醇脫氫酶催化合成(S)-哌啶醇及產(chǎn)物抑制機(jī)制

吳彥霏 ， 許國超 ， 周婕妤 ， 倪 曄 *

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫214122）

大量的天然和非天然生物活性物質(zhì)分子中具有一個(gè)或多個(gè)哌啶環(huán)，包括許多市售的活性藥物成分[1-2]。 手性哌啶醇及其衍生物是制藥工業(yè)中重要的中間體，比如（S）-N-Boc-3-羥基哌啶（（S）-NBHP）是合成依魯替尼藥物的關(guān)鍵手性中間體，其市售品名為Imbruvica，是一種靶向B 細(xì)胞的抗癌藥物[3-5]。依魯替尼已于2013 年獲得美國食品和藥物管理局的批準(zhǔn)用于治療套細(xì)胞淋巴瘤， 分別于2014 年和2015 年獲得批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤[6]。 目前手性哌啶醇主要是通過化學(xué)方法將原料通過多步轉(zhuǎn)化制備而得，產(chǎn)率和產(chǎn)品純度不理想[7]。 最近，酮還原酶（KRED）催化N-Boc-3-哌啶酮（NBPO）的不對稱還原反應(yīng)在手性哌啶醇的合成中顯示出良好的性能。2014 年通過商業(yè)KRED 實(shí)現(xiàn)100 g/L NBPO 的生物轉(zhuǎn)化， 首開醇脫氫酶合成（S）-NBHP 的先河[8]。 然而，本篇研究中所采用的KRED 及其后報(bào)道的醇脫氫酶均具有一定程度的底物抑制和產(chǎn)物抑制，且反應(yīng)需要添加昂貴的輔酶，不利于高濃度條件下實(shí)現(xiàn)酶法規(guī)模化制備（S）-NBHP。 因此，篩選具有良好催化性能的醇脫氫酶（或酮還原酶）對實(shí)現(xiàn)高效酶法制備（S）-NBHP具有重要意義。

作者對本實(shí)驗(yàn)室保存的還原酶庫進(jìn)行了篩選，旨在獲得對NBPO 具有優(yōu)良催化性能的還原酶。 該酶庫中的還原酶具有20%~50%的氨基酸序列同源性，并能夠催化還原多種酮類物質(zhì)。 研究發(fā)現(xiàn)，來源Kluyveromyces polyspora的醇脫氫酶KpADH 顯示出較大的潛力，適用于酶法不對稱合成（S）-NBHP?；趯Σ煌磻?yīng)體系的研究，解釋了產(chǎn)物抑制的主要因素，并通過不添加任何助溶劑的單水相體系解除了產(chǎn)物抑制的影響， 實(shí)現(xiàn)了無需額外添加輔酶NADPH 的條件下（S）-NBHP 的高效和綠色合成。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

輔酶NADPH （還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）、NADP+（氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）、NADH（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、NAD+（氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）等：購于深圳邦泰生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、β-巰基乙醇、TEMED、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素（Kan）等：購于上海捷瑞生物工程有限公司；N-Boc-3-羥基哌啶： 購于上海麥克林生物公司；N-Boc-3-哌啶酮： 購于上海皓伯化工有限公司。

1.2 菌株

所有質(zhì)粒均保存于江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物催化與酶工程實(shí)驗(yàn)室還原酶文庫， 并在Escherichia. coliBL21（DE3）中表達(dá)。

1.3 高通量活力測定方法

以NBPO 作為底物，在30 ℃下測定340 nm 處NAD（P）H 吸光度的變化，計(jì)算比活力。200 μL 活力測定體系包括：10 μL 粗酶液 （適當(dāng)稀釋倍數(shù)），10 μL NBPO（溶于乙醇，終濃度為 5 mmol/L），10 μL NAD（P）H（終濃度為 1 mmol/L）和 170 μL 磷酸緩沖液 （100 mmol/L，pH 7.0）。 一個(gè)酶活力單位（U） 定義為在上述條件下每分鐘氧化1 μmol NAD（P）H 所需的酶量。

