大豆分離蛋白重組蛋白酶水解肽對小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響

曾松榮， 龐彥韜， 柯 野， 何璐娜， 劉玉萍

（韶關學院 英東生物與農業(yè)學院，廣東 韶關512005）

大豆肽通常是以大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）為原料，在最適溫度和 pH 下進行蛋白酶解反應后所獲得的小分子肽類經(jīng)加工精制生產出的活性短肽類產品。如果將大豆分離蛋白（SPI）直接應用于食品工業(yè)中，制造出來的產品就不易被吸收。 因此，先將其水解為短肽，再應用于食品的生產中，這樣的產品不僅有利于消化吸收，而且還可以使大豆肽的生物學功能得以充分發(fā)揮，提高其附加值。 酶水解法是目前生產大豆肽的主要方法，隨著大量蛋白酶在活性肽制備中的應用，微生物蛋白酶水解催化效率更高，且價格便宜，其中真菌來源的蛋白酶具備pH 適應性廣、底物選擇性大等優(yōu)點，因此也非常適用于大豆肽的生產[1-2]。

醬油曲霉（Aspergillus sojae）可以產生多種運送到胞外的蛋白酶，其中某些胞外蛋白酶可以水解植物蛋白， 這些蛋白酶大多為中性和堿性， 日本的Hayashi 等對其性質做了研究， 發(fā)現(xiàn)醬油曲霉蛋白酶具有典型的肽鏈內切酶特性，一般在消化蛋白質時切斷肽鏈的8%~15%就終止反應[3]。 在國內，醬油曲霉已被廣泛用于生產傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品，對醬油曲霉的研究主要集中在其蛋白酶學性質方面，而利用其重組蛋白酶法制備大豆肽鮮見報道。

作者所在實驗室前期已構建好的醬油曲霉重組堿性蛋白酶畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌株來表達醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp），以大豆分離蛋白（SPI）為底物經(jīng)酶解后得到大豆分離蛋白重組蛋白酶水解肽（以下簡稱大豆肽），然后探討這些大豆肽對小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響，為大豆的高值化利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 小鼠、飼料與菌株來源 實驗動物小鼠（Musmusculus）： 購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心；飼養(yǎng)小鼠的普通飼料：購自沈陽市于洪區(qū)前民動物實驗飼料廠；醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）畢赤酵母工程菌株：韶關學院英東生物與農業(yè)學院微生物學實驗室構建，-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）BMGY 液體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/dL，酵母粉1 g/dL， 甘油體積分數(shù)1%， 采用0.1 mol/L 的 pH 6.0磷酸鹽緩沖液配制。

2）BMMY 液體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/dL，酵母粉1 g/dL， 甲醇體積分數(shù)1%， 采用0.1 mol/L 的 pH 6.0磷酸鹽緩沖液配制。

1.1.3 生化與化學試劑 測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）的試劑盒：購自南京建成科技有限公司；鎳柱親和層析預裝柱和Sephadex G-75 層析柱： 購自BIORAD 公司；大豆分離蛋白（SPI）：購自上海藍平實業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組堿性蛋白酶 （rAp） 的誘導表達及純化將保藏于-80 ℃冰箱的醬油曲霉重組堿性蛋白酶畢赤酵母 （Pichia pastoris） 工程菌株活化后， 接種于BMGY 液體培養(yǎng)基中。 180 r/min、28 ℃搖瓶振蕩恒溫培養(yǎng)24 h 后，將菌液無菌離心、洗滌，取其菌體重懸于BMMY 誘導培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)，每隔24 h 添加BMMY 培養(yǎng)基體積分數(shù)1%的甲醇對工程菌株進行誘導，誘導7 d 后離心收集發(fā)酵液，采用Folin 酚法測定發(fā)酵液中rAp 的酶活[4]。 酶活單位的定義為：在40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1 個酶活力單位。

在發(fā)酵液中添加固體硫酸銨80 g/dL，4 ℃放置過夜后，8 000 r/min 離心10 min, 收集蛋白質沉淀，采用蒸餾水溶解蛋白質沉淀后，利用鎳柱親和層析對rAp 進行分離純化， 采用不同濃度的洗脫液進行洗脫，收集含有100 mmol/L 咪唑的洗脫液，對洗脫液超濾濃縮后， 利用Sephadex G-75 層析柱進行層析，收集洗脫液，超濾濃縮，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）初步鑒定rAp，蛋白質印跡（Westernblotting）做進一步鑒定，保存酶液備用。

