此基礎(chǔ)上，健康黃顙魚腹腔注射該病原菌，銅綠假單胞菌PA-5感染以后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)探討菌肽基因PC1/PC2/PC3在黃顙魚肝臟，腎臟以及表皮組織中的不同表達(dá)特征?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】此研究為分析黃顙魚抗菌肽在對(duì)抗細(xì)菌性感染產(chǎn)生和變化的機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

HZP-25型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、BKQ-B50型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司)、KENTON-101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海康恒科學(xué)儀器有限公司)、SJ-56型超凈工作臺(tái)(蘇州潔凈設(shè)備有限公司)、T3型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海一鋪儀器有限公司)、VITEK-32型全自動(dòng)微生物分析鑒定儀(梅里埃公司)、RE-200型低溫冰箱(青島海爾電器有限公司)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和生理鹽水，DNA提取試劑盒(北京華康生物技術(shù)有限公司)。PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。MINIAMP-1型PCR儀器(美國(guó)貝登儀器公司)。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(上海啟發(fā)試驗(yàn)試劑有限公司)。Trizol試劑盒(北京賽英生物科技有限公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京興東生物工程公司)。SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。BTK-3型熒光定量PCR儀(無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.2 黃顙魚致病菌的分離與鑒定

1.2.1 患病黃顙魚的獲取及其致病菌的分離 患病黃顙魚從湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場(chǎng)獲得，具有典型敗血癥特征，主要表現(xiàn)為魚體反應(yīng)遲鈍，攝食少或者不攝食，口鼻充血，皮膚表面有斑點(diǎn)出血。對(duì)這些患病黃顙魚解剖后，發(fā)現(xiàn)其肝臟和腎臟腫大，有點(diǎn)狀出血，腸道部位也有充血。實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下解剖發(fā)病黃顙魚，挑取出肝臟后，用無(wú)菌研缽快速勻漿。然后把勻漿稀釋成不同倍數(shù)，分別移液取用勻漿10 mL，均勻涂布到麥康凱瓊脂平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)。挑取優(yōu)勢(shì)菌群菌落，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)次后，挑取菌落形態(tài)較為一致單菌落進(jìn)行低溫保藏，作為后續(xù)試驗(yàn)用菌株。

1.2.2 致病菌菌株的生理生化鑒定 革蘭氏染色是在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下開(kāi)展，將菌株用接種環(huán)均勻涂布到滴有生理鹽水的載玻片上，高溫干燥后使用酒精燈固定，固定后放置結(jié)晶紫染液中初染1 min，而后在碘液中染色1 min，隨后滴加乙醇溶液進(jìn)行脫色30 s，直到載玻片表面無(wú)紫色液體，最后在番紅染液中染色1 min，干燥后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。生理生化特征使用VITEK-32全自動(dòng)微生物分析鑒定儀進(jìn)行操作，革蘭陰性菌鑒定板進(jìn)行操作，試驗(yàn)完成后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3 致病菌菌株的分子生物學(xué)鑒定 致病菌菌株DNA的制備按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。致病菌菌株多重PCR包括兩對(duì)引物(大連寶生物工程有限公司)，具體見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10.0 μLTaqmaster mixture，0.8 μL gyrB引物，0.5 μL 16srRNA引物和1.0 μL提取DNA，余量為ddH2O[8]。PCR擴(kuò)增過(guò)程：預(yù)變性92 ℃，5 min。93 ℃，30 s，58 ℃，45 s，70 ℃，30 s，循環(huán)30周期。最后70 ℃，延伸10 min。擴(kuò)增完成的DNA片段取用8.0 μL 放置在2%瓊脂糖凝膠上水平電泳，電泳過(guò)程中加入1×TAE緩沖液(0.04 mol/L Tris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA)，電泳電壓100 V，電泳時(shí)間45 min。電泳完成后使用1 μL溴化乙錠染色30 min，紫外燈進(jìn)行拍照。基因大小比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是100個(gè)堿基對(duì)DNA梯度標(biāo)記物。擴(kuò)增完成的DNA片段經(jīng)過(guò)純化連接入pMD18-T載體，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行堿基序列測(cè)序。

表1 致病菌菌株鑒定所用引物序列和目標(biāo)基因

1.3 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后其抗菌肽基因的表達(dá)影響

1.3.1 健康黃顙魚的獲取 從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)研究院購(gòu)買外觀健康、大小較為一致的黃顙魚，魚體質(zhì)量大約為(150±5)g、體長(zhǎng)大約為(30±1)cm。魚塘養(yǎng)殖1周后，飲食均正常的魚體進(jìn)行接種試驗(yàn)，試驗(yàn)魚隨機(jī)分配，產(chǎn)生兩個(gè)處理組：試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行50尾，共計(jì)300尾。

