釀酒酵母XM2-9 流加發(fā)酵生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸

吳 江 ， 洪文榮 ， 蘇 敏 ， 洪曉明

（1. AUCH International Trading Pty Ltd，Sydney，NSW2000，Australia； 2. 莆田學(xué)院， 福建 莆田 351100；3. 重慶能源學(xué)院醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)研究中心，重慶 402260）

甲基硒代半胱氨酸 （Se-methylselenocysteine SeMCys）是一種天然含硒的氨基酸。 它是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的第21 種氨基酸硒代半胱氨酸的甲基化衍生物[1]。 作為第三代的有機(jī)硒化合物，甲基硒代半胱氨酸比硒酵母、硒代蛋氨酸和其他硒代氨基酸具有更好的生物利用度，更強(qiáng)的抗氧化作用[2]，以及更強(qiáng)的抗衰老和抗癌生物活性等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。 美國(guó)FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)了用甲基硒代半胱氨酸作為抗腫瘤化療試劑進(jìn)行動(dòng)物和臨床試驗(yàn)[5]。 試驗(yàn)結(jié)果表明，甲基硒代半胱氨酸比其他硒化合物在化療輔助治療方面效果更好，同時(shí)能更有效消除化療帶來(lái)的毒性[6]。 目前的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，化療時(shí)結(jié)合甲基硒代半胱氨酸治療能顯著提高腫瘤細(xì)胞的殺死率[7]。 在中國(guó)，甲基硒代半胱氨酸已于2009 年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新型營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[8]，并開始廣泛應(yīng)用于食品和保健品等方面。

甲基硒代半胱氨酸最早從植物中分離得到，生長(zhǎng)在富硒地區(qū)的植物具有積聚甲基硒代半胱氨酸的能力，例如大蒜、洋蔥、青花菜[9]、豆科植物[10]、野生的韭菜[11]等植物。 富硒大蒜在提高免疫功能和預(yù)防癌癥方面有一定的效果，將在含硒培養(yǎng)液中培養(yǎng)的大蒜通過HPLC-ICP-MS 分析， 可檢測(cè)到其中含有甲基硒代半胱氨酸[12]。1987 年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)了用硒酵母作為無(wú)機(jī)硒替代物用于動(dòng)物飼料添加劑以及保健品[13]，使得硒酵母發(fā)酵的研究和生產(chǎn)進(jìn)入了新的階段。 其基本原理是在發(fā)酵過程中加入無(wú)機(jī)硒鹽，酵母在繁殖過程中吸收無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成為有機(jī)硒而存儲(chǔ)在細(xì)胞中成為硒酵母。Schrauzer[14]報(bào)道，在酵母發(fā)酵過程中，加入硒鹽使酵母最終積累有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)3 000 μg/g， 其中硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸含量可達(dá)總含量的60% 以上。 Rajashree 和Muthukumar[15]報(bào)道了用釀酒酵母突變株采用流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)硒酵母，最終有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3 758 μg/g，發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度達(dá)到32.09 g/L。但是在利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)硒的報(bào)道中，絕大多數(shù)的硒酵母中含有的有機(jī)硒主要成分是硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸的混合物，而這些硒代氨基酸是參與蛋白質(zhì)合成的，因此這些有機(jī)硒需要降解后才能被人體吸收代謝。 Mapelli[16]等為了生產(chǎn)價(jià)值更高的甲基硒代半胱氨酸，構(gòu)建了能夠高效表達(dá)異質(zhì)硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶的工程酵母菌，通過優(yōu)化流加發(fā)酵工藝，使酵母細(xì)胞有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1 061 μg/g， 但其中甲基硒代半胱氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻很低，只有 2.6 μg/g。 Klimaszewska[17]等利用真菌Lentinula edodes生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸，通過液體發(fā)酵收獲的菌絲體經(jīng)過萃取后得到120 μg/g 甲基硒代半胱氨酸。 Ogra[18]等通過生物轉(zhuǎn)化的方法闡明了釀酒酵母合成各種有機(jī)硒的代謝途徑，分析測(cè)定了主要硒代氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)有微量甲基硒代半胱氨酸生成。 至今為止，通過發(fā)酵法生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸的研究鮮有報(bào)道。 作者以釀酒酵母突變株XM2-9 為生產(chǎn)菌株，采用雙流加補(bǔ)料發(fā)酵方式解除了Crabtree 效應(yīng)， 使得菌體濃度和葡萄糖的產(chǎn)率大大提高。 同時(shí)，以亞硒酸鈉溶液為單獨(dú)流加補(bǔ)料，以最佳比硒消耗速率為依據(jù)，有效地控制亞硒酸鈉的流量，使硒轉(zhuǎn)化率大大提高。 最終得到發(fā)酵液的菌體質(zhì)量濃度為35.6 g/L， 細(xì)胞中有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4 937 μg/g， 其中甲基硒代半胱氨酸的產(chǎn)量高達(dá)8 189 μg/g。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeXM2-9 突變株，由 AUCH Lab 保藏。

