環(huán)糊精促進Burkholderia cepacia 轉化膽固醇生成膽甾-4-烯-3,6-二酮

武 迪， 張 玲， 吳夢棋， 孫柳青， 王 武， 楊海麟

（江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

膽固醇是一種重要的甾醇化合物，可以作為甾體類藥物的原料[1]。 有些微生物可以切除膽固醇飽和側鏈、氧化甾核特定部位，從而得到多種有藥用價值的衍生物[2-4]。 利用Mycobacteriumsp.將膽固醇轉化為睪酮（TS）[5]；利用 Arthrobacter simplex 降解膽固醇成功生產(chǎn)了雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）[6]；利用Rhodococcussp.將膽固醇轉化為膽甾-4-烯-3-酮[7]。除上述衍生物外，膽固醇還可被微生物轉化為膽甾-4-烯-3，6-二酮[8]。

膽甾-4-烯-3，6-二酮可應用于制備治療或預防神經(jīng)元損傷藥物[9]，亦可用于制造脂質(zhì)代謝改善劑、飲食品和動物飼料[10]，比膽甾-4-烯-3-酮具有更高的醫(yī)藥用價值。膽甾-4-烯-3，6-二酮可通過化學方法合成[11]，但化學合成法需使用大量強氧化劑且反應條件劇烈，也可通過微生物的甾體轉化獲得膽甾-4-烯-3，6-二酮。目前微生物轉化甾醇獲得膽甾-4-烯-3-酮的報道較多[12-14]，但獲得膽甾-4-烯-3，6-二酮的報道較少。

底物膽固醇為疏水性有機化合物，不利于與轉化體系中細胞的接觸和反應， 降低了產(chǎn)物的得率?？蓪⒛懝檀加糜袡C溶劑溶解后加入轉化體系來解決這一問題[8]，但有機溶劑易揮發(fā)、易燃易爆、污染環(huán)境、對菌體的生長毒害較大，且操作者長時間暴露于有機溶劑環(huán)境中，會對其神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)造成損傷。 因此，可探索選取更環(huán)保廉價的促溶劑。

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡稱CD）具有截頂圓錐狀空腔結構，內(nèi)腔疏水，外壁親水。 對其進行適當?shù)幕瘜W修飾，可以得到一系列具有修飾基團的環(huán)糊精衍生物，它們可與疏水性物質(zhì)形成包結絡合物，促進反應的進行。 在甾體的轉化反應中應用環(huán)糊精及其衍生物具有成功的案例[15-18]。向Saccharomyces cerevisiae轉化雄烯二酮 （AD） 的體系中添加 α-環(huán)糊精（α-CD） 可使其轉化率提高 44.44%[19]； 利用Nocardioides simplex轉化 AD 生成 ADD 的過程中，添加 β-環(huán)糊精（β-CD）使產(chǎn)物轉化率達 25%[20]；在β-CD 存在下，Rhizopus nigricans對孕酮的生物轉化反應速度幾乎提高了兩倍[21]。然而，在甾體生物轉化體系中應用環(huán)糊精促溶獲得膽甾-4-烯-3，6-二酮的研究目前尚未有報道。

