薄芝糖肽對人角質(zhì)細(xì)胞增殖和黏附功能的影響及其治療銀屑病的機(jī)制

馬振卉,呂淑蓮,田亞萍

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，吉林 長春130021；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院皮膚科，山東 臨沂

276000；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六四醫(yī)院南湖院區(qū)皮膚科，吉林 長春130021）

銀屑病為免疫相關(guān)的炎癥性皮膚病，目前認(rèn)為由多基因遺傳調(diào)控、環(huán)境因素刺激和免疫機(jī)制介導(dǎo)等共同作用所致，頑固、反復(fù)且遷延難愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］，全球患病率為0.09%～5.10%［2］，我國近20年銀屑病患病率由0.123%升至0.470%［3］，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢［4-5］。人角質(zhì)細(xì)胞（keratinocyte，KC）異常增殖和細(xì)胞免疫系統(tǒng)異常是銀屑病的特征性表現(xiàn)，活化T細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）、白細(xì)胞介素23（interleukin-23，IL-23）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［6-7］等細(xì)胞因子促進(jìn)KC增殖、棘層增厚和炎癥細(xì)胞浸潤；過度增殖的KC又通過自分泌和旁分泌方式釋放白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）和IFN-γ等細(xì)胞因子產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，增強(qiáng)T細(xì)胞活化［8-11］，從而誘發(fā)和加重銀屑病的病理改變。KC增殖分化過程由細(xì)胞間黏連變化控制。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是細(xì)胞間黏附結(jié)構(gòu)的重要組成部分，通過與細(xì)胞骨架的相互作用，協(xié)助細(xì)胞對細(xì)胞外的信號和影響作出反應(yīng)，還能在細(xì)胞核內(nèi)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的角色，啟動促使細(xì)胞分裂的基因［12］。在正常分化的成熟細(xì)胞中，β-catenin大部分位于細(xì)胞膜，在胞漿少量表達(dá)，但不在細(xì)胞核表達(dá)，不參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［13］。

薄芝糖肽具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能，能促進(jìn)免疫細(xì)胞DNA合成，對機(jī)體非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫等均具有調(diào)節(jié)作用［14］，可用于白癜風(fēng)、局限性硬皮病、紅斑狼瘡、斑禿和腎小球腎炎等自身免疫性疾病的治療。臨床試驗研究［15-17］顯示：薄芝糖肽能夠明顯降低大面積尋常型銀屑病患者血清TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-22、IFN-γ、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和可溶性細(xì)胞間黏附分子1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）等 炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，抑制血管新生。近年來薄芝糖肽治療銀屑病取得較好效果，可以聯(lián)合迪銀片、炎琥寧、復(fù)方甘草酸單胺S和藥用菌多糖等藥物及UVB物理療法，治療銀屑病的有效率均高于對照組，具有良好的臨床療效及安全性。本研究探討了薄芝糖肽注射液對人KC增殖和β-catenin表達(dá)的影響，為揭示薄芝糖肽治療銀屑病的作用機(jī)制提供初步的分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）由本實驗室凍存。薄芝糖肽注射液（北京賽升藥業(yè)股份有限公司，每支2 mL，含5 mg多糖和1 mg多肽）。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)astKing RT Kit和SuperReal PreMix Plus（北京天根生化科技有限公司），兔抗人β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG（北京Biosharp公司）。CO2培養(yǎng)箱、低速離心機(jī)和PCR擴(kuò)增儀（美國Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 CCK-8法檢測各組HaCaT細(xì)胞增殖率HaCaT細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3×103個細(xì)胞，設(shè)5復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，檢測細(xì)胞貼壁情況。細(xì)胞分為對照組和以1.5 g·L－1為初始濃度進(jìn)行2倍比稀釋的不同濃度（0.011 719、0.023 438、0.046 875、0.093 750、0.187 500、0.375 000、0.750 000、1.500 000 g·L－1）薄芝糖肽組，同時設(shè)空白組，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，將每孔中培養(yǎng)液吸出，加入100μL新鮮培養(yǎng)液，再向每孔加入10μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處吸光度（A）值，實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。根據(jù)上述實驗得到抑制細(xì)胞增殖有效濃度區(qū)間，再次以2倍比稀釋薄芝糖肽注射液，重復(fù)上述方法，孵育HaCaT細(xì)胞24和48 h，計算各組細(xì)胞增殖率。

