脂肪干細胞旁分泌因子干預兔激素性股骨頭缺血性壞死的研究

[1.遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院骨科，廣東 珠海519100；2.中山大學附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州510080]

長期高劑量使用激素導致的股骨頭缺血性壞死稱為激素性股骨頭缺血性壞死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)，其致殘率較高，是骨科常見的難治癥之一。目前，SANFH主要治療手段包括髖關節(jié)牽引制動、中藥治療、鈣劑治療等，但都缺乏確切療效。脂肪組織遍布于哺乳動物全身，不僅維持能量代謝，而且有內(nèi)分泌作用，給組織工程和再生醫(yī)學領域提供了新的研究方向。其中干細胞工程將脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)用于骨關節(jié)炎、糖尿病、心臟病、乳房切除后和面部創(chuàng)傷后修復中的軟組織再生和重建[1]，也有研究提出ADSCs可用于修復缺血壞死的股骨頭，幫助其重建骨小梁等結構[2]，讓SANFH患者看到了治療的新曙光。有觀點認為，ADSCs在一些組織損傷的治療過程中主要依賴其旁分泌功能作用[3]，而目前對于ADSCs旁分泌因子的研究主要集中于心肌梗死、皮膚軟組織修復及抗衰老等方面,國內(nèi)外尚未見ADSCs治療SANFH的相關報道。因此，本研究擬建立兔SANFH模型，評價ADSCs旁分泌因子治療兔SANFH的療效。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實驗動物：63只體質(zhì)量2～3 kg的SPF級雌性家兔，由四川大學華西醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(川)2014-0013。主要儀器：血液流變分析儀(LG-R-80A，北京世帝科學儀器有限公司)、signal excite HD-1.5 Twin-speed MRI掃描儀(GE，美國)、顯微鏡(Leica DM3000，Leica，德國)。主要試劑：4%多聚甲醛固定液(生產(chǎn)批號：20190103，銀川市偉博鑫生物科技有限公司)、甲基強的松龍琥珀酸鈉(生產(chǎn)批號：20190723，普強蘇州制藥有限公司)、注射用普魯卡因青霉素(生產(chǎn)批號：A1900417，華北制藥集團先泰藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與動物造模[4]隨機取42只家兔，采用馬血清聯(lián)合甲基強的松龍琥珀酸鈉建立SANFH模型：取馬血清(10 mL/kg)于兔耳緣靜脈注射，3周后重復注射1次；重復注射馬血清2周后在兔腹腔內(nèi)注射甲基強的松龍琥珀酸鈉(45 mg/kg)，每天1次，連續(xù)3 d。注射激素期間同時肌肉注射青霉素10萬單位預防感染，每天1次，連續(xù)7 d。通過電子計算機X射線斷層掃描機行雙側股骨頭斷層掃描成像，骨小梁大量空骨陷窩形成或存在核固縮骨細胞，且骨小梁周圍骨髓組織發(fā)生壞死則可定義為骨壞死，提示造模成功。造模完成后將42只家兔隨機分為模型組和干預組，每組21只，其中干預組在家兔的股骨頭關節(jié)腔注射ADSCs旁分泌因子100 μL，制作方法：取2×106個ADSCs細胞混懸于1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，取0.1 mL PBS與0.1 mL透明質(zhì)酸以1∶1的比例混合制成；模型組家兔在股骨頭關節(jié)腔注射等量生理鹽水。其余21只家兔設為對照組，每次均在兔耳緣靜脈和腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水，同時預防性肌肉注射青霉素預防感染，每天1次，連用7 d。

1.2.2 家兔ADSCs制備[5]無菌條件下取各組家兔頸背部脂肪組織約3 g，去除血管及淺筋膜等組織后用PBS反復沖冼，剪碎至糊狀，置于37 ℃恒溫振蕩水浴搖床中，并注入濃度為0.1%的Ⅰ型膠原酶0.2 mL。使用等體積完全培養(yǎng)基中和，離心，棄上清,沉淀，重懸，80目尼龍篩網(wǎng)過濾后接種于培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。5 d后換液，吹去紅細胞。待細胞長滿培養(yǎng)孔面積的60%，使用0.25%胰蛋白酶消化，進行原代傳代。最終將細胞制成2×106/mL的ADSCs條件培養(yǎng)液備用。