作者前期篩選鑒定獲得了一株能夠轉化膽固醇的Burkholderia cepaciaZWS15（B. cepacia，保藏編號為 CCTCC NO：M2017661）， 從B.cepacia轉化膽固醇的體系中分離并鑒定出膽甾-4-烯-3，6-二酮， 考察環(huán)糊精種類和添加摩爾比對細胞生長、產(chǎn)物轉化率的影響。 選取最優(yōu)的環(huán)糊精種類，考察其對膽固醇官能團的包埋效果，以期為環(huán)糊精在生物轉化膽固醇合成膽甾-4-烯-3，6-二酮的工業(yè)應用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Burkholderia cepaciaZWS15（CCTCC M2017661）由作者所在實驗室前期篩選并鑒定。 固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，瓊脂粉 20；種子培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基，g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10； 發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）： 蔗糖 5， 酵母粉 15，NaNO32，K2HPO4·3H2O 2，KCl 0.5，MgCl21.35，MnCl20.01，CaCl20.055，MgSO41，膽固醇 2（即 5.18 mmol/L）；轉化培養(yǎng)基（g/L）：環(huán)糊精具體添加量不同，其余同發(fā)酵培養(yǎng)基。 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、 甲基-β-環(huán)糊精、 羥乙基-β-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、膽固醇、乙酸乙酯、異丙醇、乙腈：均購于國藥公司；硅膠板（GF254）：購于煙臺新諾化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 取在-40 ℃甘油管保存的B.cepaciaZWS15，于固體培養(yǎng)基劃線分離，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24~26 h， 挑取單菌落接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，即為處于對數(shù)生長期的種子液[22]。

1.2.2 羥乙基-β-環(huán)糊精-膽固醇包合物的制備稱取羥乙基-β-環(huán)糊精與膽固醇，使其摩爾比為2∶1。 將羥乙基-β-環(huán)糊精與膽固醇置于盛有 10 mL轉化培養(yǎng)基的50 mL 離心管中，使用超聲細胞破碎儀進行超聲乳化，功率400 W，工作時間2 s，間歇時間 2 s，超聲乳化15 min。

1.2.3Burkholderia cepacia生長細胞轉化膽固醇將處于對數(shù)生長期的種子液按體積分數(shù)5%接種到裝有10 mL 轉化培養(yǎng)基的50 mL 搖瓶中。轉化培養(yǎng)基中含2 g/L 膽固醇， 環(huán)糊精與膽固醇的摩爾比為1∶1。將搖瓶置于 30 ℃、200 r/min 全溫搖床柜中培養(yǎng)2 d，通過煮沸或直接用乙酸乙酯萃取終止轉化。

1.2.4 薄層層析分離提取轉化產(chǎn)物 采用萃取法提取產(chǎn)物。用2 倍體積乙酸乙酯與轉化液混合，200 r/min 搖床中振蕩 10 min，6 000 r/min 離心 10 min，取上層乙酸乙酯。重復上述步驟，合并有機相。經(jīng)真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮有機相，用GF254 硅膠板（20 cm×20 cm，1.5~2 mm）分離產(chǎn)物，以V正己烷∶V無水乙醚＝2∶3 作為展開劑。

1.2.5 質(zhì)譜、核磁和紅外光譜鑒定產(chǎn)物結構 質(zhì)譜分析（LC-MS）檢測產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量（沃特世質(zhì)譜儀 MALDI SYNAPT MS）； 核磁共振碳譜 （13CNMR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）測定產(chǎn)物碳和質(zhì)子的信號 （布魯克核磁共振波譜儀Aduance Ⅲ 400 MHZ）， 溫度 25 ℃， 溶劑 CDCl3， 以四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標；傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR）檢測產(chǎn)物的官能團 （賽默飛紅外光譜儀Nicolet is10）。 為進一步確認產(chǎn)物結構，除對測得的數(shù)據(jù)進行分析外， 還將獲得的數(shù)據(jù)與相關文獻和National Institute of Advanced Industrial Science and Technology 數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對。

1.2.6 高效液相對產(chǎn)物定量分析 用高效液相色譜法 （HPLC） 定量分析產(chǎn)物。 色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），V乙腈∶V異丙醇＝90∶10 作為流動相，流量 0.8 mL/min，進樣量 10 μL，檢測波長249 nm，柱溫30 ℃，每批次做3 個平行實驗。

取分離鑒定后的純產(chǎn)物作為標準品。 用異丙醇溶解產(chǎn)物，配制成不同濃度梯度的溶液，0.45 μm 有機膜過濾后進行HPLC 測定。 以產(chǎn)物質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標做曲線，所得即為產(chǎn)物標準曲線。