1.3 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平HaCaT細(xì)胞分為對照組（不加薄芝糖肽注射液處理）和10及20 mg·L－1薄芝糖肽組，以2.74×105個接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿，分別加入0、10、20 mg·L－1薄芝糖肽注射液培養(yǎng)24和48 h，取1 mL細(xì)胞懸液加入TRIzol裂解液，提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。按照cDNA合成試劑盒進(jìn)行實驗操作。分別配制DNA去除反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于后續(xù)實驗，－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。每組設(shè)3復(fù)孔，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃、15 min；95℃、10 s，56℃、20 s，72℃、30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)實時結(jié)果Ct值，采用2－ΔΔCt法計算β-catenin mRNA表達(dá)水平。ΔΔCt=目的基因ΔCt值－內(nèi)參基因ΔCt值。PCR引物由金唯智（蘇州）生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1PCR primer sequences

1.4Western blotting法檢測各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平HaCaT細(xì)胞分為對照組和10及20 mg·L－1薄芝糖肽組，以2.74×105個接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h貼壁后，分別加入0、10和20 mg·L－1薄芝糖肽注射液培養(yǎng)細(xì)胞24和48 h，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，加入200μL RIPA細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，按照BCA法定量蛋白濃度，取30μg蛋白上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉；加入一抗稀釋液，過夜孵育；加入二抗，孵育1 h；取出后再次漂洗，配制ECL顯色液，將PVDF膜置于凝膠成像分析儀中采集圖像加以分析，采用Image J軟件對SDS-PAGE圖譜進(jìn)行蛋白灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，計算各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平。β-catenin蛋白表達(dá)水平=β-catenin蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組HaCaT細(xì)胞增殖率及細(xì)胞中β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HaCaT細(xì)胞增殖率與對照組比較，不同濃度薄芝糖肽組HaCaT細(xì)胞增殖率均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），0.011 719～0.093 750 g·L－1薄芝糖肽組降低更明顯（P＜0.01）（表2）。在此濃度范圍內(nèi)將細(xì)胞分為對照組和不同濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg·L－1）薄芝糖肽組，各組 分 別 孵育24和48 h后，與對照組比較，不同濃度薄芝糖肽組HaCaT細(xì)胞增殖率均不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01），且在48 h時20 mg·L－1薄芝糖肽組細(xì)胞增殖率降低最明顯（P＜0.01）（表3）。因此后續(xù)實驗選取濃度為10和20 mg·L－1薄芝糖肽注射液處理細(xì)胞24和48 h。

表2 各組HaCaT細(xì)胞增殖率Tab.2Proliferation rates of HaCaT cells in various groups（n＝5，x±s，η/%）

表3 作用不同時間后各組HaCaT細(xì)胞增殖率Tab.3Proliferation rates of HaCaT cells in various groups after treated for different timen＝5,±s，η/%）

表3 作用不同時間后各組HaCaT細(xì)胞增殖率Tab.3Proliferation rates of HaCaT cells in various groups after treated for different timen＝5,±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control Bozhiglycopeptide(mg?L－1)0.625 1.250 2.500 5.000 10.000 20.000 40.000 80.000 Proliferation rate(t/h） 24 100.00±0.22 93.81±0.06 90.58±0.12**90.01±0.22**87.83±0.19**85.61±0.33**87.44±0.17**88.82±0.25**85.64±0.29**48 100.00±0.19 96.71±0.17 84.48±0.24*85.67±0.21*90.15±0.19 82.69±0.37*77.01±0.26**91.34±0.41 91.04±0.25

2.2 各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin m RNA表達(dá)水平與對照組比較，作用24和48 h時10和20 mg·L－1薄芝糖肽組HaCaT細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 作用不同時間后各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平Tab.4Expression levels ofβ-catenin mRNA in HaCaT cells in various groups after treated for different time (n=3，±s）

表4 作用不同時間后各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平Tab.4Expression levels ofβ-catenin mRNA in HaCaT cells in various groups after treated for different time (n=3，±s）

*P＜0.01 compared with control group.

Group Control Bozhiglycopeptide（mg·L－1）10 20 β-catenin mRNA（t/h）24 0.953±0.077 0.684±0.067*0.624±0.078*48 1.156±0.678 0.504±0.055*0.483±0.052*

2.3 各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平與對照組比較，24 h時10 mg?L－1薄芝糖肽組細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；48 h時10和20 mg?L－1薄芝糖肽組細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平有升高的趨勢，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5和圖1。

表5 作用不同時間后各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平Tab.5Expression levels ofβ-catenin protein in HaCaT cells in various groups after treated for different time (n=3，±s）

表5 作用不同時間后各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平Tab.5Expression levels ofβ-catenin protein in HaCaT cells in various groups after treated for different time (n=3，±s）

*P＜0.01 compared with control group.