1.1.2 斜面和種子培養(yǎng)基 葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂15 g/L。種子培養(yǎng)基不加瓊脂，調(diào)至pH 4.5。

1.1.3 分批培養(yǎng)基

1） 低濃度硫培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，氯化銨4 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，七水硫酸鎂 0.05 g/L，氯化鎂0.85 g/L， 加入20 mL 微量元素母液 （氯化鐵 970 mg/L，氯化鋅760 mg/L，鉬酸鈉152 mg/L，氯化鈷70 mg/L，氯化錳 78 mg/L）。 加入 20 mL 維生素母液（生物素10 mg/L，泛酸鈣120 mg/L，維生素B660 mg/L，肌醇 120 mg/L）。

2） 正常硫培養(yǎng)基：其他成分相同，只改變七水硫酸鎂為9.7 g/L。

1.1.4 流加培養(yǎng)基 葡萄糖110 g/L，氯化銨15 g/L，磷酸二氫鉀4.3 g/L，七水硫酸鎂10.2 g/L，微量元素母液40 mL/L，維生素母液40 mL/L。

1.1.5 亞硒酸鈉溶液 亞硒酸鈉（Na2SeO3）20 mg/mL（Sigma-Aldrich）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵罐及其控制 發(fā)酵罐是New Brunswick BioFlo 610 自動(dòng)控制發(fā)酵罐，裝液體積30 L。發(fā)酵溫度為35 ℃，溶氧由通氣和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)，通氣量為 0.5~0.7 vvm， 攪拌轉(zhuǎn)速為 200~400 r/min。 溶氧（DO）控制在 1~2 μg/g，pH 通過自動(dòng)流加 30% 的氨水和2 mol/L 鹽酸來(lái)調(diào)節(jié)。

1.2.2 葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度的測(cè)定 發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇的濃度用HPLC 的方法測(cè)定[16]并進(jìn)行了改進(jìn)，使用Shimadzu HPLC System，用Supelco 分析柱，流動(dòng)相使用1 g/L H3PO4，流量為0.7 mL/min，溫度為50 ℃。

1.2.3 硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1） 酵母細(xì)胞中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定： 稱取0.5 g干硒酵母粉放入20 mL 試管中，加入5 mL 70% 的濃硝酸混勻。 將試管放入80 ℃烘箱中消化2 h，然后將消化液到入100 mL 容量瓶中， 加入蒸餾水至100 mL。 用原子吸收光譜儀（Perkin Elmer A-Analyst 200）測(cè)定，條件是選擇元素硒，波長(zhǎng)為196.03 nm。

2） 發(fā)酵液上清液中總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：取10 mL 發(fā)酵液，放入離心管中，以5 000 r/min 離心5 min，上清液直接用原子吸收光譜法測(cè)定。

3） 發(fā)酵上清液無(wú)機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：發(fā)酵上清液無(wú)機(jī)硒按照甲基藍(lán)還原法測(cè)定[19]。

