• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    限制性內(nèi)切酶NcoI 的高效重組表達(dá)、硒代與結(jié)晶條件初步篩選

    2021-07-28 08:44:38陳曉雨邵鈺晨楊雪麗李婷婷
    關(guān)鍵詞:質(zhì)量

    程 藝 , 馬 超 , 陳曉雨 , 邵鈺晨 , 王 瀟 ,楊雪麗 , 蘇 蓉 , 李婷婷 *

    (1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005)

    限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱“限制酶”)是現(xiàn)代基因工程中最基礎(chǔ)的一大類工具酶[1]。 天然來源的限制酶往往具有星號(hào)活性(即在非理想條件下限制酶的專一性發(fā)生改變)較強(qiáng)、反應(yīng)緩沖體系不一致等缺陷,所以研究者對(duì)限制酶的研究和改造一直沒有停止[2]。 不同限制酶之間的序列同源性很低,基本無法通過同源序列分析來確定核心催化位點(diǎn),因此解析限制酶蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和闡明限制酶的分子機(jī)制對(duì)后續(xù)定向改造具有重要的指導(dǎo)意義[3-4]。 然而,盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種限制酶,被商業(yè)化應(yīng)用的限制酶也達(dá)到300 種左右,但迄今為止僅有50 余種限制酶的三維結(jié)構(gòu)得到解析[5-8]。

    大多數(shù)限制酶蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量小于70 000,適合采用X 射線晶體衍射法解析三維結(jié)構(gòu)[9-10]。 由于限制酶具有切割DNA 的特性, 在對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)往往會(huì)使宿主DNA 被切割, 造成宿主菌的死亡,因此需要利用該限制酶對(duì)應(yīng)的甲基化酶對(duì)宿主DNA 進(jìn)行保護(hù), 從而獲得重組限制酶的大量表達(dá)[11]。 另一方面,由于限制酶彼此之間序列同源性低,無法參考已有的限制酶晶體結(jié)構(gòu),使用分子置換法來推算晶體衍射的相位,只能采用同晶置換法或反常散射法[12]。 同晶置換法需要制備大量蛋白質(zhì)晶體來摸索制備重原子衍生物的浸泡條件。 反常散射法在重組表達(dá)時(shí)制備蛋白硒代衍生物,通過在多個(gè)波長下收集硒原子邊緣的反常散射及其附近的衍射數(shù)據(jù),從而推算晶體衍射相位[13-14]。 雖然硒元素對(duì)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)及穩(wěn)定性均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響,硒代的效率也受諸多因素干擾[15],但由于其操作方便,研究時(shí)會(huì)首先選擇反常散射法。 目前在大腸桿菌中表達(dá)硒代蛋白可以選擇甲硫氨酸缺陷型表達(dá)菌株,或者阻斷甲硫氨酸合成通路,利用外源硒代甲硫氨酸獲得硒代蛋白。

    NcoI 是一種來源于珊瑚諾卡氏菌Nocardia corallina的Type II 類限制酶, 是常用的限制酶之一,迄今為止尚未有三維結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制相關(guān)的報(bào)道。 作者利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),重組表達(dá)了野生型NcoI 蛋白質(zhì)和硒代NcoI 蛋白質(zhì), 并嘗試以坐滴法篩選晶體生長條件,為下一步解析NcoI 的三維結(jié)構(gòu)、闡明其分子機(jī)制和定向改造提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    BL21 (DE3)pLysS、B834 (DE3)pLysS 和 pET-28b 質(zhì)粒載體: 購自武漢淼靈生物科技有限公司;λDNA、無縫克隆試劑盒等分子生物學(xué)試劑:購自莫納 (武漢) 生物科技有限公司;Ni 親和層析基質(zhì)(Toyopearl AF):購自東曹(上海)生物科技有限公司;UniGel-80Q:購自江蘇納微生物科技有限公司;HiLoad 16/60 Superdex 75pg 凝膠過濾預(yù)裝柱:購自美國GE 公司;蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖:購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒:購自美國Hampton Research 公司;其余化學(xué)試劑均為國藥分析純。JN-02 細(xì)胞高壓破碎儀:購自廣州聚能生物科技有限公司;Beckman Avanti J-26s XP 離心機(jī):購自 Beckman 公司;Invitrogen Qubit 4 熒光計(jì):購自 Thermo Fisher Scientific 公司;恒溫晶體生長拍照儀:購自美國Formulatrix 公司。

