新金色分枝桿菌CRISPR 基因編輯技術(shù)的構(gòu)建及其初步應(yīng)用

林 春 ， 童麗珍 ， 楊套偉 ， 邵明龍 ，張 顯 ， 徐美娟 ， 廖祥儒 *， 饒志明 ，

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122）

關(guān)鍵字： 新金色分枝桿菌；CRISPR；基因編輯；轉(zhuǎn)錄激活

近年來， 新金色分枝桿菌（Mycobacterium neoaurum） 已成為甾體激素類藥物的生物合成平臺(tái)之一。 甾體藥物被廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕、心血管疾病、淋巴性白血病、人體器官移植、抗腫瘤、細(xì)菌性腦炎、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)等疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011 年甾體激素藥物銷售額已高于280 億美元，約占全球醫(yī)藥總銷售額的6%，成為產(chǎn)量第二大類藥物，僅次于抗生素[2-3]。 隨著甾體藥物價(jià)格的穩(wěn)定，采用生物技術(shù)生產(chǎn)甾體藥物逐漸成為主流。 作者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到了一株甾體藥物的高產(chǎn)菌株新金色分枝桿菌， 并對該菌株的研究取得了一定的進(jìn)展，然而進(jìn)一步調(diào)控新金色分枝桿菌甾醇代謝方式急需探索出新的基因編輯技術(shù)。

目前應(yīng)用于分枝桿菌基因編輯的技術(shù)主要依賴于等位基因交換、 同源重組和非黏性末端修復(fù)。等位基因交換是兩步重組過程：第一步，使用抗生素抗性標(biāo)記分離攜帶整合到宿主基因組中的整個(gè)遞送載體的單交換；第二步，分離雙交換，其可以具有兩個(gè)基因等位基因中的任一個(gè)，以去除標(biāo)記[4]。 通過同源重組獲得目的基因敲除突變株也是對分枝桿菌進(jìn)行基因編輯的有力工具。 但是，分枝桿菌同源重組的發(fā)生率比其他細(xì)菌明顯低很多，僅為10-6~10-5。利用廣泛的自殺式載體pNIL/pGOAL 系列質(zhì)粒用于構(gòu)建無標(biāo)記缺失突變菌株也可以實(shí)現(xiàn)目的基因的阻斷或者敲除[5]。NHEJ 是 DNA 雙鏈斷裂（DSB）的主要修復(fù)途徑，它往往容易在連接位點(diǎn)插入或缺失突變，并產(chǎn)生破壞靶基因的移碼突變。 與同源重組相比，NHEJ 系統(tǒng)不依賴于重組蛋白質(zhì)或同源DNA 模板，它是高等生物維持基因組穩(wěn)定性的主要DNA 修復(fù)系統(tǒng)[6]。Gupta 等報(bào)道了 NHEJ 介導(dǎo)的染色體I-Sce I 誘導(dǎo)的DSB 的修復(fù)，修復(fù)效率為25%。然而，雙I-Sce I 位點(diǎn)首先必須置于靶基因內(nèi)，并且ISce I 引入編碼質(zhì)粒以產(chǎn)DSB，總基因組編輯周期約為15 d[7]。

近年來隨著基因編輯的新型魔術(shù)刀——CRISPR （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）編輯技術(shù)的問世，為微生物的基因工程改造提供了新手段，CRISPR/Cas 系統(tǒng)的主要功能元件有兩部分：其一是用于切割目標(biāo)靶點(diǎn)DNA的Cas 核酸酶； 另一個(gè)是能與標(biāo)靶DNA 互補(bǔ)配對的 小 型 向 導(dǎo) RNA （sgRNA）[9]。 其 中 基 于 Ⅱ 型CRISPR/Cas 系統(tǒng)研發(fā)作為切割DNA 雙鏈的工具已經(jīng)獲得研究者們的青睞，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于大腸桿菌、斑馬魚、擬南芥、釀酒酵母等物種的基因編輯中[8]。 Cas 是一種 DNA 核酸酶，位于 CRISPR 序列旁邊，RNA 引導(dǎo)的核酸酶可以識(shí)別和切割靶基因以產(chǎn)生DNA 斷裂。 在沒有DNA 模板的情況下，可以通過在相應(yīng)的同源模板或NHEJ 存在下的同源重組來修復(fù)斷裂[10]。 最近，研究者已經(jīng)證明CRISPR/dCas9（失活的Cas 蛋白）可以控制恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中的基因表達(dá)[11-12]。 有研究表明，CRISPRCas12a 輔助的同源重組系統(tǒng)進(jìn)行恥垢分枝桿菌的基因組編輯時(shí)， 引入位點(diǎn)直接突變的效率高達(dá)80%，而結(jié)合雙鏈模板DNA 的重組、刪除或者插入效率可達(dá)到 37%~75%[11，13]。