1.2.4 菌體濃度測(cè)定 取10 mL 發(fā)酵液在5 000 r/min下離心5 min， 去上清液， 用蒸餾水洗滌酵母3 次后，再在5 000 r/min 下離心5 min。 去上清液，將酵母沉淀放入105 ℃烘箱中干燥2 h 至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。

1.2.5 分批發(fā)酵和流加發(fā)酵 分批發(fā)酵：將培養(yǎng)好400 mL 的搖瓶種子接到裝液體積為30 L 的發(fā)酵罐中，pH 4.5、35 ℃自動(dòng)控制進(jìn)行發(fā)酵，溶氧控制在1~2 μg/g。

流加發(fā)酵： 在同樣發(fā)酵罐中先加入10 L 分批發(fā)酵培養(yǎng)基，接入種子后，開始分批發(fā)酵。 隨著菌體的生長(zhǎng)，發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度不斷下降至0.1 g/L以下時(shí)，開始用流加培養(yǎng)基通入發(fā)酵罐，恒速流加量分別控制在F=0.6、0.8、1 L/h，同時(shí)亞硒酸鈉溶液通過蠕動(dòng)泵加入發(fā)酵罐。 控制發(fā)酵液的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為限制性底物質(zhì)量濃度。

指數(shù)流加發(fā)酵：流加培養(yǎng)基的流加量按照下列公式計(jì)算：

式中：F為培養(yǎng)基流加量，L/h；S為發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；μ 為比生長(zhǎng)速率，h-1；V為發(fā)酵液體積，L；SF為流加培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；Yx/s為菌體細(xì)胞對(duì)葡萄糖的得率，g/g；（VX）0為流加發(fā)酵的初始細(xì)胞質(zhì)量，g。

1.2.6 酵母細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的計(jì)算

式中：t1和t2分別表示菌體培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間1和時(shí)間 2，min；X1和X2分別表示在t1和t2所對(duì)應(yīng)的菌體質(zhì)量濃度，g/L。

1.2.7 抑制性底物對(duì)比生長(zhǎng)速率的影響 在酵母培養(yǎng)過程中，由于亞硒酸鈉的毒性對(duì)于酵母生長(zhǎng)有一定的抑制作用，Andrew[21]提出了菌體生長(zhǎng)模型，其比生長(zhǎng)速率和亞硒酸鈉底物濃度的關(guān)系為：

式中：Ks為飽和常數(shù)，g/L；KIS為抑制常數(shù)，g/L；S為限制性底物質(zhì)量濃度，g/L；SI為抑制性底物質(zhì)量濃度，g/L；μmax為無(wú)底物抑制的最大比生長(zhǎng)速率。

在亞硒酸鈉存在的情況下， 如果SI>KIS， 則μ<μmax，菌體的比生長(zhǎng)速率顯著下降，因此在菌體發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中的亞硒酸鈉要控制在最佳的范圍內(nèi)。

1.2.8 亞硒酸鈉溶液流加量 亞硒酸鈉流加量以比硒消耗速率為 0.5 mg/（g·h）為依據(jù)[22]，即

式中：fi為亞硒酸鈉流加量，mL/h；V為發(fā)酵液體積，L；X為發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度，g/L。

當(dāng)亞硒酸鈉溶液質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí)，亞硒酸鈉流加量fi= 0.055VX。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批發(fā)酵參數(shù)的計(jì)算和條件優(yōu)化