    1.2 方法

    1.2.1NcoI 重組蛋白的載體構(gòu)建 編碼II 型限制性內(nèi)切酶NcoI 的基因序列(UniProt ID:O85489)和甲 基 化 酶NcoIM 的 基 因 序 列 (UniProt ID:A0A077QMR0)經(jīng)人工合成,同時(shí)克隆至一個(gè)目標(biāo)載體pET-28b。 將重組質(zhì)粒pET28b-NcoI 通過熱激轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入 BL21 (DE3) pLysS 和 B834(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞。 因?yàn)閜ET-28b 載體上帶有卡那霉素的抗性基因, 而兩種表達(dá)菌株 BL21(DE3)pLysS 和 B834(DE3)pLysS 均自帶氯霉素抗性基因,所以經(jīng)卡那霉素和氯霉素雙抗性LB 平板篩選,獲得NcoI 重組表達(dá)菌株 BL21 (DE3) pLysS-NcoI 和B834(DE3)pLysS-NcoI。

    1.2.2NcoI 重組蛋白及其硒代蛋白的發(fā)酵NcoI重組蛋白的發(fā)酵:菌株 BL21(DE3) pLysS-NcoI 接種在LB 培養(yǎng)基中,經(jīng)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm為0.6~0.8,分別于 16、37 ℃加入 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),IPTG濃度分別為0.1、0.5、1.0 mmol/L 進(jìn)行最佳表達(dá)條件優(yōu)化。硒代NcoI 重組蛋白的發(fā)酵:菌株BL21(DE3)pLysS-NcoI 或者 B834 (DE3)pLysS-NcoI 在過渡培養(yǎng)基(LB 培養(yǎng)基與M9 培養(yǎng)基比例為2∶8)中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為 0.6~0.8,后轉(zhuǎn)移菌體至M9 培養(yǎng)基中,補(bǔ)加硒代甲硫氨酸至質(zhì)量濃度為0.05 g/L,在37 ℃適應(yīng)性培養(yǎng) 15 min, 于 16 ℃加入 IPTG(0.5 mmol/L) 誘導(dǎo)表達(dá) 16 h。 菌株 BL21(DE3)pLysS-NcoI 在過渡培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8, 后轉(zhuǎn)移菌體至 M9 培養(yǎng)基中, 補(bǔ)加苯丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸至各質(zhì)量濃度為0.1 g/L, 硒代甲硫氨酸0.05 g/L,在37 ℃適應(yīng)性培養(yǎng) 15 min, 于 16 ℃加入 IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá) 16 h。

    1.2.3NcoI 重組蛋白及其硒代蛋白的分離純化收集發(fā)酵菌體,用裂解緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,300 mmol/L NaCl) 重懸菌體并進(jìn)行高壓破碎,然后在 4 ℃下于14 000 r/min 離心30 min,收集上清液。 上清液經(jīng)鎳親和層析法初步純化后,進(jìn)行SDS-PAGE 驗(yàn)證是否有目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,然后用陰離子交換層析柱UniGel-80Q 進(jìn)一步純化。 最后蛋白質(zhì)經(jīng)HiLoad 16/60 Superdex 75pg 凝膠過濾預(yù)裝柱分離,收集相應(yīng)組分濃縮,進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由Invitrogen Qubit 4 熒光計(jì)精準(zhǔn)測(cè)定。 整個(gè)純化過程需要低溫環(huán)境。

    1.2.4NcoI 蛋白及其硒代蛋白的質(zhì)譜檢測(cè) 采用Agilent 6530 精確質(zhì)量四極桿飛行時(shí)間(Q-TOF)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) (美國 Agilent Technologies 公司)對(duì)NcoI 重組蛋白(1.5 mg/mL)和其硒代蛋白(1.5 mg/mL)進(jìn)行分析鑒定。 HPLC 分離條件: 使用 Agilent Zorbax C18 色譜柱, 流動(dòng)相是V乙腈∶V水∶V甲酸為2.0∶98.0∶0.1,柱溫 40 ℃,流量 1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。 質(zhì)譜檢測(cè)條件:電噴霧正離子掃描(ESI+),離子源溫度325 ℃,毛細(xì)管電壓3.5 kV,每隔0.33 s采集一次圖譜,質(zhì)量掃描范圍m/z為680~1 140。 質(zhì)譜檢測(cè)由中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所完成。

    1.2.5NcoI 蛋白及其硒代蛋白的酶活檢測(cè) 取NcoI 蛋白(10 μg/μL)和硒代蛋白(10 μg/μL)各1 μL,均以 0.3 μg λDNA 為底物,使用 CutOne 緩沖液(莫納(武漢)生物科技有限公司)配制成20 μL反應(yīng)體系,37 ℃溫育15 min, 隨即高溫失活,1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)底物的酶切結(jié)果。