1.2.3 血液流變學指標檢測 在治療前及治療4周后，于禁食12 h后在家兔耳緣靜脈采血5 mL，使用血液流變分析儀測定家兔全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)和紅細胞壓積等血液流變學指標。

1.2.4 血清軟骨生長相關因子檢測 取2 mL血樣，于4 ℃以1 500 r/min離心5 min，取上清，放射免疫法測定樣本骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的含量。

1.2.5 MRI最大灌注參數(shù)檢測 在治療前及治療4周后，以3%戊巴比妥鈉麻醉家兔，使之仰臥于磁共振平臺上，髖關節(jié)充分外展，將表面線圈固定于雙側髖關節(jié)外側體表，對雙側髖關節(jié)進行動態(tài)增強核磁掃描。采用T1加權的超快梯度回波，在125 s內(nèi)獲得256張動態(tài)圖像。預掃描15 s取得基線數(shù)值后，使用自動高壓注射儀以0.5 mL/s的速度和0.5 mmol/kg的劑量通過耳緣靜脈注射Gd-DTPA和6 mL生理鹽水。選擇股骨頭位置作為感興趣區(qū)測定信號強度?；€信號強度定義為前15 s獲得的圖像信號強度平均值，最大信號強度定義為125 s測定時間內(nèi)的峰值。灌注參數(shù)最大信號增強=(最大信號強度-基線信號強度)/基線信號強度×100%，將雙側股骨頭最大信號增強的平均值作為每只家兔灌注參數(shù)的評價指標。

1.2.6 HE染色觀察病理形態(tài) 完成上述所有檢測后，處死家兔，取雙側股骨頭標本，10%多聚甲醛固定24 h，快速脫鈣液脫鈣16 h，常規(guī)石蠟包埋切片后行HE染色，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察骨組織、骨髓組織、骨小梁及髓內(nèi)脂肪組織的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 家兔股骨頭病理切片結果

對照組家兔的股骨頭標本中可見骨小梁排列整齊、致密飽滿，有成骨細胞附著，骨細胞清晰可見，骨細胞核位于中央，髓腔內(nèi)造血細胞豐富(圖1a)。模型組家兔的股骨頭標本中可見骨小梁周圍成骨細胞缺失，形成大量空骨陷窩，血管內(nèi)血栓形成；骨細胞核固縮、壞死，骨髓腔內(nèi)出血，造血細胞壞死(圖1b)。干預組家兔的股骨頭標本中骨細胞核固縮不明顯，骨陷窩較對照組略增加部分，部分細胞核周圍可見空暈形成(圖1c)。

a:對照組；b：模型組；c：干預組圖1 家兔股骨頭切片

2.2 家兔MRI最大灌注參數(shù)比較

治療前，3組MRI最大灌注參數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=341.625，P<0.05)，且干預組和模型組均顯著低于對照組(P<0.05)，干預組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.437)。治療后，3組MRI最大灌注參數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=89.761，P<0.05)，且對照組和干預組均顯著高于模型組(P<0.05)，干預組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.331)。治療后，對照組MRI最大灌注參數(shù)與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干預組和模型組MRI最大灌注參數(shù)均較治療前顯著升高(P<0.05)，見圖2。

*：與本組治療前比較，P<0.05圖2 家兔最大灌注參數(shù)比較

2.3 治療后家兔血液流變學指標比較

治療前，干預組和模型組各血液流變學指標均高于對照組(P<0.05)；但干預組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與治療前比較，治療后干預組各血液流變學指標均顯著下降(P<0.05)，對照組和模型組與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后，3組各血液流變學指標比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且模型組均高于對照組和干預組(P<0.05)，干預組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 家兔血液流變學指標比較

2.4 家兔血清BMP-2和TGF-β水平

治療前，對照組BMP-2和TGF-β含量高于模型組和干預組(P<0.05)，模型組和干預組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與治療前比較，治療后干預組BMP-2和TGF-β水平均顯著升高(P<0.05)，模型組和對照組BMP-2和TGF-β水平無明顯變化(P>0.05)。治療后，模型組BMP-2和TGF-β水平低于干預組與對照組(P<0.05)，但干預組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 家兔血清BMP-2和TGF-β水平