1.3.2 黃顙魚的病原菌侵染和樣品收集 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，銅綠假單胞菌PA-5感染黃顙魚的最適菌懸液濃度為3.0×106cfu/mL。將恒溫培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌PA-5以0.65%無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行洗脫，并稀釋為3.0×106cfu/mL。采用黃顙魚腹腔注射方式，注射前魚體用100 mg/L丁香酚局部麻醉，試驗(yàn)組每尾注入0.2 mL菌懸液，對(duì)照組注入0.2 mL無(wú)菌生理鹽水。注射完成后0，12，24，36，48，60，72，84，96 h，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各個(gè)平行取3尾魚，解剖后收集魚體肝臟，腎臟和表皮組織。置于-80 ℃ 液氮中保存，作為后續(xù)抗菌肽基因的表達(dá)影響研究樣品。

1.3.3 樣品的RNA提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 解凍后的肝臟，腎臟和表皮組織使用 Trizol試劑盒，按照說(shuō)明書方法提取總RNA。提取獲得的RNA使用1%瓊脂糖凝膠水平電泳檢測(cè)其總RNA的純度，紫外燈下觀察總RNA濃度。然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，樣品總RNA溶液加入0.5 μL DNA-Eraser，隨后加入反轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和引物2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)溶液10.0 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣品4 ℃保存，作為后續(xù)研究樣品。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析是使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書方法進(jìn)行操作，引物(大連寶生物工程有限公司)具體見(jiàn)表2。qPCR反應(yīng)溶液(25.0 μL)：SYBR Green PCR Mix溶液 12.5 μL，PC1/PC2/PC3引物溶液(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，余量為雙蒸水。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性，95 ℃，30 s。95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，循環(huán)40周期；60 ℃下實(shí)時(shí)采集反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)。

表2 黃顙魚抗菌肽相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR所使用的引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)二分法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量差異采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析[9]，并使用t檢驗(yàn)法對(duì)其差異進(jìn)行顯著性分析，P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌菌落形態(tài)和菌株特征

采用劃線純化平板培養(yǎng)的方法從患病黃顙魚的肝臟樣品分離得到1株菌落形態(tài)較為一致的菌株，命名為PA-5。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓形，邊緣較為光滑濕潤(rùn)，中央稍微隆起，半透明，灰綠色具體見(jiàn)圖1-A。革蘭氏染色后PA-5為革蘭氏陰性細(xì)菌，顯微鏡觀察為紅色，長(zhǎng)棒狀直的或者彎的桿菌，長(zhǎng)度約2.0 μm，寬度約0.6 μm，細(xì)胞分散，單個(gè)存在，可以運(yùn)動(dòng)，具體見(jiàn)圖1-B。

圖1 患病黃顙魚的肝臟中分離的致病菌PA-5菌落形態(tài)(A)和菌株特征(B)

2.2 致病菌菌株的生理生化鑒定

致病菌菌株P(guān)A-5，使用VITEK-32 全自動(dòng)微生物分析鑒定儀，革蘭氏陰性鑒定板進(jìn)行操作，其對(duì)葡萄糖，伯膠糖，單奶糖和甘露糖靈敏，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，表明該菌株能夠利用這些物質(zhì)，合成體內(nèi)所需物質(zhì)。對(duì)麥芽糖，葡聚糖，棉子糖，乳糖和蔗糖鈍化，產(chǎn)氣不產(chǎn)酸，表明該菌株不能夠利用這些物質(zhì)，不能夠合成體內(nèi)所需物質(zhì)。綜合生理生化特性，鑒定結(jié)果為銅綠假單胞菌，生理和生化特性具體見(jiàn)表3。

表3 致病菌株P(guān)A-5生理生化特性

2.3 致病菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

如圖2所示，使用多重PCR技術(shù)進(jìn)行操作后，證實(shí)患病黃顙魚分離得到的致病菌PA-5攜帶有969 bp的gyrB基因，同時(shí)攜帶有1380 bp的16srRNA基因。將測(cè)序完成的DNA片段經(jīng)過(guò)基因序列比對(duì)，該菌與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的銅綠假單胞菌的親緣關(guān)系最為接近，因此鑒定致病菌PA-5為銅綠假單胞菌。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)品，1：致病菌PA-5，2：肝臟感染菌