    1.2.6NcoI 蛋白及其硒代蛋白結(jié)晶條件初篩 利用坐滴法對(duì)10 種蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒(Crystal Screen HR2-112、Crystal Screen Lite HR2-128、Crystal Screen HR2-110、Crystal Screen 2 HR2-112、Index-HR2-144、StatRx-HR2-107、SaltRx 2-HR2 -109、Natrix -HR2 -116、PEGRx1 -HR2 -082、PEGRx2-HR2-084)進(jìn)行初篩。NcoI 重組蛋白(純度>95%)濃縮至10 mg/mL,將蛋白質(zhì)溶液與結(jié)晶試劑按1∶1 比例混合,置于20 ℃恒溫晶體生長拍照儀中,每隔12 h 拍照記錄晶體生長情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 重組表達(dá)載體構(gòu)建

    限制性內(nèi)切酶NcoI 特異性識(shí)別和切割CCATGG 位點(diǎn),因此在大腸桿菌中重組表達(dá)會(huì)嚴(yán)重?fù)p害宿主DNA。 為避免重組表達(dá)的NcoI 蛋白質(zhì)對(duì)宿主的傷害, 同時(shí)表達(dá)了NcoI 的甲基化酶(NcoIM), 可以識(shí)別并甲基化NcoI 的切割位點(diǎn),被甲基化的DNA 特異性識(shí)別位點(diǎn)受到保護(hù), 從而避免限制性內(nèi)切酶的切割。在載體pET-28b 上同時(shí)構(gòu)建了NcoI 編碼基因和NcoIM 編碼基因,NcoI 編碼基因N 端帶有6×His 標(biāo)簽序列,見圖1。將構(gòu)建成功的 pET-28b(+)-NcoI 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS 以及甲硫氨酸缺陷型菌株B834(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序確定序列正確后,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

    圖 1 pET-28b(+)-NcoI 質(zhì)粒圖譜Fig. 1 Schematic map of pET-28b(+)-NcoI plasmid

    2.2 NcoI 重組蛋白的表達(dá)和純化

    將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒通過熱激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入 BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)菌株中,然后涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗性的LB 平板上,37 ℃下倒置培養(yǎng)12 h 后,隨機(jī)挑選若干單克隆進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的小量表達(dá)試驗(yàn)。 通過構(gòu)建的重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量,限制性內(nèi)切酶NcoI 重組蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為34 500,SDSPAGE 檢測(cè)不同條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)情況及表達(dá)量。 結(jié)果顯示,NcoI 重組蛋白在 16 ℃、0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)能獲得最多的可溶性蛋白質(zhì),且蛋白質(zhì)大小與預(yù)期一致,后續(xù)以此條件進(jìn)行蛋白質(zhì)的大量表達(dá),見表1。

    表1 不同誘導(dǎo)條件下每升發(fā)酵產(chǎn)物NcoI 重組蛋白的表達(dá)量Table 1 Expression of recombinant protein NcoI per liter of fermentation product under different induction conditions

    破碎后菌液上清液通過鎳親和層析后,經(jīng)SDS-PAGE 分析,目的蛋白質(zhì)存在于200 mmol/L 咪唑洗脫組分中,純度約80%,見圖2(a)。將含有目的蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行透析除去咪唑,樣品通過陰離子交換層析柱UniGel-80Q 得到了純度約90%的目的蛋白質(zhì),見圖2(b)。 濃縮樣品后通過分子篩凝膠層析和SDS-PAGE 進(jìn)行分析,所收集目的蛋白質(zhì)的純度超過95%,滿足蛋白質(zhì)結(jié)晶生長條件,見圖2(c)、(d),純化后重組NcoI 酶質(zhì)量濃度約為7.5 mg/L。

    圖2 重組NcoI 的表達(dá)與純化Fig. 2 Expression and purification of NcoI

    2.3 NcoI 硒代蛋白的表達(dá)和純化

    最常用硒代蛋白培養(yǎng)方法是利用甲氨酸缺陷型菌株,在培養(yǎng)基中引入硒代甲硫氨酸來置換重組蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸,其中大腸桿菌常用甲硫氨酸缺陷型菌株是B834[16]。 因此,作者先嘗試將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入B834(DE3)pLysS 感受態(tài)菌株中,并進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的小量表達(dá)試驗(yàn)。 經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè), 未發(fā)現(xiàn)NcoI 重組硒代蛋白 (Se-NcoI)的表達(dá)條帶,見圖 3(a)。 該實(shí)驗(yàn)表明,甲硫氨酸缺陷型菌株B834 不適合同時(shí)表達(dá)NcoI 重組蛋白和NcoIM 重組蛋白。 另外嘗試?yán)帽磉_(dá)NcoI 重組蛋白的相同菌株 BL21(DE3) pLysS-NcoI,僅在發(fā)酵過程中添加了硒代甲硫氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸,期望在抑制大腸桿菌甲硫氨酸本底合成的同時(shí)可以更好地利用外源硒代甲硫氨酸,從而獲得硒代NcoI(Se-NcoI)蛋白質(zhì)。 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)NcoI 重組硒代蛋白可以高效表達(dá),Se-NcoI 蛋白質(zhì)經(jīng)過3 個(gè)純化步驟:Ni 親和層析、 陰離子交換層析和分子篩凝膠層析,純度超過95%,Se-NcoI 蛋白酶質(zhì)量濃度約為 6 mg/L,見圖 3(b)、(c)。