3 討論

一項研究表明，高劑量皮質(zhì)類固醇(強的松類>20 mg·kg-1·d-1)的使用與股骨頭壞死之間存在顯著相關性[6]，而其長期使用是導致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要原因[7]，這可能是由于長期使用高劑量糖皮質(zhì)激素可直接或間接導致凝血障礙，使血液處于高凝狀態(tài)，顯著降低股骨頭和股骨頸血流量[8]，隨后出現(xiàn)血流不暢、缺血，最終導致缺血性股骨頭壞死。研究表明，ADSCs可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱等多種細胞，補充替代老化、缺損的組織細胞；還可通過旁分泌功能合成及分泌多種細胞因子、多肽類、氣體分子等活性成分，提高受損細胞的生命力和抗凋亡能力。但也有研究認為，ADSCs在一些組織損傷的治療過程中主要依賴旁分泌功能，因而ADSCs的旁分泌功能成為了目前研究的熱點[9]。本研究通過建立兔SANFH模型，探討ADSCs旁分泌因子治療兔SANFH的療效。

通過MRI觀察家兔股骨頭組織內(nèi)部血流的灌注情況，可以評估組織血液灌注狀態(tài)[10]。Kolb等[11]和Momii等[12]使用MRI評估壞死股骨頭的血運重建，認為通過MRI可了解股骨頭血流灌注情況，評估股骨頭狀態(tài)。本研究運用MRI評估家兔股骨頭血液灌注情況，結果顯示，干預組和模型組治療后MRI最大灌注參數(shù)均顯著上升，且干預組治療后MRI最大灌注參數(shù)顯著高于模型組，而治療后干預組和對照組最大灌注參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。表明ADSCs可改善SANFH家兔股骨頭的血液灌注情況，且經(jīng)ADSCs旁分泌因子干預的家兔恢復情況顯著優(yōu)于模型組，可達到對照組水平，即與正常家兔無異。微循環(huán)中血液黏度主要受紅細胞可變性和血漿黏度的影響[13]，紅細胞可變性下降可使微循環(huán)阻力增加、血液流動減慢，從而增加血液黏度。血液黏度的增加在血循環(huán)中表現(xiàn)為血流速度減慢、紅細胞相互聚集，進而導致股骨頭血液灌注量降低，使骨細胞處于缺血、缺氧狀態(tài)，股骨頭血供明顯減少，最終導致股骨頭缺血性壞死。Drescher等[14]的研究表明，高劑量甲基強的松龍輸注會導致豬的股骨頭血液流變學改變，血流量減少，血漿高凝，最終導致股骨頭壞死的發(fā)生。Chen等[15]的研究表明，促紅細胞生成素可通過抑制成骨細胞和骨細胞的凋亡及增加血管內(nèi)皮生長因子的表達，對糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死起到顯著的保護作用。Worrall等[16]的研究則認為血紅蛋白紅細胞壓積比率對兒童股骨頭壞死有較好的預測性。本研究結果顯示，治療后對照組和干預組高切、中切和低切全血黏度均顯著低于模型組，且血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)和紅細胞壓積也顯著低于模型組，這表明經(jīng)ADSCs旁分泌因子干預的家兔股骨頭血液流動性顯著優(yōu)于模型組。BMP-2可以補充分化成骨祖細胞的間充質(zhì)細胞，刺激骨祖細胞分化為骨系細胞[17]。TGF-β是一類細胞生長分化調(diào)節(jié)蛋白，能夠促進骨膜中成骨細胞和成軟骨細胞增生，促使骨細胞膠原及基質(zhì)蛋白的合成和鈣化，減少破骨細胞的形成，抑制骨吸收[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后干預組BMP-2和TGF-β顯著升高，且干預組顯著高于模型組，這表明干預組股骨頭壞死部位得到了修復，經(jīng)ADSCs旁分泌因子干預可以促進股骨頭的修復。

綜上，ADSCs旁分泌因子可以有效改善SANFH家兔組織的血液灌注和血液流變學參數(shù)，對SANFH有積極的治療效果。但本研究為小樣本單中心動物研究，研究時間較短，尚需大樣本量、遠期動物模型以及臨床研究進一步證實。