1.2.2 利用rAp 制備大豆肽 用0.01 mol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 10）配置質量濃度為 7.0 g/dL 的大豆分離蛋白（SPI）溶液，在95 ℃以上的水浴中處理15 min，冷卻后調至pH 10，按酶/底物比為3 000 U/g 添加純化的rAp 后，在40 ℃保溫水解1 h，水解期間不定時攪拌，水解完成后將含有大豆肽的酶解液 pH 值調為 7.2[5-6]。

1.2.3 大豆分離蛋白（SPI）的酶解情況鑒定試驗

1）大豆肽的分離：將上述大豆分離蛋白（SPI）的rAp 水解液調至pH 4.2 進行等電點沉淀，于12 000 r/min 離心15 min，取上清液，再經(jīng)抽濾裝置進行抽濾，得到澄清的水解液，即為重組蛋白酶水解產物大豆肽溶液。

2）大豆分離蛋白酶解情況初步鑒定：制備質量濃度為5 g/dL 的濃縮膠，12 g/dL 的分離膠， 再經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、染色、脫色和觀察，拍照記錄結果。

1.2.4 對實驗小鼠的處理及飼養(yǎng) 選取合格小鼠40 只，隨機分為兩組（實驗組、對照組），每組20 只。對每只小白鼠進行打耳標編號標記，稱量體質量并一一對應編號記錄，體質量記為W0。 其中實驗組參照小鼠體質量以2 mg/g 的劑量灌胃由rAp 酶解得到的大豆分離蛋白（SPI）水解液；對照組直接灌胃等劑量的由未加酶水解液制備得到的大豆分離蛋白水溶液。 在每天同一時間灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d后對其禁食24 h，然后對小鼠采用眼球采血法收集血液， 置于已編號的離心管中用于小鼠血清的制備。 采用頸椎脫臼法處死小鼠，隨后進行實驗組和對照組對小鼠免疫功能和抗氧化能力的研究。

1.2.5 大豆肽對小鼠免疫功能的影響

1）小鼠免疫器官指數(shù)的測定：將供試小鼠眼球取血前稱體質量，取血后頸椎脫臼法處死，取出胸腺和脾臟等免疫器官， 濾紙吸干水分后分別稱質量，計算免疫器官指數(shù)[7-8]。

免疫器官指數(shù)=臟器質量（mg）/體質量（g）。

2）小鼠血清溶菌酶活性的測定：受試小鼠連續(xù)灌胃30 d，末次灌胃結束后24 h 采用摘除眼球采血法取血，于 4 ℃、2 000 r/min 離心 15 min，取上清液作為待測血清備用。

采用牛肉膏蛋白胨瓊脂雙層平板法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），采用上層混菌法，待上層培養(yǎng)基凝固后，在上層平板打孔，將200 μL 小鼠血清點樣于瓊脂平板的小孔中， 每組中每個小鼠血清點樣3 個孔，置37 ℃培養(yǎng)24 h，測定溶菌圈的直徑[9]。

3） 小鼠血清抗菌活力的測定： 以大腸桿菌（Escherichia coli）為受試菌株，用生理鹽水緩沖液配制成一定濃度的菌懸液 （OD600=0.282）。 取5 mL菌懸液與100 μL 的上述血清混勻，于600 nm 處測定光密度值A1[9]；然后置于37 ℃培養(yǎng)30 min，再于600 nm 處測定光密度值A2。

血清抗菌活力=（A1-A2）/A1。

1.2.6 大豆肽對小鼠抗氧化性的影響 受試小鼠連續(xù)灌胃30 d 后處死，分離血清，按照各試劑盒說明書的操作方法檢測小鼠血清中過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）的水平[10-11]。