2.4 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚PC1抗菌肽基因表達(dá)的影響

黃顙魚腹腔注射銅綠假單胞菌PA-5后，PC1抗菌肽基因在肝臟組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中24,36與 差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達(dá)量最高(圖3-1)。PC1抗菌肽基因在腎臟組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達(dá)量最高(圖3-2)。PC1抗菌肽基因在表皮組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中36,48與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后36 h表達(dá)量最高(圖3-3)。

* 顯著性差異(P<0.05)，下同

2.5 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC2抗菌肽基因的表達(dá)影響

黃顙魚腹腔注射銅綠假單胞菌PA-5后，PC2抗菌肽基因在肝臟組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達(dá)量最高(圖4-1)。PC2抗菌肽基因在腎臟組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達(dá)量最高(圖4-2)。PC2抗菌肽基因在表皮組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中36,48與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后36 h表達(dá)量最高(圖4-3)。

圖4 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC2抗菌肽基因表達(dá)的影響

2.6 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC3抗菌肽基因的表達(dá)影響

黃顙魚腹腔注射銅綠假單胞菌PA-5后，PC3抗菌肽基因在肝臟組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中24,36 與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達(dá)量最高(圖5-1)。PC3抗菌肽基因在腎臟組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中24,36與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后24 h表達(dá)量最高(圖5-2)。PC3抗菌肽基因在表皮組織的表達(dá)量相對(duì)于0 h均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中36,48與0 h差異顯著(P<0.05)，感染后36 h表達(dá)量最高(圖5-3)。

圖5 銅綠假單胞菌PA-5侵染健康黃顙魚后PC3抗菌肽基因的表達(dá)

3 討 論

銅綠假單胞菌屬于變形菌門，γ-變形菌綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬。其存在的水環(huán)境條件比較惡劣，從而引發(fā)魚類及其他水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生感染，并產(chǎn)生疾病。該致病菌感染黃顙魚后，會(huì)引發(fā)集體感染，引發(fā)群體性事件，并產(chǎn)生較強(qiáng)的并發(fā)癥。銅綠假單胞菌作為一種條件致病菌，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，但是水環(huán)境條件的惡化有著至關(guān)重要的關(guān)系。眾多科學(xué)家研究表明，其可以感染鯉魚、黃顙魚、河鱸、鯽魚等多種經(jīng)濟(jì)魚類。銅綠假單胞菌的常規(guī)鑒定方法中，常規(guī)的生長(zhǎng)特性和生理生化特性較為精準(zhǔn)，是目前研究中常用的方法。同時(shí)采用16SrDNA和其他特性基因?yàn)槟康幕虻亩嘀豍CR方法對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行鑒定也同樣存在良好的應(yīng)用價(jià)值[5]。本研究從湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場(chǎng)的染病黃顙魚肝臟中取樣，使用劃線分離純化技術(shù)獲得致病菌菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)后，生長(zhǎng)速度快，形態(tài)較為均一，從而命名為PA-5。使用VITEK-32全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行操作后，獲得其生長(zhǎng)特性和生理生化特征，其具有銅綠假單胞菌基本特征。也對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的染病黃顙魚進(jìn)行了多重PCR技術(shù)測(cè)定，結(jié)果表明，銅綠假單胞菌PA-5同時(shí)攜帶有16SrRNA和gyrB基因。表明菌株P(guān)A-5具有銅綠假單胞菌序列特征以及溶血性病原的特征。人工注射菌株P(guān)A-5到健康黃顙魚魚體中，其能侵染寄主的腎臟、肝臟和血液等，引發(fā)其廣泛性出血、全身性腫脹、顆粒樣病變、大量組織壞死和紅細(xì)胞裂解。癥狀與銅綠假單胞菌自然病例相似，分離得到的菌株與接種菌株相同，菌落形態(tài)也相似。