2.1.1 初始亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)硒酵母生長(zhǎng)的影響 當(dāng)葡萄糖初始質(zhì)量濃度為30.2 g/L， 無(wú)機(jī)硒初始質(zhì)量濃度分別為 0、10.5、30.3、40.2 g/L 時(shí)，經(jīng)分批發(fā)酵得到的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖1。從圖1 可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度為零時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)最快。 隨著初始硒質(zhì)量濃度的增加，菌體的比生長(zhǎng)速率逐漸下降，葡萄糖的比消耗速率也逐步下降。 說(shuō)明無(wú)機(jī)硒質(zhì)量濃度越高， 對(duì)于菌體生長(zhǎng)的抑制越明顯，細(xì)胞生長(zhǎng)符合Andrew 模型。 但是，由于此突變株對(duì)無(wú)機(jī)硒的抗性作用， 即使在初始硒質(zhì)量濃度達(dá)到40 mg/L，細(xì)胞仍然保持一定的比生長(zhǎng)速率，表1 為分批發(fā)酵得到的數(shù)據(jù)。

圖1 不同初始亞硒酸鈉質(zhì)量濃度下硒酵母XM2-9 的發(fā)酵過程Fig. 1 Batch fermentation of S.cerevisiae XM2 -9 in glucose medium with different initial selenium concentrations

表1 不同初始硒質(zhì)量濃度下酵母發(fā)酵過程參數(shù)的比較Table 1 Parameters of selenium yeast fermentation with different initialselenium concentrations

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明， 在不含亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率最高，達(dá)到μ=0.125 h-1；當(dāng)培養(yǎng)基中初始硒質(zhì)量濃度分別為10.5、30.3、40.2 mg/L 時(shí)，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率分別為 0.123、0.117、0.101 h-1，其比生長(zhǎng)速率呈下降趨勢(shì)。 同樣地，最終的菌體質(zhì)量濃度也是隨著初始硒質(zhì)量濃度增加而下降。 實(shí)驗(yàn)還表明，隨著初始硒質(zhì)量濃度的增加，最終酵母細(xì)胞中有機(jī)硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相應(yīng)增加， 它們分別為766、2 265、3 117 μg/g。 這說(shuō)明該酵母菌具有很強(qiáng)的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力，但是由于分批發(fā)酵后期的營(yíng)養(yǎng)和無(wú)機(jī)硒耗盡，菌體出現(xiàn)老化，導(dǎo)致分批發(fā)酵難以實(shí)現(xiàn)硒酵母高生產(chǎn)強(qiáng)度和高硒轉(zhuǎn)化率的生產(chǎn)要求。顯然，只有通過其他的發(fā)酵模式才能實(shí)現(xiàn)有機(jī)硒酵母高產(chǎn)的目標(biāo)。

2.1.2 培養(yǎng)基中硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)硒酵母發(fā)酵的影響 硒和硫在化學(xué)性質(zhì)上具有相似性，但細(xì)胞對(duì)硫和硒吸收和轉(zhuǎn)化上表現(xiàn)出不同的親和性。 硫是菌體生長(zhǎng)所必需的元素，因此硫質(zhì)量濃度的大小對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的影響，同時(shí)硫?qū)ξ奈辙D(zhuǎn)化還存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 Mapelli[23]認(rèn)為在硒酵母發(fā)酵過程中硫質(zhì)量濃度達(dá)到某一關(guān)鍵點(diǎn)時(shí)細(xì)胞對(duì)硒的吸收會(huì)顯著下降。

為了考察在低硫質(zhì)量濃度下是否有利于菌體對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收和代謝，特設(shè)定了2 種培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，一種是酵母正常生長(zhǎng)所需的硫酸根質(zhì)量濃度3.8 g/L， 另一種為低硫酸根質(zhì)量濃度0.02 g/L[16]，結(jié)果見圖2。 從 圖2 可以看出，低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基在開始階段菌體生長(zhǎng)的遲滯期比正常硫培養(yǎng)基延長(zhǎng)了2 h 左右， 但是在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基的菌體細(xì)胞比生長(zhǎng)速率逐步接近正常硫培養(yǎng)基的菌體， 它們的比生長(zhǎng)速率分別為0.125、0.122 h-1， 最終的菌體質(zhì)量濃度分別為 12.9、12.5 g/L。為了比較細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收和轉(zhuǎn)化率的影響，分別在這兩種培養(yǎng)基中加入亞硒酸鈉，初始質(zhì)量濃度都為30.3 mg/L。 酵母細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基下無(wú)機(jī)硒的殘留質(zhì)量濃度和菌體質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化曲線見圖3?？梢钥吹?，在低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)速度稍低于正常硫培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)速度，但是在這兩種培養(yǎng)基中菌體細(xì)胞對(duì)于硒的吸收和比硒消耗速率幾乎相同。 表2列出了這兩種培養(yǎng)基發(fā)酵參數(shù)。