1.4 分析方法

反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取， 無水硫酸鈉干燥，并通過真空蒸發(fā)器揮發(fā)乙酸乙酯。 采用高效液相色譜法（HPLC）分析立體選擇性及轉(zhuǎn)化率。立體選擇性分析采用 Superchiral S-AY 柱 （4.6 mm×150 mm，Shanghai Chiralway Biotech Co.Ltd）測定，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)95%的正己烷和體積分?jǐn)?shù)5%的乙醇。轉(zhuǎn)化率分析使用 C18 柱 （4.6 mm×250 mm，Diamonsil，Shanghai DIKMA Co. Ltd），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)55%的乙腈和體積分?jǐn)?shù)45%的水。 檢測器波長均為210 nm，柱溫為 30 ℃。

1.5 蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化

將含有KpADH 重組質(zhì)粒的大腸桿菌接種到LB 培養(yǎng)基中，并加入 50 μg/mL 的卡那霉素（Kan），在 37 ℃和 180 r/min 下振蕩培養(yǎng)。 當(dāng) OD600達(dá)到0.8時(shí)， 加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG，0.2 mol/L）至終濃度0.2 mmol/L，并將溫度降低至25 ℃誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。 培養(yǎng)結(jié)束，通過離心收集細(xì)胞并在PBS 緩沖液（pH 7.4）中進(jìn)行超聲破碎。 將細(xì)胞裂解液以8 000 r/min 離心30 min。 最后，通過親和色譜法純化細(xì)胞裂解液，并通過SDS-PAGE 分析。

1.6 半衰期的測定

將KpADH 的純酶液稀釋至1 mg/mL 左右，取稀釋的酶液1 mL 放入30 ℃恒溫水浴鍋中保溫，定時(shí)取樣并采用上述1.3 的測活方法。 以0 h 的活力為100%，依次測定比活力隨時(shí)間變化的曲線，活力下降到50%的時(shí)間為該蛋白質(zhì)在30 ℃的半衰期。

1.7 產(chǎn)物抑制動(dòng)力學(xué)測定

采用純酶液測定KpADH 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)， 使用上述1.3 的測活方法， 測定不同濃度底物 （0.5~50 mmol/L） 和產(chǎn)物 （0~100 mmol/L） 的比活力， 使用Origin 軟件分別進(jìn)行非線性回歸（nonlinear regression）擬合。 擬合方程包括：米氏方程、競爭性抑制方程、非競爭性抑制方程、反競爭性抑制方程、混合性抑制方程；并獲得參數(shù)抑制常數(shù)Ki、米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率Vmax，采用Origin 評估擬合結(jié)果并通過MatLab 軟件作圖。 以上所有數(shù)據(jù)均獨(dú)立測定3 次。

1.8 酶促不對稱合成反應(yīng)的條件優(yōu)化

反應(yīng)在20 mL 的磁力攪拌夾套反應(yīng)器中進(jìn)行，將1 g 底物、1.2 g 葡萄糖、20 mg 葡萄糖脫氫酶凍干酶粉、35 mgKpADH 凍干酶粉及不同助溶劑分別加入10 mL 反應(yīng)體系中，30 ℃恒溫條件下反應(yīng)， 并采用自動(dòng)滴定儀滴定1 mol/L Na2CO3， 使pH 維持在7.0。 反應(yīng)進(jìn)程中定點(diǎn)取樣，通過液相色譜分析獲得轉(zhuǎn)化率及終產(chǎn)物的對映體過量值（e.e.值）。

1.9 底物及產(chǎn)物分配系數(shù)的測定

準(zhǔn)確配制 1 mol/L 的 NBPO 及 NBHP，取 20 μL加入 480 μL 緩沖液中，再按照體積比 1∶1 加入有機(jī)溶劑，吸取 200 μL 水相，加入 400 μL 乙酸乙酯萃取并烘干，通過液相色譜分別計(jì)算出底物及產(chǎn)物的濃度。 分配系數(shù)等于底物NBPO 和產(chǎn)物NBHP 分別在有機(jī)相和水相濃度的分配比。 每個(gè)樣品分別做3個(gè)平行。

