1株潞黨參根部內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及促生長指標(biāo)測定

白變霞 竇旭峰 劉榮 李蓉 任嘉紅

摘要：黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]是我國傳統(tǒng)的中藥材之一，具有重要的藥用價值。潞黨參作為山西省的一種重要道地藥材，主要產(chǎn)自山西省長治地區(qū)。從潞黨參根部內(nèi)部分離出1株內(nèi)生細(xì)菌DS-3菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)測定及16S rRNA測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定為Pseudomonas corrugate;對菌株產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)氫氰酸（HCN）、溶磷及固氮能力進(jìn)行測定，結(jié)果顯示該菌株產(chǎn)IAA能力為18.77 μg/mL，產(chǎn)鐵載體能力為68%，對有機(jī)磷的解磷率為40.2%，同時還具備一定的固氮與產(chǎn)HCN能力。綜上可見，菌株DS-3具有一定促生能力，該菌株可作為后續(xù)研發(fā)微生物菌肥的菌種資源。

關(guān)鍵詞：潞黨參;內(nèi)生細(xì)菌;鑒定;促生能力

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0196-05

收稿日期：2021-03-05

基金項目：山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：2019600）。

作者簡介：白變霞（1987—），女，山西汾陽人，博士，講師，主要從事根際有益微生物的研究。E-mail：baibianxia08@126.com。

通信作者：任嘉紅，博士，教授，主要從事微生物學(xué)的相關(guān)教學(xué)與科學(xué)研究。E-mail：renjiahong76@hotmail.com。

黨參作為常用的大宗藥材，藥用時間較為悠久，因其具有健脾、益氣、補(bǔ)血等補(bǔ)益功效，可作為人參的替用品[1]。根據(jù)產(chǎn)地的不同，黨參可主要劃分為產(chǎn)于甘肅省、四川省西北部、陜西省漢中市一帶的素花黨參，產(chǎn)于四川省、湖北省、陜西省交界的條黨參，產(chǎn)于東北一帶的東黨參，產(chǎn)于山西省長治市的潞黨參。山西省長治市為潞黨參的發(fā)源地，該地區(qū)平順縣產(chǎn)的潞黨參被認(rèn)定為我國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[2]。目前，為滿足市場的需求，潞黨參主要通過人工種植。在人工種植過程中，藥農(nóng)通過施用化肥來提高潞黨參的產(chǎn)量。長期施用化肥會導(dǎo)致土壤出現(xiàn)酸化、板結(jié)等現(xiàn)象，影響植株對營養(yǎng)成分的吸收，同時也影響植株根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致減產(chǎn)[3-4]。近年來，微生物肥料因其能對植株生長起到促進(jìn)調(diào)節(jié)作用，同時安全與環(huán)保，正逐步成為化學(xué)肥料的替代品[5]。

內(nèi)生細(xì)菌能夠通過植物的根或地上部分（子葉、葉片、花、莖）進(jìn)入植物組織內(nèi)部存活，但是不會導(dǎo)致宿主植物出現(xiàn)明顯的病害癥狀[6-7]。一些內(nèi)生細(xì)菌能夠與植物建立互利共生關(guān)系，可對植物產(chǎn)生促生作用，并提高抗逆性，這類內(nèi)生細(xì)菌通常被稱為有益內(nèi)生細(xì)菌[8]。植株在生長過程中，土壤通常會缺乏足夠量的1種或多種養(yǎng)分供植物生長所需，有益內(nèi)生細(xì)菌可以幫助寄主植物獲得更多的限制性植物營養(yǎng)物質(zhì)，包括氮、磷、鉀、鐵等[9]。近年來的研究表明，有益內(nèi)生細(xì)菌分泌的5種類型植物激素[脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯、赤霉素、吲哚乙酸（IAA）]可加強(qiáng)植物營養(yǎng)物質(zhì)的積累與代謝[10]。此外，有益內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物如抗生素、鐵載體、水解類酶、揮發(fā)性有機(jī)物等可拮抗植物病原菌，部分還可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，提升植物的抗病能力，間接地促進(jìn)宿主植物的生長[11]。綜上可知，植物有益內(nèi)生細(xì)菌能夠有效地定殖于植物體內(nèi)，并對植物生長代謝發(fā)揮積極作用，因此具有較大的潛能被開發(fā)為生物菌肥和生物農(nóng)藥[12]。