圖2 在正常硫質(zhì)量濃度和低硫質(zhì)量濃度的葡萄糖培養(yǎng)基條件下酵母XM2-9 的發(fā)酵過程Fig.2 Batch fermentation of S. cerevisiae XM2-9 in glucose medium with normal and low sulphur concen -trations

圖3 在正常硫質(zhì)量濃度和低硫質(zhì)量濃度的葡萄糖培養(yǎng)基下硒酵母XM2-9 的發(fā)酵過程及其發(fā)酵液中殘留硒質(zhì)量濃度的變化Fig. 3 Selenium yeast batch fermentation by S. cerevisiae XM2-9 in glucose medium with normal and low sulphur concentrations

表2 不同初始硫質(zhì)量濃度下硒酵母發(fā)酵過程參數(shù)的測(cè)定和計(jì)算結(jié)果Table 2 Determination and calculation of fermentation parameters of selenium yeast with different initial sulphur concentration

由表2 可以看出，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過計(jì)算得到在正常硫培養(yǎng)基下細(xì)胞的最大比硒消耗速率為d[cSe]/（Xdt）=0.47 mg/（g·h） 略大于低質(zhì)量濃度硫培養(yǎng)基下比硒消耗速率0.46 mg/（g·h），表明在此條件下低硫質(zhì)量濃度對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收和代謝并沒有改善。 但是這兩個(gè)比硒消耗速率數(shù)值和Suhajda[22]描述的最佳比硒消耗速率相吻合。 該比硒消耗速率值為后面流加發(fā)酵時(shí)亞硒酸鈉溶液的流量計(jì)算提供了理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)顯示，在這兩個(gè)硫質(zhì)量濃度相差比較大的情況下得到了非常相近的比生長(zhǎng)速率和比硒消耗速率的數(shù)值。 為了證實(shí)實(shí)驗(yàn)的可靠性，在培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)將硫酸鎂質(zhì)量濃度從0.05 g/L 增加到0.1 g/L， 所得到的比生長(zhǎng)速率和比硒消耗速率是一致的。 由此可以推斷，在設(shè)定的正常硫酸根質(zhì)量濃度和低硫酸根質(zhì)量濃度之間酵母的比硒消耗速率是幾乎相同的。 實(shí)驗(yàn)還證明，菌體生長(zhǎng)在正常硫酸根質(zhì)量濃度下的遲滯期比在低硫酸根質(zhì)量濃度培養(yǎng)基下遲滯期大大縮短， 更加有利于硒酵母發(fā)酵，因此在后面流加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中用正常硫酸鎂質(zhì)量濃度培養(yǎng)基。

2.2 恒速流加發(fā)酵對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與硒轉(zhuǎn)化的影響

流加發(fā)酵在酵母生產(chǎn)和一些初級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵中有廣泛應(yīng)用。 在發(fā)酵過程中通過控制培養(yǎng)基流量來(lái)減少發(fā)酵過程中產(chǎn)生的葡萄糖效應(yīng)[24]，與此同時(shí)，流加亞硒酸鈉溶液使菌體細(xì)胞在生長(zhǎng)的同時(shí)不斷地吸收和代謝無(wú)機(jī)硒，從而獲得高產(chǎn)的甲基硒代半胱氨酸酵母。