1.10 有機(jī)溶劑耐受性的測定

將純化的KpADH 酶液 （保持蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1 mg/mL 左右）與有機(jī)溶劑按體積比1∶1 混合，在30 ℃和1 000 r/min 條件下振蕩并保溫12 h， 吸取水相中的酶液采用1.3 的測活方法， 進(jìn)行殘余活力的測定。

1.11 克級制備（S）-NBHP

反應(yīng)在20 mL 的磁力攪拌夾套反應(yīng)器中進(jìn)行，將2 g 底物、2.4 g 葡萄糖、40 mg 葡萄糖脫氫酶凍干酶粉、70 mgKpADH 凍干酶粉分別加入10 mL 反應(yīng)體系中，30 ℃恒溫反應(yīng)，并采用自動(dòng)滴定儀滴定1 mol/L Na2CO3，使 pH 維持在 7.0。 反應(yīng)結(jié)束后，采用二氯甲烷將反應(yīng)液萃取3 次，收集萃取后的二氯甲烷，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)二氯甲烷，獲得產(chǎn)品（S）-NBHP。 采用 HPLC 分析產(chǎn)品的立體選擇性。

2 結(jié)果與討論

2.1 醇脫氫酶的篩選

對酶庫進(jìn)行有針對性的篩選是獲得新酶的有效途徑之一。 分別以NADPH 和NADH 為輔酶，以N-Boc-3-哌啶酮（NBPO）為底物，在 340 nm 對實(shí)驗(yàn)室保存的還原酶庫進(jìn)行高通量活力篩選。 通過篩選發(fā)現(xiàn)， 對 NBPO 具有還原活力的還原酶均為NADPH 依賴型。 進(jìn)一步對有活力的還原酶進(jìn)行立體選擇性分析，結(jié)果見表1。 經(jīng)過活力的篩選得到6種對NBPO 具有一定催化活力的還原酶，立體選擇性較高的有 4 種：KpADH、CgKR1、PAR、Cg26。 其中Cg26 的立體選擇性為R構(gòu)型，其余3 種為S構(gòu)型?？紤]到適用于大規(guī)模的酶法制備，一些商業(yè)參數(shù)指標(biāo)需要參考，例如生物催化劑載量，其決定反應(yīng)過程中酶制劑的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。 較高的比活力有利于生物催化劑在較低的載量下實(shí)現(xiàn)底物濃度載量上的生物轉(zhuǎn)化數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的生物催化過程[9]。 同時(shí)， 前期工作中獲得了KpADH 的晶體結(jié)構(gòu)并對KpADH 的立體選擇性機(jī)制做了深入的分析， 有利于后續(xù)的立體選擇性改造[10]。 從表1 來看，KpADH較高的比活力在大規(guī)模的制備中更具有明顯的優(yōu)勢。 所以， 選取來自Kluyveromyces polyspora的KpADH 為后續(xù)研究對象[11]。

表1 醇脫氫酶酶庫的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of alcoholdehydrogenases library

2.2 不同底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

具有應(yīng)用前景的生物催化反應(yīng)通常底物上載量應(yīng)大于100 g/L，故首先考察了KpADH 對高濃度NPBO 的耐受情況。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NBPO 為疏水性底物[12]。 因此，在10 mL 的反應(yīng)體系中加入5%的乙醇助溶，并加入相同的酶量（200 U）考察不同底物濃度對反應(yīng)的影響。 如圖1 所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)化率快速趨于穩(wěn)定。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?50 mmol/L時(shí)，反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，然而在底物濃度分別為500 mmol/L 和1 mol/L 時(shí)， 底物的轉(zhuǎn)化水平分別為390 mmol/L 和460 mmol/L。 底物濃度較高的兩個(gè)反應(yīng)都快速終止在400 mmol/L 的轉(zhuǎn)化水平，且延長反應(yīng)時(shí)間后轉(zhuǎn)化率并未得到改善。 測定30 ℃KpADH的半衰期為80 h，說明KpADH 的穩(wěn)定性良好。但在加入底物反應(yīng)1 h 左右， 反應(yīng)快速終止在400 mmol/L的轉(zhuǎn)化水平，說明反應(yīng)過程中較高的底物或產(chǎn)物濃度抑制了KpADH 合成產(chǎn)物（S）-NBHP。該現(xiàn)象與之前報(bào)道的YDR541C 在單水相催化中受到嚴(yán)重的抑制結(jié)果一致[13]，說明可能是產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的。 因此，作者考察不同濃度的產(chǎn)物對不對稱還原反應(yīng)的影響。