本研究以前期試驗中從潞黨參根內(nèi)部分離得到的1株內(nèi)生菌株DS-3為研究對象，首先對其形態(tài)特征、生理指標(biāo)、及16S rRNA序列進(jìn)行分析與鑒定;其次對該菌株的相關(guān)促生指標(biāo)解磷、固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)氫氰酸（HCN）等能力進(jìn)行測定。本研究以期為課題組后續(xù)開發(fā)應(yīng)用于黨參的微生物肥料提供潛力菌株，為推廣微生物菌肥在黨參的人工綠色種植提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株DS-3為筆者所在課題組于2019年從山西省長治市平順縣潞黨參根部分離所得，該菌株現(xiàn)保藏于筆者所在實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、King液體培養(yǎng)基、CAS檢測平板、MKB培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基、蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基、卵磷脂培養(yǎng)基、Ashby固氮培養(yǎng)基[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的鑒定

將活化的菌株DS-3劃線接種于LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對菌株的菌落形態(tài)及相關(guān)的生理生化特征進(jìn)行觀察與分析。

采用修改的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取菌株的基因組DNA，將其作為模板，經(jīng)細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物FW（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和RV （5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進(jìn)行 25 μL體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán);72 ℃ 7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將大小約 1 600 bp 的條帶進(jìn)行純化回收，并與pMD-19 T-simple載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送至華大基因完成測序。將所得測序結(jié)果經(jīng)NCBI與EzTaxon server數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 溶磷能力的測定

吸取5.0 μL過夜活化的菌液分別點接于蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NBRIP培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察解磷圈，判斷其是否具有解磷能力。采用鉬銻抗比色法測定有效磷的含量，計算菌株的溶磷率[15]。

1.2.3 產(chǎn)IAA能力的測定

將菌株DS-3接種于LB液體培養(yǎng)基，向其中加入L-色氨酸，終濃度為100 mg/L，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，對菌液的D600 nm進(jìn)行測定后離心菌液（10 000 r/min、10 min），參照Glickmann等的方法測定上清液中IAA的產(chǎn)量，同時用IAA標(biāo)準(zhǔn)品繪制其濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計算樣品中的IAA含量[16]。以未接種菌株的培養(yǎng)基作為對照，每組處理重復(fù)3次。

1.2.4 產(chǎn)鐵載體能力的測定

參照Schwyn等的方法[17]，取5 μL菌液點接于CAS 檢測平板上，30 ℃ 靜置培養(yǎng)72 h，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃綠色暈圈，如產(chǎn)生，則表示該菌株可分泌產(chǎn)鐵載體，從而對其產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行定量測定。將活化好的菌液接種于MKB液體培養(yǎng)基（30 mL）中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 24 h，于10 000 r/min、4 ℃離心 15 min，吸取上清液與等量 CAS 染液混勻，常溫條件反應(yīng)1 h，以未接種的 MKB 液體培養(yǎng)基作為空白對照，計算鐵載體的相對產(chǎn)量。

1.2.5 產(chǎn)HCN能力的鑒定

過夜活化后的菌液涂布于含甘氨酸（終濃度4.4 g/L）的PDA固體培養(yǎng)基上，將浸有苦味酸溶液的無菌濾紙貼于培養(yǎng)皿的皿蓋上，用封口膜將培養(yǎng)皿封住，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，以涂布未接種的培養(yǎng)液作為空白對照組[18]。通過觀察空白組與試驗組之間無菌濾紙顏色的變化來鑒定菌株是否具有產(chǎn)HCN的能力。

1.2.6 固氮能力的鑒定

將過夜活化的菌株LB液體培養(yǎng)基點接至無氮固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株能否在培養(yǎng)基上存活生長，若能，則證明該菌具有固氮能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DS-3的鑒定