根據(jù)上述標準曲線計算產(chǎn)物產(chǎn)量，根據(jù)下式計算產(chǎn)物的轉化率[23]：

式中：c1為產(chǎn)物質(zhì)量濃度，mg/mL；c2為底物初始質(zhì)量濃度，mg/mL；M1為產(chǎn)物摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為底物摩爾質(zhì)量，g/mol。

2 結果與討論

2.1 B. cepacia 轉化膽固醇的產(chǎn)物結構鑒定

菌株在LB 培養(yǎng)基活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在200 r/min、30 ℃全溫搖瓶柜中培養(yǎng)2 d， 按1.2.4中方法分離純化其中一種轉化產(chǎn)物。

利用 LC-MS、FT-IR、NMR 等技術對該物質(zhì)的相對分子質(zhì)量、官能團、C 及質(zhì)子信號等結構信息進行了鑒定。 經(jīng)LC-MS 檢測該產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為398.4。

圖 1 為該物質(zhì)的紅外光譜圖，1 700.32 和1 682.67 cm-1、1 603.52 cm-1的吸收峰分別是—C=O、—C=C—的伸縮振動吸收峰，表明該物質(zhì)中含有兩個—C=O 和一個—C=C—， 推測其分子式為C27H42O2。 在誤差范圍內(nèi)，這與 Hunter AC 等報道的膽甾-4-烯-3，6-二酮紅外光譜信息一致[24]。

圖1 膽固醇轉化產(chǎn)物紅外光譜分析Fig. 1 FT-IR analysis of cholesterol conversion product

通過13C-NMR 測定不同位碳的化學位移（δ），確認該產(chǎn)物酮基的數(shù)量和位置， 見圖 2（a），13C-NMR（101 MHz，Chloroform-d）信息詳見表 1。 其中δ 202.31 與δ 199.69 是酮基的特征吸收峰，表示C6 和 C3 位為酮基。 δ 161.07 和 δ 125.44 是碳碳雙鍵的特征吸收峰， 雙鍵位于C4 和C5 之間。 這與Hunter AC 等報道的膽甾-4-烯-3，6-二酮核磁共振碳譜信息一致[24]。

表1 鑒定產(chǎn)物與膽甾-4-烯-3，6-二酮13C-NMR 譜對比Table 1 Comparison of 13C-NMR spectrum of the product identified here with that of cholest-4-ene-3，6-dione

通過1H-NMR 譜測定該產(chǎn)物氫原子總數(shù)及特定位的質(zhì)子信號，見圖 2（b）。 δ 7.07 為 CDCl3特征吸收峰。δ 6.17 為單峰，是C4 位上的一個H，以該峰為標峰， 對譜圖積分， 氫原子總數(shù)為42。1H-NMR（400 MHz，Chloroform-d） 信息見表 2。 在誤差范圍內(nèi)， 與 CUI JG 等報道的膽甾-4-烯-3，6-二酮核磁共振氫譜一致[25]。

圖2 膽固醇轉化產(chǎn)物核磁共振波譜Fig. 2 NMR spectra of cholesterol conversion product

表2 鑒定產(chǎn)物與膽甾-4-烯-3，6-二酮1H-NMR 譜的對比Table 2 Comparison of 1H-NMR spectrum of the product identified here with that of cholest-4-ene-3，6-dione

續(xù)表2

綜上所述，在誤差范圍內(nèi)，該產(chǎn)物質(zhì)譜、紅外光譜、 核磁共振波譜信息鑒定該物質(zhì)為膽甾-4-烯-3，6-二酮，見圖 3。

圖3 B. cepacia 轉化膽固醇生成膽甾-4-烯-3,6-二酮Fig. 3 Biotransfomation of cholesterol to cholest-4-ene-3,6-dione by B. cepacia