圖1 不同底物濃度的反應(yīng)轉(zhuǎn)化曲線Fig. 1 Reaction conversion curves at different substrate concentrations

2.3 不同產(chǎn)物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

在1 mL 反應(yīng)體系中加入相同酶量 （0.015 U）、相同的底物濃度（50 mmol/L NBPO）和不同的產(chǎn)物濃度（0~250 mmol/L NBPH），考察不同產(chǎn)物濃度對KpADH 催化還原NBPO 反應(yīng)的影響， 結(jié)果見圖2。隨著產(chǎn)物濃度的增加，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸降低，直到反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近3%， 說明產(chǎn)物抑制是影響NBPO轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

圖2 不同濃度產(chǎn)物對KpADH 催化NBPO 還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 2 Effect of different product concentrations on the bioreduction of NBPO catalyzed by KpADH

2.4 底物和產(chǎn)物抑制動(dòng)力學(xué)擬合分析

分別考察了不同濃度的底物和產(chǎn)物存在的條件下KpADH 比活力的變化， 并通過擬合獲得相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，見圖3。 經(jīng)過底物動(dòng)力學(xué)測定，在高濃度底物的條件下KpADH 的活力沒有明顯降低，Km值為 （17.4±1.1） mmol/L，Vmax值為 （88.3±2.2）μmol/（min·mg），未發(fā)現(xiàn)明顯底物抑制的現(xiàn)象。 在加入不同濃度的產(chǎn)物后，KpADH 的比活力呈現(xiàn)不同程度降低，見圖3（b）的擬合曲線。 通過抑制動(dòng)力學(xué)擬合分析和Origin 軟件評估擬合結(jié)果，非競爭抑制方程的擬合程度最高，R-Square 值高達(dá)0.98 （RSquare 越接近1，說明擬合程度越高）。 獲得抑制常數(shù)Ki值為（459.9±118.6） mmol/L，Km值為（9.9±1.0）mmol/L，Vmax值為（83.9±2.9） μmol/（min·mg）。 上述反應(yīng)體系中加入助溶劑乙醇以增加產(chǎn)物的水溶性，當(dāng)達(dá)到產(chǎn)物的抑制濃度后反應(yīng)受到抑制而進(jìn)入平臺期。

圖3 底物和產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)的擬合結(jié)果Fig. 3 Fitting results of the substrate and product kinetics

經(jīng)過擬合評估， 該抑制類型屬于非競爭性抑制。 這說明產(chǎn)物與酶的非活性部位相結(jié)合，形成產(chǎn)物和酶的絡(luò)合物后會(huì)進(jìn)一步再與底物結(jié)合；或者是酶與底物結(jié)合形成底物和酶絡(luò)合物后，部分再與產(chǎn)物結(jié)合。 雖然底物、抑制物（產(chǎn)物）和酶的結(jié)合無競爭性，但兩者與酶結(jié)合所形成的中間絡(luò)合物不能釋放產(chǎn)物，導(dǎo)致了酶催化的表觀反應(yīng)速率降低。