2 結果與分析

2.1 rAp 的誘導表達純化結果

通過對rAp 工程菌株的培養(yǎng)和添加甲醇誘導表達，采用Folin-酚法測定發(fā)酵液中蛋白酶的酶活，然后對發(fā)酵液中蛋白質進行鹽析、親和層析和分子篩層析后，SDS-PAGE 電泳獲得較為單一的蛋白質條帶，見圖1。該蛋白質條帶與rAp 的基因序列推導的蛋白質相對分子質量35 000 基本一致。 Western blotting 分析結果顯示，該純化的目的蛋白質條帶可以被His 標簽抗體識別，大小為35 000 左右，見圖2。試驗結果表明，rAp 被工程菌株成功誘導表達，并且通過純化鑒定后獲得了目的重組蛋白酶rAp。

圖1 rAp 的純化SDS-PAGE 電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE of the purified rAp

2.2 rAp 水解大豆分離蛋白質的結果

對大豆分離蛋白 （SPI） 進行95 ℃以上預處理后，利用rAp 對其在40 ℃酶解1 h，進一步將酶解液離心去掉沉淀，進行SDS-PAGE 電泳，見圖3。

由圖3 可知，大豆分離蛋白中35 000 以上的大分子蛋白質基本都被rAp 水解，并且被水解后的大豆分離蛋白中相對分子質量大于18 400 以上具有明顯條帶的蛋白質僅有3 條，這表明大豆分離蛋白被rAp 水解成小分子蛋白質，并且多數(shù)可能被水解為小肽。

圖 2 rAp 的 Western blotting 鑒定Fig. 2 Western blotting analysis of the rAp

圖3 rAp 對大豆分離蛋白的水解產物的電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE of soybean peptides from soybean protein isolate hydrolyzed by rAp

2.3 大豆肽對小鼠免疫功能的影響結果

2.3.1 大豆肽對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 大豆肽對小鼠體內免疫器官指數(shù)的影響見表1。

表1 大豆肽對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of soybean peptides on the immune organ indices in mice

由表1 可知，大豆肽對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)分別為 0.1639 %、0.4682 %；與大豆分離蛋白（SPI）相比，未有顯著差異，這表明大豆肽對小鼠整體的免疫器官沒有明顯影響。

2.3.2 大豆肽對小鼠血清溶菌酶活性的影響 以金黃色葡萄球菌（S. aureus）作為受試菌株，大豆肽對小鼠血清溶菌酶活性試驗結果見圖4。

圖4 小鼠血清溶菌酶活性試驗Fig. 4 Serum lysozyme activities in mice

測量溶菌酶對金黃色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌菌直徑見表2。

表2 大豆肽對小鼠血清溶菌酶活性的影響Table 2 Effect of soybean peptides on the serum lysozyme activity in mice

由表2 可知，在相同的濾紙片直徑下，灌胃由rAp 水解的大豆肽的小鼠血清具有明顯的抑菌作用，且抑菌圈直徑達到了1.4 cm。 由此可知，大豆肽有顯著提高小鼠血清溶菌酶活性的作用。

2.3.3 大豆肽對小鼠血清抗菌活力的影響 以大腸桿菌（E. coli）作為受試菌株，大豆肽對小鼠血清的抗菌活力影響見表3。

表3 大豆肽對小鼠血清抗菌活力影響Table 3 Effect of soybean peptides on the serum antibacterial activity in mice

由表3 可知，大豆肽的小鼠血清的抗菌能力達到28.58 %，顯著高于大豆分離蛋白（SPI）10.16%，表明大豆肽有顯著提高小鼠血清抗菌活力的作用。

2.4 大豆肽體內抗氧化試驗結果

以大豆分離蛋白（SPI）做對照，大豆肽灌胃30 d 后檢測小鼠血清中過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性以及丙二醛（MDA）水平，結果見表4。

表4 各組小鼠血清中GSH-PX、CAT、MDA 測定結果Table 4 Activities of GSH-PX，CAT and the contents of MDA in different mice serum

由表4 可以看出，與大豆分離蛋白（SPI）對照組相比，谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX 活性沒有顯著變化， 而CAT 活性顯著提高，MDA 濃度顯著降低。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）作為細胞內酶保護系統(tǒng)的主要成分之一，它和超氧化物歧化酶、過氧化氫酶一起能去除超氧陰離子自由基和H2O2，還原氫過氧化物，以減輕和阻斷脂質過氧化作用，保護細胞免受過氧化損傷[12]。 但實驗組和對照組在增強小鼠血清中GSH-Px 活力方面無明顯改變。