在發(fā)酵罐中先加10 L 分批發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后開始間歇發(fā)酵。 當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度下降至0.1 g/L 以下時(shí)，開始流加發(fā)酵模式，流加量根據(jù)菌體比生長(zhǎng)速率μ=0.117 h-1為參考。 初始發(fā)酵體積以10 L 計(jì)算，當(dāng)稀釋率分別選為D=0.06、0.08、0.1 h-1，則葡萄糖培養(yǎng)基流加量分別為F= 0.6、0.8、1 L/h泵入發(fā)酵罐。 同時(shí)亞硒酸鈉溶液也流加入罐內(nèi)，流量控制在比硒消耗速率 0.5 mg/（g·h）為佳。 當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí)， 無(wú)機(jī)硒流加量按公式f= 0.055XV計(jì)算。 當(dāng)起始發(fā)酵液體積V=10 L、菌體質(zhì)量濃度X=11 g/L、 亞硒酸鈉初始流加量為f1=6.05 mL/h，以此類推，流加量隨著發(fā)酵液體積和菌體濃度這兩個(gè)參數(shù)的乘積增加而增加。 但是到發(fā)酵后期隨著菌體細(xì)胞的逐步老化，細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收和代謝速率下降，這時(shí)無(wú)機(jī)硒流加量應(yīng)有所變化。 將比硒消耗速率控制在 0.4 mg/（g·h）以下，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中殘留的無(wú)機(jī)硒質(zhì)量濃度，控制發(fā)酵液中殘留的無(wú)機(jī)硒質(zhì)量濃度低于30 mg/L。 圖4 顯示恒速流加發(fā)酵過程中菌體質(zhì)量濃度和菌體中有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間變化的曲線。 發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別測(cè)定發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度和酵母中有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)等進(jìn)行物料衡算， 并計(jì)算發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見表3。

表3 不同流加量下硒酵母流加補(bǔ)料發(fā)酵的結(jié)果Table 3 Selenium yeast production by fed-batch fermentation under different flow rates

從圖4 可以看出， 當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基流加量為0.6 L/h 時(shí)，最終的菌體質(zhì)量濃度達(dá)到34.2 g/L，有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達(dá)到4 463 μg/g，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度為9.16 mg/（L·h）；當(dāng)流加量增加到1 L/h時(shí)，菌體在較快的比生長(zhǎng)速率下繁殖，硒鹽的流加量也相應(yīng)加快，在此流加量下有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度提高到9.69 mg/（L·h），但是菌體質(zhì)量濃度卻降低為 32.8 g/L，其有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低到2 953 μg/g； 當(dāng)流加量為0.8 L/h 時(shí)， 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率介于前兩者之間，菌體細(xì)胞對(duì)硒的吸收和亞硒酸鈉流加量更匹配。 有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度高于其他兩個(gè)流量的有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度，達(dá)到 10.16 mg/（L·h）， 發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵母的菌體質(zhì)量濃度為33.5 g/L，有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3 791 μg/g。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，培養(yǎng)基的流加量與有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度有密切的關(guān)系，當(dāng)流加量增加到某一值時(shí)，有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大值，這是恒速流加發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)硒酵母的關(guān)鍵。

圖4 葡萄糖培養(yǎng)基在流加量0.6、0.8、1 L/h 時(shí)恒速流加硒酵母發(fā)酵過程Fig. 4 Fed-batch fermentation with a constant feeding at different flow rates of 0.6, 0.8 and 1 L/h

2.3 指數(shù)流加發(fā)酵優(yōu)化

恒速流加葡萄糖培養(yǎng)基發(fā)酵提高了有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度和無(wú)機(jī)硒的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率， 但是在流加的初期，由于菌體質(zhì)量濃度比較低，在高速流加葡萄糖培養(yǎng)基情況下菌體來(lái)不及消耗葡萄糖，導(dǎo)致發(fā)酵液中殘?zhí)遣粩嘣黾?，有少量乙醇的產(chǎn)生，乙醇質(zhì)量濃度積累至1.0~1.5 g/L， 從而影響細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和最終的葡萄糖產(chǎn)率。 為了消除殘?zhí)堑姆e累，設(shè)計(jì)了指數(shù)流加方式進(jìn)料。 根據(jù)指數(shù)流加公式，分別設(shè)定了兩個(gè)比生長(zhǎng)速率μ1=0.08 h-1和μ2=0.1 h-1來(lái)計(jì)算相對(duì)應(yīng)指數(shù)流加速率。