菌株在培養(yǎng)基上形成的菌落為邊緣整齊的圓形，表面濕潤，有光澤，不透明，顏色為淺黃色。生理生化測定結(jié)果顯示菌株DS-3為革蘭氏陰性菌（G-）。KOH、接觸酶、需氧性、氧化酶和卵磷脂酶試驗均為陽性，淀粉水解、吲哚、伏普、纖維素分解及甲基紅試驗均為陰性。

菌株DS-3的16S rRNA基因擴(kuò)增條帶經(jīng)電泳鑒定，大小正確，約為1 600 bp。將測序所得序列在NCBI和EzBioCloud 2個數(shù)據(jù)庫中比對，比對結(jié)果顯示菌株DS-3 與菌株P(guān)seudomonas corrugata的同源性達(dá)到99.37%。經(jīng)MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖1可知，菌株DS-3與模式菌株P(guān). corrugata處于同一分支上，其自展值為94%，說明菌株DS-3為P. corrugata的另外一種亞種，與系統(tǒng)發(fā)育樹中這2種菌株不完全相同。結(jié)合該菌株表現(xiàn)出的形態(tài)特征和生理生化試驗結(jié)果，將其鑒定為P. corrugata。

2.2 菌株的促生能力

2.2.1 解磷能力

在有機(jī)磷平板上點接菌液培養(yǎng)72 h后，由圖2-A可知，在菌株DS-3的菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈，說明該菌株具有溶解有機(jī)磷的能力。對該菌株的解磷能力進(jìn)行定量檢測，菌株在液體解磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，解磷率為40.2%。由此可見，該菌株對土壤中的有機(jī)磷能發(fā)揮一定的解磷能力。

2.2.2 產(chǎn)IAA能力

采用Salkowski比色法對菌株產(chǎn)IAA能力進(jìn)行定性定量分析，由圖2-B可知，該菌株可使反應(yīng)液變紅，可見該菌株在生長過程中可分泌IAA。定量結(jié)果表明，該菌株在培養(yǎng)72 h后，IAA的分泌量為18.77 mg/L，可見菌株DS-3具有較強(qiáng)分泌IAA的能力，可能會對潞黨參根部的生長起促生調(diào)節(jié)作用。

2.2.3 產(chǎn)鐵載體能力的鑒定

在CAS平板上點接菌株DS-3靜置培養(yǎng)72 h后，菌落周圍出現(xiàn)明顯的橙色暈圈（圖3-A），說明該菌株可合成并向外界環(huán)境中分泌鐵載體，這有利于菌株處于低鐵條件時從外界有效獲取Fe2+。由圖3-B可知，培養(yǎng)24 h后，上清液中的鐵載體相對含量可達(dá)68%，且在菌株DS-3培養(yǎng)12 h前，鐵載體的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時間的延長不斷積累，培養(yǎng)12 h后，其產(chǎn)量進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)?？梢娫摼昃哂休^強(qiáng)的分泌鐵載體能力。

2.2.4 固氮能力的鑒定

土壤中的氮通常約95%都是以有機(jī)氮的形式存在，不能被植物直接利用[20]。具有固氮能力的細(xì)菌能夠?qū)⒖諝庵械牡獨膺€原為可被植物直接吸收利用的銨態(tài)氮，從而對植物生長起到促進(jìn)作用[21-22]。將菌株DS-3接種于不含氮源的無氮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d后，在培養(yǎng)基上可見明顯的菌落（圖4-A），可見該菌株可以固定大氣中的氮源，具備固氮能力，提升土壤中植物可利用的氮含量，從而發(fā)揮促生作用。

2.2.5 產(chǎn)HCN能力的鑒定

HCN能夠通過阻斷電子傳遞，干擾需氧呼吸作用，從而抑制病原微生物的正常生長[19]。由圖4-B可以看出，接種菌株DS-3的培養(yǎng)皿中，蘸有苦味酸的濾紙由黃色變?yōu)闇\棕色，說明菌株DS-3能夠利用甘氨酸作為底物，將其氧化生成HCN。因此，菌株DS-3可通過生成HCN來拮抗黨參根際的病原微生物。