Group Control Bozhi glycopeptide(mg?L－1)10 20 β-catenin protein（t/h）24 0.314±0.026 0.162±0.039*0.383±0.054 48 0.332±0.037 0.495±0.128 0.568±0.321

圖1 各組HaCaT細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1Electrophoregram of expressions ofβ-catenin in HaCaT cells in various groups

3 討 論

銀屑病是一種由免疫介導(dǎo)的表皮KC過度增殖和分化異常的炎癥性皮膚病［18］，分化異常與細(xì)胞間的黏附連接結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。β-catenin作為一種連接黏附蛋白和肌動蛋白的細(xì)胞骨架蛋白，不僅能夠控制細(xì)胞間黏附，也通過與細(xì)胞骨架的相互作用介導(dǎo)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［19］。β-catenin在過量表達(dá)的情況下能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動細(xì)胞增殖及分化的靶基因轉(zhuǎn)錄及相關(guān)蛋白表達(dá)，參與調(diào)控表皮干細(xì)胞的增殖和分化［20］。研究［21］顯示：當(dāng)β-catenin異常表達(dá)時，與KC分化相關(guān)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶1（transglutaminase 1，TGase1）表達(dá)異常，因此β-catenin很可能參與KC的過度增殖和分化。

HaCaT細(xì)胞是人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，與KC具有相似的增殖和分化特性，且具有永生性，與銀屑病KC過度增殖和異常分化的病理特征具有相似性［1］。本研究結(jié)果顯示：薄芝糖肽注射液對HaCaT細(xì)胞增殖的影響為雙相作用，在24和48 h作用時間內(nèi)，低濃度薄芝糖肽抑制HaCaT細(xì)胞增殖，高濃度薄芝糖肽則失去抑制作用。本研究結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報道相似，孫鈺［22］曾應(yīng)用CCK-8法比較IL-6、IL-22和TNF-α單細(xì)胞因子作用組和細(xì)胞因子與薄芝糖肽共同作用組HaCaT細(xì)胞增殖率，結(jié)果顯示：2組HaCaT細(xì)胞均發(fā)生增殖，但細(xì)胞因子與薄芝糖肽共同作用組細(xì)胞增殖率下降，隨著濃度和作用時間增加，增殖率略微上升，開始出現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖現(xiàn)象。由于薄芝糖肽成分復(fù)雜，包含有多糖和多肽，該結(jié)果是否與薄芝糖肽中一些成分可能有調(diào)節(jié)、促增殖等作用及薄芝糖肽藥理作用多樣、藥物濃度和作用時間有關(guān)，仍需繼續(xù)研究。

β-catenin是一種細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的成分，又是Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄因子。Wnt/β-catenin信號通路具有調(diào)節(jié)生長、發(fā)育、代謝和干細(xì)胞維持等多種生物學(xué)功能［3］。Wnt信號通過β-catenin調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞的增殖及分化，銀屑病患者皮損中β-catenin表達(dá)增加，提示β-catenin可能通過影響細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架和促進(jìn)血管生成等方式，使細(xì)胞過度增殖，參與銀屑病的發(fā)病過程［23-24］。最近研究［25-27］表明：一些基因和微小RNA均可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路來影響銀屑病的發(fā)生，如miR-205-5p可通過靶向β-catenin蛋白失活來抑制銀屑病發(fā)展；而wif-1基因則可以通過阻斷β-catenin的表達(dá)來抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示：10和20 mg·L－1薄芝糖肽注射液分別處理HaCaT細(xì)胞24和48 h后，與對照組比較，在24 h時HaCaT細(xì)胞中β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，在48 h時HaCaT細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平降低更明顯，但蛋白表達(dá)水平有增高趨勢，因此推測薄芝糖肽在一定的有效濃度區(qū)間和作用時間內(nèi)，可以通過降低β-catenin表達(dá)抑制KC黏附功能，超過該范圍，薄芝糖肽雖仍抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄，但蛋白表達(dá)水平卻有所增高，該過程可能有細(xì)胞內(nèi)其他調(diào)節(jié)因子的參與，其具體機(jī)制仍需繼續(xù)探究。

綜上所述，低濃度的薄芝糖肽注射液可對KC異常增殖和黏附功能起到抑制作用，進(jìn)一步研究薄芝糖肽的有效作用濃度及時間將為應(yīng)用薄芝糖肽治療銀屑病奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。