    圖3 重組Se-NcoI 的表達(dá)與純化Fig. 3 Expression and purification of Se-NcoI

    重組蛋白的表達(dá)過程對(duì)外源添加的硒代甲硫氨酸的利用存在一定的概率,而且硒代甲硫氨酸對(duì)于大腸桿菌具有一定的毒性[17],然而結(jié)果表明NcoI重組蛋白和Se-NcoI 蛋白酶濃度差別不大, 因此需要測(cè)定Se-NcoI 蛋白質(zhì)中硒代甲硫氨酸的取代率。

    2.4 重組NcoI 蛋白質(zhì)及其硒代蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)

    利用飛行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn), 對(duì)重組NcoI 蛋白和Se-NcoI 蛋白進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定, 從而檢測(cè)Se-NcoI 蛋白質(zhì)中甲硫氨酸是否被硒代甲硫氨酸取代。對(duì)重組NcoI 蛋白和Se-NcoI 蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),見圖4。 將所得數(shù)據(jù)按照如下公式計(jì)算出蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。

    式中:X1與X2為相鄰的質(zhì)荷比,且X2>X1。

    經(jīng)計(jì)算,重組NcoI 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為34 510,與NcoI 理論相對(duì)分子質(zhì)量 34 500 相符。 重組Se-NcoI 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為34 744,與NcoI 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量差為234。 已知硒元素相對(duì)原子質(zhì)量為78.96,硫元素相對(duì)原子質(zhì)量為32.065,因此平均每分子Se-NcoI 蛋白質(zhì)中被硒原子取代的硫原子數(shù)量為 234/(78.96-32.065)=4.99。 由于重組NcoI蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含有5 個(gè)甲硫氨酸,每個(gè)甲硫氨酸殘基包含1 個(gè)硫原子,可以推測(cè)本批Se-NcoI蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸已經(jīng)全部被硒代甲硫氨酸取代,適合進(jìn)行后續(xù)的反常散射實(shí)驗(yàn)。

    2.5 NcoI 蛋白質(zhì)及其硒代蛋白的酶活檢測(cè)

    在獲得重組NcoI 以及Se-NcoI 蛋白質(zhì)之后,分別對(duì)其進(jìn)行酶活力檢測(cè),以驗(yàn)證硒代蛋白是否與野生型蛋白質(zhì)具有相同的生物學(xué)功能。 分別用10 μgNcoI 和 10 μg Se-NcoI 蛋白對(duì) 0.3 μg λDNA 進(jìn)行15 min 快速酶切。 瓊脂糖凝膠電泳均能顯示出明顯的特征酶切條帶,見圖 5(a)。 這與 Thermo Fisher 公司網(wǎng)址中公布的NcoI 特征酶切條帶相似, 見圖5(b),表明被完全硒代的Se-NcoI 蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性,即硒代并不影響NcoI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

    圖 4 NcoI 和 Se-NcoI 質(zhì)譜圖Fig.4 Serum mass spectrometry of NcoI and Se-NcoI

    圖5 NcoI 與Se-NcoI 的酶切活力驗(yàn)證Fig. 5 Digestion activity of NcoI and Se-NcoI

    2.6 NcoI 蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選

    將重組NcoI 蛋白和 Se-NcoI 蛋白濃縮至10 mg/mL,在20 ℃下通過坐滴法,采用10 種蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒篩選了528 種結(jié)晶生長條件。 樣品點(diǎn)樣后觀察,NcoI 在4 種條件下形成了初步的晶體。其中條件 a 為 0.1 mol/L 三水合醋酸鈉 (pH 4.6)、2.0 mol/L 甲酸鈉; 條件 b 為 0.1 mol/L 檸檬酸(pH 3.5)、25 g/dL PEG 3350; 條件 c 為 0.2 mol/L 硫酸銨、0.1 mol/L BIS-TRIS(pH 6.5)、 25 g/dL PEG3350;條件 d 為 0.8 mol/L 琥珀酸(pH 7.0)。 其中條件 a、b和c 下生長出的NcoI 蛋白質(zhì)晶體呈針狀, 見圖6(a)、(b)、(c),條件 d 下生長出的蛋白質(zhì)晶體呈顆粒狀,見圖 6(d),而 Se-NcoI 蛋白質(zhì)在此條件下未形成結(jié)晶。