對比類似酮基產(chǎn)物的基本結構信息見表3，進一步確定Burkholderia cepaciaZWS15 轉化膽固醇的產(chǎn)物為膽甾-4-烯-3，6-二酮，而不是目前報道較多的膽甾-4-烯-3-酮。

表3 分離產(chǎn)物與膽甾-4-烯-3-酮的結構信息對比Table 3 Comparison of structural information between the isolated product of this study and cholest-4-en-3-one

2.2 不同種類環(huán)糊精對膽甾-4-烯-3，6-二酮產(chǎn)率的影響

由于環(huán)糊精及其衍生物具有內(nèi)腔疏水，外壁親水的特性，且在生物轉化過程中環(huán)糊精僅對細胞的形態(tài)造成小幅度影響而不至于使其凋亡，提高了菌體細胞的通透性，有助于生物轉化的進行[27]。故選取α-環(huán)糊精（α-CD）、β-環(huán)糊精（β-CD）、γ-環(huán)糊精（γ-CD）、甲基-β-環(huán)糊精（M-β-CD）、羥乙基-β-環(huán)糊精（HE-β-CD）、羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）分別加入B. cepacia轉化膽固醇的體系中，考察對膽甾-4-烯-3，6-二酮產(chǎn)率的影響。

在轉化過程中恒定膽固醇的初始添加量為2 g/L（即 5.18 mmol/L）。 按環(huán)糊精與膽固醇摩爾比 1∶1 向轉化培養(yǎng)基中添加環(huán)糊精并轉化2 d， 環(huán)糊精及膽固醇預先使用60 W 超聲波乳化15 min。

不同種類環(huán)糊精及衍生物對膽甾-4-烯-3，6-二酮轉化率的影響見圖4（a）。由于膽固醇的低水溶度，不添加任何環(huán)糊精時，膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉化率僅為 0.2%。添加 M-β-CD、HE-β-CD 的實驗組，膽甾-4-烯-3，6-二酮轉化率大幅提高，分別為對照組的 27.55 倍和 37.95 倍。 在 α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD 存在下，膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉化率約為對照組的1.75~3.95 倍。

進一步考察了HE-β-CD 添加量對轉化率的影響，結果見圖 4（b）。 當 HE-β-CD 與膽固醇摩爾比為 2∶1 時，膽甾-4-烯-3，6-二酮轉化率為 12.1%，比HE-β-CD 與膽固醇摩爾比為1∶1 的轉化率提高了59.42%。

圖4 環(huán)糊精對膽甾-4-烯-3，6-二酮轉化率的影響Fig. 4 Effect of cyclodextrin on the yield of cholest-4-ene-3，6-dione

與對照組（不添加環(huán)糊精）相比，所選的環(huán)糊精均能促進膽甾-4-烯-3，6-二酮的生成，表明這幾種環(huán)糊精對膽固醇都有不同程度的包被[28-29]。 產(chǎn)物轉化率最高的為添加羥乙基-β-環(huán)糊精 （HE-β-CD）組。 當 HE-β-CD 與膽固醇的摩爾比為 2∶1 時，產(chǎn)物的轉化率不僅是對照組（不添加環(huán)糊精）的60 倍，還比HE-β-CD 與膽固醇的摩爾比為1∶1 組的轉化率提高了59.42%。 與其他環(huán)糊精相比，羥乙基-β-環(huán)糊精（HE-β-CD）可能更有效包被了膽固醇的官能團，提高了與細菌細胞的接觸效率，從而提高了產(chǎn)物的轉化率。

2.3 紅外光譜檢測羥乙基-β-環(huán)糊精對膽固醇官能團的包埋

為了進一步表征HE-β-CD 對膽固醇官能團或部位的包埋情況，分別對膽固醇、HE-β-CD-膽固醇包合物（摩爾比為 2∶1）和 HE-β-CD 進行紅外光譜分析，結果見圖5。

圖5 紅外光譜分析羥乙基-β-環(huán)糊精包埋膽固醇效果Fig. 5 FT-IR spectra of HE-β-CD-embedded cholesterol