1） 根據(jù)公式計(jì)算， 首先設(shè)定參數(shù) μ1=0.08 h-1、V0=10 L、X0=11 g/L、Yx/s=0.42 g/g、SF=110 g/L。計(jì)算得到初始進(jìn)料時(shí)的流量為F0=0.19 L/h，1 h 后流量增加為F1=0.22 L/h，以此類推一直進(jìn)料28 h，總進(jìn)料為20. 93 L。同時(shí)亞硒酸鈉溶液流加進(jìn)料，流量控制在比硒消耗速率 0.5 mg/（g·h）， 計(jì)算方法和恒速進(jìn)料一樣。

2） 再選取 μ2=0.1 h-1， 其他參數(shù)與計(jì)算方法同（1）來(lái)進(jìn)行指數(shù)流加速率計(jì)算。

圖5 顯示這兩批指數(shù)流加發(fā)酵的結(jié)果。 當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基流加量以設(shè)定的μ1=0.08 h-1指數(shù)流加時(shí)，有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度增加到 12.55 mg/（L·h）。 指數(shù)流加發(fā)酵的有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度比恒速流加發(fā)酵提高了19%，酵母中有機(jī)硒的比例增加了23%。這是因?yàn)閺闹笖?shù)流加發(fā)酵開始，發(fā)酵液中葡萄糖基本上被消耗掉，轉(zhuǎn)化成菌體，并且細(xì)胞一直維持較高的比生長(zhǎng)速率，年輕菌體使得細(xì)胞的平均比硒消耗速率大于恒速流加的比硒消耗速率，結(jié)果最終的有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度提高。

圖5 葡萄糖培養(yǎng)基在設(shè)定的μ=0.08、0.1 h-1 時(shí)指數(shù)流加硒酵母發(fā)酵過程Fig.5 Fed-batch fermentation with an exponential feeding at different flow rates set at μ=0.08 h-1 and μ=0.1 h-1 respectively

當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基流加量以設(shè)定的μ2=0.1 h-1指數(shù)流加時(shí)，有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá) 12.17 mg/（L·h）。但在實(shí)際操作時(shí)，發(fā)酵液中殘留無(wú)機(jī)硒有時(shí)瞬間升高導(dǎo)致對(duì)菌體的抑制作用以及發(fā)酵中后期的菌體部分老化，實(shí)際上平均比生長(zhǎng)速率下降為0.083 h-1，低于0.1 h-1理論值。 通過比較發(fā)現(xiàn)，以設(shè)定的μ1=0.08 h-1指數(shù)流加的發(fā)酵結(jié)果最優(yōu)。

2.4 硒酵母有機(jī)硒代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果和分析

通過指數(shù)流加發(fā)酵試驗(yàn)后，分別得到兩個(gè)批次的硒酵母菌體，經(jīng)過洗滌和干燥得到酵母粉。 對(duì)這兩個(gè)樣品的有機(jī)硒成分做了檢測(cè)，結(jié)果見表4。