    圖6 NcoI 的結(jié)晶條件的篩選Fig.6 Initial screening of crystallization conditions of NcoI

    條件b 和c 得到的單晶脆弱,因此無法撈取完整晶體。 條件d 得到的單晶分辨率差,低于0.8 nm。條件a 得到的單晶獲得衍射圖樣見圖7, 晶體存在明顯各向異性,一個(gè)方向大約在0.36 nm,另一個(gè)方向大約在0.8~1 nm,需進(jìn)一步優(yōu)化。

    圖7 重組NcoI X-射線衍射圖Fig. 7 X-ray diffraction image of NcoI

    3 討 論

    目前, 限制酶NcoI 在PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫里沒有找到同源結(jié)構(gòu), 若通過X-射線晶體衍射的方法解析NcoI 結(jié)構(gòu),除了需要獲得NcoI 的晶體,還需利用NcoI 同源結(jié)構(gòu)、同晶置換或者多波長散射的方法進(jìn)行NcoI 的結(jié)構(gòu)解析。通過在大腸桿菌中表達(dá)硒代甲硫氨酸取代甲硫氨酸的重組蛋白質(zhì)[18],結(jié)合多波長反常散射(MAD)的方法經(jīng)過X 射線衍射可以收集到異常散射原子的邊緣及其附近的數(shù)據(jù),能夠快速準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)生的相位角[19],從而進(jìn)行NcoI 的結(jié)構(gòu)解析。

    限制性內(nèi)切酶NcoI 對(duì)大腸桿菌體內(nèi)普遍存在的 DNA 甲基化酶基因dam和dcm均不敏感,若BL21(DE3)pLysS 菌株中只表達(dá)NcoI 重組蛋白,那么宿主DNA 會(huì)被NcoI 蛋白質(zhì)嚴(yán)重破壞。而NcoI 對(duì)應(yīng)的甲基化酶NcoIM 基因與限制性內(nèi)切酶基因共表達(dá),能夠使宿主DNA 獲得甲基化保護(hù),從而實(shí)現(xiàn)了重組NcoI 的大量表達(dá)。

    作者發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸缺陷型菌株B834 不適合同時(shí)表達(dá)NcoI 重組蛋白和NcoIM 重組蛋白。 這可能是B834 菌株中的基因型影響了NcoI 重組蛋白或者NcoIM 重組蛋白的表達(dá)。 有研究表明,高濃度的異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸能抑制天冬氨酸激酶活性,從而遏制大腸桿菌自身合成甲硫氨酸,且苯丙氨酸在此過程中起到協(xié)同作用[20]。因此,嘗試?yán)猛瑯颖磉_(dá)NcoI 重組蛋白的菌株BL21 (DE3) pLysSNcoI,僅在發(fā)酵過程中添加了硒代甲硫氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸,期望在抑制大腸桿菌甲硫氨酸本底合成的同時(shí), 可以更好地利用外源硒代甲硫氨酸,從而獲得硒代NcoI(Se-NcoI)蛋白質(zhì)。 經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),硒代蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與未硒代蛋白相差234, 符合硒原子取代5 個(gè)硫原子所增加的相對(duì)分子質(zhì)量。 因此判斷Se-NcoI 蛋白質(zhì)中的5 個(gè)甲硫氨酸全部被硒代甲硫氨酸取代。 盡管硒代法適用于大多數(shù)原核表達(dá)的蛋白質(zhì),但是硒代甲硫氨酸容易氧化,并且會(huì)取代能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的甲硫氨酸,導(dǎo)致硒代蛋白活性降低[21]。 作者對(duì)NcoI 及其硒代蛋白進(jìn)行酶活驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)NcoI 及其硒代蛋白都能消化底物λDNA, 且二者活性類似, 從而推測(cè)Se-NcoI 與NcoI 蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上類似。 作者采用在普通菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硒代甲硫氨酸及相關(guān)氨基酸的實(shí)驗(yàn)方案, 能夠獲得完全硒代的NcoI 蛋白質(zhì),無需特殊的甲硫氨酸缺陷型表達(dá)菌株,這也為獲得其他限制性內(nèi)切酶硒代蛋白表達(dá)提供了參考。