據(jù)報(bào)道，NADPH 依賴性的羰基還原酶YDR541C 在單水相反應(yīng)體系中進(jìn)行NBPO （100 ~400 mmol/L）的不對稱轉(zhuǎn)化，300 mmol/L 的 NBPO 可以在1 h 內(nèi)完全轉(zhuǎn)化， 由于產(chǎn)物抑制作用，400 mmol/L 的NBPO 轉(zhuǎn)化率僅為81.7%。 最終反應(yīng)停留在300 mmol/L 的轉(zhuǎn)化水平[13]。與還原酶PsCR 一樣，在單水相體系中將4-氯-3-氧代丁酸乙酯（COBE）不對稱催化還原為（S）-4-氯-3-羥基丁酸酯（（S）-CHBE），當(dāng)產(chǎn)物濃度達(dá)到120 mmol/L 時(shí)，反應(yīng)速度急劇下降[14]。作者通過動(dòng)力學(xué)擬合分析，當(dāng)達(dá)到抑制濃度400 mmol/L 時(shí)， 產(chǎn)物與底物非競爭性地結(jié)合KpADH 形成三元復(fù)合物， 使KpADH 構(gòu)象改變，不能進(jìn)一步釋放產(chǎn)物，導(dǎo)致酶活力下降。 這種非競爭性抑制作用不能通過增加底物濃度來解除抑制[15]。因此， 在不同的底物濃度下KpADH 的轉(zhuǎn)化水平停留在400 mmol/L。

2.5 單水相催化體系的探索

據(jù)報(bào)道，反應(yīng)體系中添加助溶劑可能影響產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性[16-17]。 由于KpADH 還原NBPO 的e.e.值為97%，因此通過溶劑的優(yōu)化可能提高終產(chǎn)物的立體選擇性和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。 作者針對單水相體系和水-有機(jī)兩相體系進(jìn)行了研究， 根據(jù)不同底物濃度的研究結(jié)果，固定500 mmol/L 的底物濃度，保持底物與酶添加量的質(zhì)量比（S/C）為18.2∶1的條件下，選擇不同的醇類助溶劑、有機(jī)溶劑以及綠色離子液體BMIN·PF6進(jìn)行體系的優(yōu)化[18-19]。

如表 2 所示，反應(yīng)體系 2、3、4 中分別加入體積分?jǐn)?shù)5%醇類助溶劑， 可以看出助溶劑雖然提高了反應(yīng)的初速率，但是反應(yīng)很快就在轉(zhuǎn)化率為60%左右時(shí)終止，這是產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的。 反應(yīng)5 中加入5%的乙酸丁酯，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.2%。由于乙酸丁酯的疏水性使得產(chǎn)物空間上與酶分離，因而轉(zhuǎn)化率得以提升， 但也限制了酶與剩余底物的充分接觸，最終使得反應(yīng)在24 h 的轉(zhuǎn)化率未達(dá)到99%以上。少量有機(jī)溶劑的添加對e.e.值沒有影響。 綜上，其中最佳的反應(yīng)體系為不加任何助溶劑的磷酸鹽緩沖液體系，在該體系中，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99%以上。

表2 KpADH 單相反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果Table 2 Optimization results of KpADH inmonoaqueous phase reaction system

2.6 兩相催化體系的探索

采用水-有機(jī)溶劑的兩相體系可實(shí)現(xiàn)底物與酶、產(chǎn)物與酶在空間上的相對分離，從而避免酶失活。 底物NBPO 是疏水性底物，略微溶于水，不利于與酶分子充分接觸。 此外，底物對酶分子有一定毒性，這也會(huì)導(dǎo)致酶分子的失活，因此嘗試兩相反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)油—水的界面反應(yīng)。 作者選取了具有不同lgP值的10 種有機(jī)溶劑進(jìn)行探究，分別測定了產(chǎn)物和底物在有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)以及有機(jī)溶劑對KpADH 催化活性的影響，結(jié)果見表3—4。最終選擇產(chǎn)物分配系數(shù)分別為3.6 和15.8 以及殘余活力分別為91%和5%的有機(jī)溶劑：甲苯和乙酸丁酯。 反應(yīng)體系6 和7 表明，50%有機(jī)溶劑的加入使e.e. 值提高至98.9%，這表明酶在有機(jī)溶劑中剛性增強(qiáng)，構(gòu)象更加穩(wěn)定[17]。但是，兩相反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化率均沒有達(dá)到99%的水平，且反應(yīng)速率較慢，說明大量的底物溶解在有機(jī)溶劑中減少了酶與其碰撞的機(jī)會(huì)，所以反應(yīng)速率下降，尤其是在反應(yīng)后期底物較少的情況下，無法與酶充分接觸，導(dǎo)致反應(yīng)不完全。