從表4 可知， 硒酵母中99% 以上是有機(jī)硒，其中甲基硒代半胱氨酸（SeMCys）占總有機(jī)硒的72%左右，硒代蛋氨酸（SeMet）占 21%~22%，大約 5%~6%余下的有機(jī)硒為各種硒代糖類。 研究認(rèn)為[25]，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉和酵母細(xì)胞膜上特異配體結(jié)合形成復(fù)合體，通過轉(zhuǎn)運(yùn)離子通道并穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 在細(xì)胞內(nèi)亞硒酸鈉經(jīng)過一系列代謝途徑合成重 要 的 中 間 代 謝 物 Selenocystathionine。Selenocystathionine 在 cystathionine-γ-lyase 作用下形成硒代半胱氨酸，這時(shí)硒代半胱氨酸在硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶作用下產(chǎn)生甲基硒代半胱氨酸。 由于S. cerevisiaeXM2-9 突變株的 synthase γ-glu-Cys 酶失活， 所以形成的甲基硒代半胱氨酸不能繼續(xù)向下合成γ-glu-SeMetCys，從而導(dǎo)致甲基硒代半胱氨酸積累在細(xì)胞內(nèi)。 因?yàn)榧谆腚装彼岵皇呛铣傻鞍踪|(zhì)的氨基酸， 只能存儲(chǔ)在細(xì)胞的液泡中，這樣酵母突變株利用這一代謝機(jī)制將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為甲基硒代半胱氨酸，從而有效降低了亞硒酸鈉對(duì)細(xì)胞的毒性。

表4 硒酵母中有機(jī)硒代謝物的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of organic selenium metabolites in selenium yeast product

通過上述分析發(fā)現(xiàn)，硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶是合成甲基硒代半胱氨酸的關(guān)鍵酶。 Mapelli[16]為了生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸，構(gòu)建了能夠高效表達(dá)異質(zhì)硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)化酶的工程酵母菌，雖然轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能產(chǎn)生一定量甲基硒代半胱氨酸，但是質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻很低，只有2.6 μg/g。 其原因是合成的甲基硒代半胱氨酸已部分代謝成其他的中間產(chǎn)物，而不是積累在細(xì)胞內(nèi)。 Klimaszewska[17]等利用真菌Lentinula edodes生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸，通過不斷提高培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度來(lái)馴化菌體對(duì)無(wú)機(jī)硒的抗性，同時(shí)優(yōu)化發(fā)酵條件，使馴化后菌體的有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)比出發(fā)菌株大幅度提高。Lentinula edodes液體發(fā)酵得到的菌體質(zhì)量濃度為10 g/L， 菌體中甲基硒代半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120 μg/g，硒代蛋氨酸為672 μg/g。雖然含甲基硒代半胱氨酸的真菌Lentinula edodes具有潛在的食品保健功能，但是遠(yuǎn)不能達(dá)到作為工業(yè)化生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸的要求。 與上述的研究相比，本研究在甲基硒代半胱氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度和有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面有了很大的突破。

3 結(jié) 語(yǔ)

首先采用分批發(fā)酵，在葡萄糖培養(yǎng)基中加入不同初始質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比，確定了硒酵母在各種培養(yǎng)基中的最大比生長(zhǎng)速率。 然后考察培養(yǎng)基中硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響，并確定酵母細(xì)胞在有機(jī)硒轉(zhuǎn)化過程中最佳比硒消耗速率。在此基礎(chǔ)上， 首次采用雙流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)硒酵母。 通過比較發(fā)現(xiàn)，葡萄糖培養(yǎng)基采用指數(shù)流加供料為最佳， 使細(xì)胞處于較高的比生長(zhǎng)速率下繁殖。與此同時(shí)，建立獨(dú)立的亞硒酸鈉流加系統(tǒng)，進(jìn)料速度控制在比硒消耗速率 0.5 mg/（g·h）左右。 用數(shù)學(xué)模型對(duì)兩種流加速率進(jìn)行優(yōu)化控制，并以有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度為優(yōu)化指標(biāo)，最終的硒酵母發(fā)酵取得了最佳結(jié)果。 以設(shè)定的比生長(zhǎng)速率μ1=0.08 h-1指數(shù)流加葡萄糖時(shí)，有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最高值12.55 mg/（L·h），菌體最終質(zhì)量濃度達(dá)到35.6 g/L， 酵母中有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)4 937 μg/g，其中，更有價(jià)值的甲基硒代半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到8 189 μg/g。 通過優(yōu)化取得了在高有機(jī)硒生產(chǎn)強(qiáng)度條件下生產(chǎn)甲基硒代半胱氨酸的目的。