3 423.79 cm-1為膽固醇C3 位羥基伸縮振動吸收峰，在HE-β-CD/膽固醇包合物的紅外譜圖中，羥基伸縮振動吸收峰依然存在， 這說明羥基沒有被HE-β-CD 包埋； 而羥基伸縮振動頻率向低頻位移至 3 326.89 cm-1， 表明膽固醇與 HE-β-CD 的羥基之間可能形成了氫鍵。2 930.41、2 900.03、2 865.82、2 848.71 cm-1為飽和烴的C—H 伸縮振動吸收峰，在HE-β-CD/膽固醇包合物中， 這些吸收峰的強度明顯減弱，說明膽固醇該處基團被HE-β-CD 包結。膽固醇1 654.38 cm-1碳碳雙鍵吸收峰在HE-β-CD/膽固醇包合物中依然存在， 表明 C5 和C6 間的—C=C—沒有被包埋， 根據(jù)膽固醇的結構式分析，HE-β-CD 將膽固醇甾核 A 環(huán)包埋。

膽固醇 C26、27 位偕二甲基于 1 463.94、1 376.34 cm-1裂分為雙峰 （1 463.94、1 438.34 cm-1為一個甲基吸收峰；1 376.34、1 364.71 cm-1為另一個甲基吸收峰），雙峰信號在HE-β-CD/膽固醇包合物中幾乎消失， 表明側鏈的C26、27 位甲基均被HE-β-CD 包埋。

綜合上述，HE-β-CD 與膽固醇的摩爾比為 2∶1時之所以能夠提高膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉化率，可能是因為HE-β-CD 通過分子間的非極性共價鍵對底物膽固醇甾核的A 環(huán)、側鏈的C26 和C27 進行包被，形成穩(wěn)定的包結物（見圖6），進而提高了膽固醇與菌體的接觸效率[30]。

圖6 羥乙基-β-環(huán)糊精與膽固醇包結物構象示意圖Fig. 6 Schematic diagram of the conformation of hydroxyethyl-β-cyclodextrin and cholesterol inclusion complex

3 結 語

作者對Burkholderia cepaciaZWS15 轉化膽固醇的產(chǎn)物進行分離純化，通過LC-MS、FT-IR、NMR等技術進行結構鑒定，獲得了一種產(chǎn)物膽甾-4-烯-3，6-二酮。

通過考察 6 種環(huán)糊精 （α-CD、β-CD、γ-CD、M-β-CD、HE-β-CD、HP-β-CD）對菌體的影響，這幾種環(huán)糊精的添加幾乎不影響菌體的生長。

向轉化培養(yǎng)基中添加與膽固醇摩爾比為1∶1 的環(huán)糊精，發(fā)現(xiàn)添加 α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD 的體系中，膽甾-4-烯-3，6-二酮的轉化率約為對照組的1.75~3.95 倍；添加β-CD 種類的轉化體系中，M-β-CD 和HE-β-CD 的效果較好，轉化率分別為對照組的27.55 倍和37.95 倍。

進一步考察了HE-β-CD 與底物膽固醇摩爾比對產(chǎn)物轉化得率的影響， 發(fā)現(xiàn)當二者摩爾比為2∶1時， 膽甾-4-烯-3，6-二酮摩爾轉化率為 12.1%，比HE-β-CD 與膽固醇摩爾比為1∶1 的轉化率提高了59.42%。

對 2 mol HE-β-CD 與 1 mol 膽固醇的包合物進行紅外光譜分析，結果表明，膽固醇甾核的A 環(huán)及側鏈的C26、C27 信號在包合物中消失，推測可能是因為2 mol HE-β-CD 可通過分子間的非極性共價鍵與1 mol 膽固醇形成了穩(wěn)定的包結物， 這為HE-β-CD 在生物轉化合成膽甾-4-烯-3，6-二酮的工業(yè)應用提供了借鑒。