3 結(jié)論與討論

目前，從不同種類植物中分離出的內(nèi)生細(xì)菌種類豐富，已被研究報道的有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Eterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、不動桿菌屬（Acinotobacter）等[23]。這些菌屬通常也會存在于植物根際土壤中，因此，有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌可能是植物根際棲息細(xì)菌的一個亞種群[24]。植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting bacteria，簡稱PGPB）主要源自內(nèi)生細(xì)菌與根際土壤細(xì)菌，但二者之間的主要區(qū)別是內(nèi)生的PGPB，一旦它們在植物組織中共生，便不會受到外界土壤環(huán)境變化（溫度、pH值、含水量等）的影響，但是這些變化卻會影響根際PGPB的功能、增殖以及與寄主植物的結(jié)合等[25]。因此，可推斷內(nèi)生的PGPB對宿主植物的促生作用更為穩(wěn)定。

本研究從藥用植物潞黨參根部篩選得到的內(nèi)生促生細(xì)菌DS-3，經(jīng)菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因等進(jìn)行鑒定后，鑒定結(jié)果為P. corrugata。結(jié)合已有文獻(xiàn)報道，內(nèi)生的PGPB不僅能夠促進(jìn)宿主植物生長，提高宿主植物的抗逆性，還能夠使宿主植物對競爭植物產(chǎn)生化感作用[26]。因此本研究對菌株DS-3的促生特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，該菌株具有溶磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)HCN以及固氮多種促生能力。其中菌株的溶磷與固氮能力能夠直接幫助植株攝取營養(yǎng)物質(zhì)，菌株分泌的IAA可以直接調(diào)節(jié)植物的生長，因此這些機(jī)制被認(rèn)為是菌株對植株的直接促生作用;而通過分泌鐵載體與病原微生物競爭有限的鐵離子，及通過產(chǎn)生HCN阻斷病原微生物的需氧呼吸，從而對病原微生物產(chǎn)生拮抗作用而有利于植株生長的促生機(jī)制被認(rèn)為是對植株的間接促生作用[23]。因此可推斷菌株P(guān). corrugate DS-3可對潞黨參發(fā)揮直接與間接促生作用，可作為后續(xù)開發(fā)微生物菌肥的優(yōu)良菌株。Shidore等將水稻根系滲出液作用于其內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌基因組中與根際競爭作用相關(guān)的基因出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，并對相關(guān)功能基因進(jìn)行了誘導(dǎo)突變，該研究結(jié)果推斷植物根系分泌物可以誘導(dǎo)內(nèi)生細(xì)菌的定殖[27]。綜合課題組前期對潞黨參根際促生細(xì)菌的分離篩選工作，發(fā)現(xiàn)目前篩選得到的潞黨參根部內(nèi)生細(xì)菌與根際土壤細(xì)菌多為假單胞菌屬。因此，后續(xù)的研究工作一方面將菌株P(guān). corrugate DS-3接種于潞黨參幼苗，對其接種效應(yīng)進(jìn)行研究，另一方面可探究潞黨參根系分泌物對菌株P(guān). corrugate DS-3及前期分離的其他假單胞菌株在潞黨參根部及根際定殖的誘導(dǎo)效應(yīng)，為開發(fā)適用于黨參人工種植的微生物菌肥提供研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊鵬飛，楚世峰，陳乃宏. 黨參的藥理學(xué)研究進(jìn)展及其抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，35（12）：5-10.

[2]盧燕林，張 強(qiáng)，李彩萍，等. 地道潞黨參營養(yǎng)特性與產(chǎn)地土壤特征研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（5）：42-45.

[3]Alami M M，Xue J Q，Ma Y T，et al. Structure，function，diversity，and composition of fungal communities in rhizospheric soil of Coptis chinensis Franch under a successive cropping system[J]. Plants，2020，9（2）：244.

[4]王玲玲，韓京龍，李 巖，等. 人參土壤養(yǎng)分含量變化與改良效果研究[J]. 人參研究，2015，27（03）：18-21.

[5]Botelho G R，Cristina M H L. Fluorescent pseudomonads associated with the rhizosphere of crops an overview[J]. Brazilian Journal of Microbiology，2006，37（4）：401-416.

[6]Christina A，Christapher V，Bhore S J. Endophytic bacteria as a source of novel antibiotics：an overview[J]. Pharmacognosy Reviews，2013，7（13）：11-16.