    X-ray 衍射法需要高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體, 而且晶體的生長與否依賴于蛋白質(zhì)純度的高低。 獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶的關(guān)鍵步驟是經(jīng)過蛋白質(zhì)高效表達(dá)以及分離純化出純度大于95%的蛋白質(zhì),但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的初步篩選沒有規(guī)律,一般需要蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒進(jìn)行高通量篩選[22]。 作者使用了10種蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒,共計(jì)528 個(gè)條件,對(duì)NcoI 的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件進(jìn)行了初篩,所得NcoI 晶體衍射的分辨率為0.8 nm 左右。分辨率低可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性較差, 或者均一性差。 后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化NcoI 的蛋白質(zhì)構(gòu)建和結(jié)晶條件, 篩選NcoI 的DNA配體, 并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行硒代Se-NcoI 的晶體生長,進(jìn)一步精細(xì)優(yōu)化條件,以獲得能產(chǎn)生良好衍射效果的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物晶體,解析NcoI 的三維結(jié)構(gòu), 以闡明NcoI 特異性識(shí)別并切割DNA 的機(jī)制。

    4 結(jié) 語

    作者利用限制性內(nèi)切酶NcoI 和甲基化酶NcoIM 的大腸桿菌共表達(dá)體系, 獲得了大量表達(dá)的限制性內(nèi)切酶NcoI, 其純度>95%, 酶質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL。 同時(shí),通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基M9 中添加高濃度的異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等,抑制大腸桿菌自身合成甲硫氨酸, 提高硒代甲硫氨酸的利用率,獲得了重組NcoI 硒代蛋白。 另外,NcoI 的完全硒代對(duì)活性無影響。通過結(jié)晶條件初篩得出NcoI 的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件,初步獲得衍射分辨率為0.8 nm 的NcoI 晶體,為后續(xù)分析結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)、闡明分子機(jī)制、進(jìn)行定向改造、獲得高效和無星號(hào)活性的突變蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    質(zhì)量
    聚焦質(zhì)量守恒定律
    “質(zhì)量”知識(shí)鞏固
    “質(zhì)量”知識(shí)鞏固
    質(zhì)量守恒定律考什么
    做夢(mèng)導(dǎo)致睡眠質(zhì)量差嗎
    焊接質(zhì)量的控制
    關(guān)于質(zhì)量的快速Q(mào)&A
    初中『質(zhì)量』點(diǎn)擊
    質(zhì)量投訴超六成
    汽車觀察(2016年3期)2016-02-28 13:16:26
    你睡得香嗎?
    民生周刊(2014年7期)2014-03-28 01:30:54
    中文字幕av成人在线电影| 村上凉子中文字幕在线| 国产爱豆传媒在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男人舔奶头视频| 日韩大片免费观看网站 | 高清在线视频一区二区三区 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 99在线人妻在线中文字幕| www日本黄色视频网| www.色视频.com| 亚洲综合色惰| eeuss影院久久| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲欧洲国产日韩| 精品久久久久久电影网 | 水蜜桃什么品种好| 一区二区三区乱码不卡18| 嫩草影院新地址| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久综合国产亚洲精品| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| www日本黄色视频网| av免费观看日本| 精品一区二区免费观看| 一级毛片久久久久久久久女| 99国产精品一区二区蜜桃av| 偷拍熟女少妇极品色| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲18禁久久av| 日韩大片免费观看网站 | 精品一区二区三区视频在线| 国产成人a区在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 波多野结衣巨乳人妻| 直男gayav资源| 女人被狂操c到高潮| 国产中年淑女户外野战色| 99热这里只有是精品在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲在线观看片| 99热这里只有是精品50| 久热久热在线精品观看| 国产精品久久久久久久久免| 天堂影院成人在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆 | 久久久久久伊人网av| 久久午夜福利片| 内地一区二区视频在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 色噜噜av男人的天堂激情| 美女大奶头视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| av在线观看视频网站免费| 国产高潮美女av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久 | av卡一久久| 国产高清有码在线观看视频| 国产视频首页在线观看| av视频在线观看入口| av女优亚洲男人天堂| 国产老妇伦熟女老妇高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产黄色小视频在线观看| 岛国在线免费视频观看| 国内精品宾馆在线| 亚洲五月天丁香| 日韩亚洲欧美综合| 99久久精品国产国产毛片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费观看的影片在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲欧洲国产日韩| 国产真实伦视频高清在线观看| av国产免费在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲欧美日韩高清专用| 麻豆一二三区av精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜激情福利司机影院| 国产伦一二天堂av在线观看| 少妇丰满av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩一区二区视频免费看| av在线蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久| 51国产日韩欧美| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久6这里有精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 看片在线看免费视频| 久久这里有精品视频免费| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧洲国产日韩| 插阴视频在线观看视频| 免费黄色在线免费观看| 免费在线观看成人毛片| 超碰97精品在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲国产精品国产精品| 伦精品一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| ponron亚洲| 亚洲欧美精品自产自拍| 美女大奶头视频| 国产精品三级大全| 亚洲精品影视一区二区三区av| 99热全是精品| 国产在线男女| 精品熟女少妇av免费看| 欧美bdsm另类| 色哟哟·www| 亚洲va在线va天堂va国产| 中文字幕制服av| 伦精品一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品久久久久久久久av| 久久久精品94久久精品| 免费搜索国产男女视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久99久视频精品免费| 成年av动漫网址| 色网站视频免费| 亚洲综合色惰| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 在线天堂最新版资源| 国产精品一及| 久久精品国产亚洲网站| av天堂中文字幕网| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久国产成人精品二区| 色综合色国产| 精品久久久久久久久av| 免费黄网站久久成人精品| 国产黄片美女视频| 国产一区二区在线观看日韩| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 午夜福利在线观看吧| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲av成人av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99久久成人亚洲精品观看| 天天一区二区日本电影三级| 日本五十路高清| 国产高清国产精品国产三级 | 看黄色毛片网站| av.