細胞內氫氧自由基（OH－）經(jīng)過一系列反應，對細胞有極強的破壞性，而這種氫氧自由基（OH－）能被過氧化氫酶分解，保證機體細胞內環(huán)境的穩(wěn)定和細胞的正常生活。 CAT 值越高，分解過氧化氫能力越強，機體的抗氧化能力就越高。 實驗組小鼠血清CAT 值較高，表明大豆肽可以提高小鼠體內的CAT值，從而增強小鼠的體內抗氧化性。

體內MDA 濃度反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，MDA 濃度越高，受自由基攻擊越嚴重[13-14]。實驗組小鼠體內MDA 濃度較少， 說明該組小鼠體內細胞受自由基攻擊最少，其體內的抗氧化性較高。

3 討 論

酶的選擇和酶解條件是大豆肽制備的關鍵，目前商業(yè)用酶主要是微生物酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復合酶）、植物蛋白酶及少量的動物蛋白酶。 通過這些特異性蛋白酶的作用，可以形成大小不等的多種活性肽。 已經(jīng)證明，不同的大豆活性肽具有抗高血壓、抗氧化、抗癌、降血脂、減肥、抗病毒及抑菌等生理保健功能[15]。 Stephen 等利用大豆肽對大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和白色念珠菌（Candida albicans）等進行抗菌活性實驗，結果表明，從大豆中提取的活性肽（PGTAVFK）能夠顯著抑制這些病原微生物的生長，推測大豆肽抗菌活性可能與大豆肽中氨基酸帶電性及疏水性有關，從而表現(xiàn)出抑菌性[16]，該結果與本研究的抑菌結果基本一致。

對具有抗氧化活性的多肽而言，其氨基酸序列和結構對其抗氧化功能起著基礎性的作用。 有研究表明，其抗氧化性與氨基酸組成如酪氨酸殘基或者氫鍵網(wǎng)絡性具有直接相關性，但其抗氧化機制仍不是十分清楚[17]。對于大豆肽的抗氧化性，也與其氨基酸組成和序列密切相關，如富含色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等殘基的大豆肽具有較強的抗氧化性[18-19]。作者利用rAp 制備的大豆肽，由于重組蛋白酶對底物P1 位點具有苯丙氨酸類疏水性的氨基酸殘基底物具有偏好性[20]，表明本研究獲得的大豆肽的序列中富含苯丙氨酸，這可能是其具有較強抗氧化性的原因之一。 在本研究中，大豆肽提高了小鼠血清的抗氧化性和抗菌性，這可能是由于大豆肽這些小分子肽類不需進一步降解就可直接被機體吸收進入血清，提高了血清的抗氧化性和抗菌能力[21-22]，但其具體的機理還有待于進一步研究。

4 結 語

作者對醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）畢赤酵母工程菌株進行了活化、 搖瓶誘導表達和分離純化。 通過SDS-PAGE 電泳進行初步鑒定，在35 000位置獲得單一的蛋白質條帶，與預期的重組rAp 相對分子質量大小一致，表明醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）已成功得到表達和純化鑒定。

利用上述已分離純化的醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白制備大豆肽，將大豆肽灌胃小鼠，然后探究這些大豆肽對小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響。 在大豆肽對小鼠免疫功能的影響方面，盡管由重組醬油曲霉蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白所得到的大豆肽與大豆分離蛋白（SPI）對照組相比，對小鼠免疫器官指數(shù)沒有明顯影響， 但顯著提高了血清抗菌能力和血清溶菌酶活性， 表明大豆肽對小鼠有顯著的免疫增強活性；在大豆肽的體內抗氧化驗證試驗方面，重組醬油曲霉蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白所得到的大豆肽與大豆分離蛋白（SPI）對照組相比，盡管二者在GSHPx 活性影響方面無明顯差別，但實驗中的大豆肽可使CAT 的活性顯著提高、MDA 濃度顯著降低，表明大豆肽與對照組相比可顯著提高小鼠的抗氧化性。綜上所述，醬油曲霉重組堿性蛋白酶（rAp）水解大豆分離蛋白獲得的大豆活性肽能在較大程度上增強小鼠機體的免疫功能和抗氧化活性，這些生理活性在營養(yǎng)、化妝品和醫(yī)藥領域的應用前景廣闊。