[7]Staniek A，Woerdenbag H J，Kayser O. Endophytes：exploiting biodiversity for the improvement of natural product-based drug discovery[J]. Journal of Plant Interactions，2008，3（2）：75-93.

[8]Afzal I，Shinwari Z K，Sikandar S，et al. Plant beneficial endophytic bacteria：mechanisms，diversity，host range and genetic determinants[J]. Microbiological Research，2019，221：36-49.

[9]Gupta G，Panwar J，Jha P N. Natural occurrence of Pseudomonas aeruginosa，a dominant cultivable diazotrophic endophytic bacterium colonizing Pennisetum glaucum （L.） R. Br. [J]. Applied Soil Ecology，2013，64：252-261.

[10]Phetcharat P，Duangpaeng A. Screening of endophytic bacteria from organic rice tissue for indole acetic acid production[J]. Procedia Engineering，2012，32：177-183.

[11]Sheoran N，Nadakkakath A V，Munjal V，et al. Genetic analysis of plant endophytic Pseudomonas putida BP25 and chemo-profiling of its antimicrobial volatile organic compounds[J]. Microbiological Research，2015，173：66-78.

[12]Chebotar V，Malfanova N V，Shcherbakov A V，et al. Endophytic bacteria in microbial preparations that improve plant development （review）[J]. Appllied Biochemistry and Microbiology，2015，51（6）：732.

[13]張 燁，廖 怡，陳尚武，等. 文冠果一、二年省植株根系內(nèi)生菌的分離、鑒定和固氮活性[J]. 植物生態(tài)學(xué)報，2010，34（7）：839-844.

[14]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[15]晉婷婷，任嘉紅，劉瑞祥. 南方紅豆杉根際解有機(jī)磷細(xì)菌的鑒定及其解磷特性和促生作用研究[J]. 西北植物學(xué)報，2016，36（9）：1819-1827.

[16]Glickmann E，Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（2）：793-796.

[17]Schwyn B，Nielands J B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. Analytical Biochemistry，1987，160：47-56.

[18]陳慶河，翁啟勇，何玉仙，等. 大白菜健、病株根際細(xì)菌熒光反應(yīng)及產(chǎn)HCN能力比較研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，1998，13（2）：30-32.

[19]Neerincx A H，Mandon J，Ingen J V，et al. Real-time monitoring of hydrogen cyanide （HCN） and ammonia （NH3） emitted by Pseudomonas aeruginosa [J]. Journal of Breath Research，2015，9（2）：27102.

[20]吳 凡，張 楠，張莎莎，等. 桑樹根際固氮細(xì)菌的分離鑒定及固氮酶活力測定[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2008，34（3）：387-392.

[21]鄭紅麗，李少紅，樊明壽，等. 四種牧草根際固氮細(xì)菌的分離及固氮活性的研究[J]. 干旱區(qū)資源與環(huán)境，2007，21（4）：164-169.

[22]林標(biāo)聲，陳 意，羅茂春，等. 巨菌草內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性與固氮能力[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（24）：258-261.

[23]Santoyo G，Moreno-Hagelsieb G，Orozco-Mosqueda M D C，et al. Plant growth-promoting bacterial endophytes[J]. Microbiological Research，2016，183：92-99.

[24]Marquez-Santacruz H A，Hernández-León R，Orozco-Mosqueda M D C，et al. Diversity of bacterial endophytes in roots of Mexican husk tomato plants （Physalis ixocarpa） and their detection in the rhizosphere[J]. Genetics and Molecular Research，2010，9（4）：2372-2380.

[25]Glick B R. Plant growth-promoting bacteria：mechanisms and applications[J]. Scientifica，2012：963401.

[26]Cipollini D，Rigsby C M，Barto E K. Microbes as targets and mediators of allelopathy in plants[J]. Journal of Chemical Ecology，2012，38：714-727.

[27]Shidore T，Dinse T，hrlein J，et al. Transcriptomic analysis of responses to exudates reveal genes required for rhizosphere competence of the endophyte Azoarcus sp. strain BH72[J]. Environmental Microbiology，2012，14（10）：2775-2787.