在线天堂| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 我的老师免费观看完整版| av在线观看视频网站免费| 少妇的逼好多水| av视频在线观看入口| 麻豆成人午夜福利视频| 99热这里只有精品一区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品,欧美在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 哪个播放器可以免费观看大片| 一二三四中文在线观看免费高清| 99久久精品一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩欧美三级三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 69av精品久久久久久| 久久草成人影院| 成人午夜精彩视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产高清国产精品国产三级 | 老司机影院毛片| 国产亚洲91精品色在线| 女人被狂操c到高潮| 亚洲中文字幕日韩| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费看日本二区| 在线天堂最新版资源| 欧美性猛交黑人性爽| 乱系列少妇在线播放| av黄色大香蕉| 欧美日本视频| 久久精品91蜜桃| 亚洲真实伦在线观看| 亚州av有码| 美女cb高潮喷水在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品人妻久久久久久| 在线观看一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 黄色一级大片看看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 91久久精品国产一区二区三区| 日本免费a在线| 男插女下体视频免费在线播放| 老司机福利观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久99精品国语久久久| 中国国产av一级| 日本黄色片子视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲国产精品专区欧美| 日韩av在线大香蕉| 午夜久久久久精精品| 九九在线视频观看精品| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲国产色片| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩视频在线欧美| 国产爱豆传媒在线观看| 舔av片在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 乱系列少妇在线播放| 亚洲国产精品国产精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 嫩草影院新地址| 婷婷色av中文字幕| 91精品一卡2卡3卡4卡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产亚洲最大av| 国产乱来视频区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲av日韩在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 免费观看的影片在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 一区二区三区高清视频在线| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 九九爱精品视频在线观看| 免费av不卡在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲人与动物交配视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产精品成人综合色| 观看免费一级毛片| .国产精品久久| 最新中文字幕久久久久| 久久久久九九精品影院| 99热这里只有是精品50| 国产精品无大码| 青春草亚洲视频在线观看| 午夜激情欧美在线| 97超碰精品成人国产| 看非洲黑人一级黄片| 免费搜索国产男女视频| 免费看av在线观看网站| 国产成人精品久久久久久| 国产亚洲91精品色在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 内射极品少妇av片p| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美激情在线99| 国产一级毛片在线| 亚洲av日韩在线播放| 听说在线观看完整版免费高清| 女人被狂操c到高潮| 白带黄色成豆腐渣| 高清日韩中文字幕在线| 精品欧美国产一区二区三| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品人妻视频免费看| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲在线观看片| 国产三级中文精品| 偷拍熟女少妇极品色| 午夜福利成人在线免费观看| 高清午夜精品一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品91蜜桃| av免费在线看不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 少妇高潮的动态图| 最近最新中文字幕免费大全7| 三级毛片av免费| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 最新中文字幕久久久久| 欧美色视频一区免费| 内射极品少妇av片p| 色综合色国产| 久久精品影院6| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 色尼玛亚洲综合影院| 在线天堂最新版资源| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品久久久久久久久免| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费观看人在逋| 亚洲国产精品久久男人天堂| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人freesex在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲av不卡在线观看| 全区人妻精品视频| 长腿黑丝高跟| 婷婷色av中文字幕| 欧美区成人在线视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲久久久久久中文字幕| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一级毛片我不卡| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产 一区精品| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品乱久久久久久| 超碰97精品在线观看| 插逼视频在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲精品一区蜜桃| 只有这里有精品99| 一区二区三区免费毛片| 午夜精品一区二区三区免费看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 精品国产一区二区三区久久久樱花 | videos熟女内射| 久久精品91蜜桃| 久久精品综合一区二区三区| 成人二区视频| 伦理电影大哥的女人| 国产一区二区在线观看日韩| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久久精品大字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲最大成人手机在线| 国产成人freesex在线| 久久久久久大精品| 国产色爽女视频免费观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲国产最新在线播放| 精品酒店卫生间| or卡值多少钱| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲自拍偷在线| 人妻少妇偷人精品九色| 国产老妇女一区| 日本免费a在线| 国产久久久一区二区三区| 22中文网久久字幕| 