表3 有機(jī)溶劑對KpADH 活力的影響及產(chǎn)物和底物的分配系數(shù)Table 3 Effect of organic solvents on KpADH activity and partition coefficient of products and substrates

據(jù)報(bào)道，離子液體作為一種綠色溶劑可被用作為反應(yīng)介質(zhì)增強(qiáng)傳質(zhì)效率和提高酶的穩(wěn)定性[20-22]。因此， 選取常用的離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（BMIN·PF6）以及實(shí)驗(yàn)室合成的低共熔溶劑氯化膽堿∶尿素摩爾比為1∶2、氯化膽堿∶甘油摩爾比為 1∶1、 氯化膽堿∶葡萄糖摩爾比為 5∶2 來探索反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和對映選擇性。 然而，KpADH 在上述離子液體和低共熔溶劑（DES）中活力較低，僅觀察到較低的轉(zhuǎn)化率。

2.7 克級制備（S）-NBHP

從上述反應(yīng)體系優(yōu)化的結(jié)果可知，未加入任何助溶劑的反應(yīng)體系1 可在24 h 內(nèi)催化還原500 mmol/L NBPO，達(dá)到99.6%的轉(zhuǎn)化率，見圖4。說明在該反應(yīng)過程中，底物NBPO 逐漸溶解并完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物（S）-NBHP，且產(chǎn)物難溶于水相體系，避免了與酶的大量接觸，未對酶活產(chǎn)生顯著影響。 加入助溶劑后，反應(yīng)初速度加快，但增加了產(chǎn)物的溶解度，使之達(dá)到抑制濃度（459.9±118.6） mmol/L，所以反應(yīng)快速終止。 另外，與兩相體系相比，大量有機(jī)溶劑的加入可以略微提高產(chǎn)物的e.e.值，但轉(zhuǎn)化不完全會(huì)影響終產(chǎn)物的純度。 所以，不加任何助溶劑的磷酸鹽緩沖液體系更具備綠色、高效的生物催化制備條件。

圖4 KpADH 不對稱還原200 g/L NBHO 的反應(yīng)進(jìn)程Fig. 4 Conversion curve of the asymmetric reduction of NBPO by KpADH at 200 g/L

表4 兩相反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果Table 4 Optimization results of biphasic reaction system

因此，在反應(yīng)體系1 的基礎(chǔ)上保持底物與酶添加量的質(zhì)量比（S/C）為18.2 g/g 不變，逐漸增加底物的質(zhì)量濃度至 200 g/L（1 mol/L），最終反應(yīng) 12 h，可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物的e.e.值為97%，產(chǎn)品收率為77%。 與來源于釀酒酵母的羰基還原酶YDR541C催化合成（S）-NBHP 相比，KpADH 能夠在不加任何有機(jī)溶劑和外源輔酶的條件下實(shí)現(xiàn)較高濃度的轉(zhuǎn)化，表明KpADH 在酶法制備（S）-NBHP 上具有良好的應(yīng)用潛力[13]。

3 結(jié) 語

作者篩選和比較發(fā)現(xiàn)KpADH 可以高效還原NBPO 合成（S）-NBHP。 通過反應(yīng)體系的探索，發(fā)現(xiàn)在加入乙醇等助溶劑的反應(yīng)體系中有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)， 且高濃度的產(chǎn)物NBHP 對KpADH 催化性能影響顯著。 通過動(dòng)力學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)抑制類型為非競爭性抑制類型， 并計(jì)算獲得抑制常數(shù)Ki值為（459.92±118.59） mmol/L。 反應(yīng)體系優(yōu)化的結(jié)果說明，不添加任何助溶劑的體系能夠有效地避免產(chǎn)物抑制，同時(shí)也能使酶與底物充分接觸，反應(yīng)完全。 在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了200 g/L 底物的完全轉(zhuǎn)化， 克級制備獲得了（S）-NBHP。 作者初步探究了 NBHP 對醇脫氫酶的抑制機(jī)制，并優(yōu)化和建立了解決抑制問題的反應(yīng)體系，為實(shí)現(xiàn)（S）-NBHP 的大規(guī)模酶法合成奠定了良好的研究基礎(chǔ)。