水產(chǎn)動(dòng)物受到病原菌感染后，機(jī)體會(huì)迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有助于生成體內(nèi)免疫因子以消除病原菌。魚類生物體中產(chǎn)生了抗菌肽就是重要的免疫因子，可以分布在不同的組織器官。抗菌肽可以發(fā)揮多種生物學(xué)功能，但是其主要的功能是對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗作用，可以抑制細(xì)菌，寄生蟲(chóng)和病毒等[10]。魚類動(dòng)物的生長(zhǎng)環(huán)境較為復(fù)雜，病原菌種類較多，抗菌肽的數(shù)量也較多，現(xiàn)在已經(jīng)明確的有150余種。魚源抗菌肽除了具有抗菌肽的共有特性，包括廣譜抗菌、免疫調(diào)控，還有種屬特異性，從而保證不同魚類應(yīng)對(duì)復(fù)雜水體環(huán)境和不同病原體[11]。因此，魚類生物的抗菌肽在疾病的預(yù)防和治療等方面具有優(yōu)良的應(yīng)用前景，可以用于制備疫苗和抗生素。眾多前人科學(xué)研究揭示，魚類動(dòng)物的肝臟組織和腎臟組織可以產(chǎn)生抗菌肽之外，皮膚腺體也能夠合成多種抗菌肽，促進(jìn)魚類生物有效地防御病原體[12]。本研究將分離得到的銅綠假單胞菌PA-5腹腔注射侵染健康黃顙魚，分別在侵染后0～96 h隨機(jī)選取黃顙魚解剖并進(jìn)行取樣檢測(cè)。結(jié)果揭示，黃顙魚肝臟組織中抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相對(duì)表達(dá)量受侵染24和36 h顯著高于對(duì)照組；黃顙魚腎臟組織中抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相對(duì)表達(dá)量受侵染24和36 h顯著高于對(duì)照組；而在黃顙魚皮膚組織中，抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相對(duì)表達(dá)量受侵染36和48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組。從而說(shuō)明黃顙魚抗菌肽基因PC1/PC2/PC3在肝臟和腎臟中響應(yīng)病原菌的感染比在表皮組織中更加迅速，這或許就是腸道病原菌的通用特點(diǎn)。所以抗菌肽在內(nèi)臟組織的特異表達(dá)對(duì)啟動(dòng)魚體天然免疫應(yīng)答抵抗病原菌感染具有更加積極作用。健康黃顙魚注射銅綠假單胞菌PA-5后，能夠促進(jìn)其全身性抗菌肽基因表達(dá)量上調(diào)，證實(shí)黃顙魚免疫系統(tǒng)可以快速應(yīng)答于病原體，其抗菌肽在黃顙魚免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。從而為揭示抗菌肽在病原體感染魚體生物的響應(yīng)機(jī)制提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場(chǎng)患病黃顙魚的病原菌種類得到分離和鑒定并分析其影響寄主抗菌肽基因表達(dá)的特點(diǎn)。以患病黃顙魚肝臟作為樣本，使用劃線培養(yǎng)的技術(shù)，分離得到病原菌PA-5。對(duì)病原菌進(jìn)行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，其形態(tài)為長(zhǎng)棒狀，革蘭氏染色為陰性。再進(jìn)行VITEK-32全自動(dòng)微生物分析鑒定儀操作，該病原菌對(duì)D-葡糖酸、丙二酸和葡萄糖等反應(yīng)靈敏，對(duì)黏菌素、七葉苷和阿拉伯糖等反應(yīng)遲鈍。采用多重PCR技術(shù)對(duì)該菌16SrRNA和gyrB基因序列分析后發(fā)現(xiàn)，該菌與銅綠假單胞菌的特征序列相似，親緣關(guān)系較為接近，綜合后鑒定該病原菌為銅綠假單胞菌。同時(shí)以該病原菌為樣本，分析其感染黃顙魚后，對(duì)寄主抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的表達(dá)影響。在黃顙魚的腹腔中注射3.0×106cfu/mL銅綠假單胞菌PA-5，侵染完成后0～96 h分別解剖獲取黃顙魚的肝臟，腎臟以及表皮組織。然后利用Trizol試劑盒操作獲取黃顙魚總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析黃顙魚抗菌肽基因PC1/PC2/PC3基因表達(dá)變化特點(diǎn)。銅綠假單胞菌PA-5侵染黃顙魚后，寄主肝臟組織中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相對(duì)表達(dá)量24，36 h較高，與對(duì)照組比較顯著(P<0.05)；寄主腎臟組織中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相對(duì)表達(dá)量24，36 h較高，與對(duì)照組比較顯著(P<0.05)；寄主表皮組織中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相對(duì)表達(dá)量36，48 h較高，與對(duì)照組比較顯著(P<0.05)。寄主肝臟組織，腎臟組織，表皮組織抗菌肽基因的表達(dá)均快速增加，但是肝臟組織和腎臟組織反應(yīng)時(shí)間早于表皮組織。因此，銅綠假單胞菌PA-5是湖北省漢川市同旺養(yǎng)殖場(chǎng)黃顙魚的主要病原體，其感染黃顙魚后，寄主抗菌肽基因PC1/PC2/PC3會(huì)積極響應(yīng)，這些基因的大量表達(dá)有助于魚體天然免疫應(yīng)答，有助于抵抗病原微生物的感染。