一区二区三区免费毛片| 国产精品99久久久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 国产视频内射| av福利片在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 黄片wwwwww| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久久久久久久免费av| 天堂√8在线中文| 国产人妻一区二区三区在| 中文资源天堂在线| 99热网站在线观看| 一本一本综合久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 免费黄色在线免费观看| 亚洲成色77777| 麻豆国产97在线/欧美| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲精品自拍成人| 国产成人a∨麻豆精品| 国产午夜精品一二区理论片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av专区在线播放| 亚洲成人精品中文字幕电影| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩三级伦理在线观看| 久久人人爽人人片av| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 男人和女人高潮做爰伦理| av在线亚洲专区| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲网站| 黄色日韩在线| 我要搜黄色片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品人妻久久久影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久久久久九九精品二区国产| 久久6这里有精品| 国产探花极品一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 我的老师免费观看完整版| 欧美性猛交黑人性爽| 在线播放国产精品三级| 国产熟女欧美一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲自偷自拍三级| kizo精华| 亚洲国产精品成人综合色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久色成人| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲av男天堂| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产乱来视频区| 少妇被粗大猛烈的视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 秋霞伦理黄片| 美女内射精品一级片tv| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩欧美 国产精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品国产三级专区第一集| 99久国产av精品| 99热网站在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产精品熟女久久久久浪| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男人狂女人下面高潮的视频| av免费在线看不卡| 久久久久久久久中文| 校园人妻丝袜中文字幕| 插逼视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 草草在线视频免费看| 联通29元200g的流量卡| 午夜亚洲福利在线播放| 日本免费在线观看一区| 国产乱来视频区| 精品国产三级普通话版| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一级毛片久久久久久久久女| 小说图片视频综合网站| 久久精品夜色国产| 热99在线观看视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 18禁在线播放成人免费| 精品不卡国产一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美激情在线99| 大话2 男鬼变身卡| 女人被狂操c到高潮| 国产精品一及| 97超碰精品成人国产| 六月丁香七月| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品456在线播放app| 美女黄网站色视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 超碰97精品在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av熟女| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 99热6这里只有精品| 亚洲精品成人久久久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩国内少妇激情av| 男人的好看免费观看在线视频| 日本五十路高清| 国产乱人偷精品视频| 淫秽高清视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 小说图片视频综合网站| 麻豆乱淫一区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人一区二区视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品综合久久久久久久免费| 成人亚洲精品av一区二区| 变态另类丝袜制服| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久网色| 色噜噜av男人的天堂激情| 成人一区二区视频在线观看| 欧美激情在线99| 91久久精品电影网| 国产精品久久久久久久久免| 久久精品影院6| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品一区www在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 国产在线一区二区三区精 | 99热这里只有是精品50| 一夜夜www| 精品一区二区三区人妻视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 网址你懂的国产日韩在线| 最近的中文字幕免费完整| 热99在线观看视频| 97超碰精品成人国产| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲自拍偷在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 岛国在线免费视频观看| 边亲边吃奶的免费视频| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品一二三区在线看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 我要看日韩黄色一级片| 伦精品一区二区三区| 嫩草影院新地址| 在线观看66精品国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕亚洲精品专区| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产色婷婷99| 中文字幕熟女人妻在线| 国产成人freesex在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 边亲边吃奶的免费视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 99在线人妻在线中文字幕| 久久这里有精品视频免费| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费看光身美女| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 男插女下体视频免费在线播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 超碰97精品在线观看| 黄片wwwwww| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲美女视频黄频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品成人久久久久久| 国产乱人偷精品视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一级爰片在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产亚洲精品av在线| 国产成人a∨麻豆精品| 永久网站在线| 国产视频内射| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 欧美成人免费av一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 97超视频在线观看视频| 精品久久久噜噜| 久久久久久大精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 最近视频中文字幕2019在线8| 91狼人影院| av在线播放精品| 在线天堂最新版资源|