本研究是自主構(gòu)建CRISPR/Cas 系統(tǒng)， 通過多方式的改進(jìn)以兩質(zhì)粒體系構(gòu)建用于新金色分枝桿菌的基因編輯。 為確保質(zhì)粒在分枝桿菌中能穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，采用了含有分枝桿菌來源的復(fù)制子OriM的表達(dá)載體pMV261 作為骨架結(jié)構(gòu)；并對3 種不同性質(zhì)的Caseffactor 蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析， 使用了和新金色分枝桿菌同源性較高的谷氨酸棒桿菌基因組優(yōu)化的 spCas9cg 作為 Caseffactor， 其 GC 含量為53%， 與新金色分枝桿菌基因組的GC 含量62%相近。 作者選取了Mycobacterium neoaurumJC-12 菌株甾醇代謝途徑的關(guān)鍵基因ksdd作為實(shí)現(xiàn)基因組水平的基因編輯目標(biāo)位點(diǎn)，首先通過PCR 驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證初步測定了基因的敲除， 再通過RT-qPCR、HPLC 以及酶活檢測定量評價(jià)了此編輯系統(tǒng)。 結(jié)果顯示，經(jīng)初步優(yōu)化后的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可應(yīng)用于新金色分枝桿菌的基因組編輯，該系統(tǒng)也顯示出在非模式菌株中應(yīng)用的潛力，為諸多野生型菌株提供了代謝工程改造的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

M.neoaurumJC-12： 作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選并保存； 大腸桿菌JM109 和DE3 以及分枝桿菌表達(dá)載體pMV261：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；其余菌株及實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒：見表1。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 菌株的培養(yǎng)

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng) LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物 5，NaCl 10；如需固體培養(yǎng)基，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂。 旋轉(zhuǎn)式搖床180 r/min、37 ℃。轉(zhuǎn)化子篩選條件：加入卡那霉素至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，氯霉素為 10 μg/mL，鏈霉素為 100 μg/mL。

1.2.2 新金色分枝桿菌的培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 5，牛肉膏 5，甘油 15，NaCl 15，pH 7.0；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨10，K2HPO4·3H2O 3，MnCl20.000 5，MgSO4·7H2O 0.2，植物甾醇 10，環(huán)糊精 30，pH 7.0（250 mL 三角瓶，裝液量 50 mL）；感受態(tài)制備培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)0.2% Tween 80。 旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、30 ℃。 轉(zhuǎn)化子篩選條件：加入卡那霉素終質(zhì)量濃度為 30 μg/mL，氯霉素為 10 μg/mL，鏈霉素為 30 μg/mL。

1.2.3 甾醇產(chǎn)量的測定 新金色分枝桿菌JC-12降解植物甾醇的主要產(chǎn)物是 AD 和 ADD，AD 和ADD 在254 nm 處均有吸收峰， 因此可采用高效液相色譜（HPLC）檢測，具體測定方式參照文獻(xiàn)[14]。

1.2.4 KSDD 酶活的測定 采用PMS-DCPIP 法測定 KSDD 酶活[14]。 KSDD 脫去底物 AD 的兩個(gè)氫生成ADD， 蛋白質(zhì)自身的FAD 接受脫去的 2H+和2e-成 FADH2，然后 FADH2 將 DCPIP 還原，DCPIP 在600 nm 處有吸收峰。3 mL 反應(yīng)混合物由 100 μL 粗酶液、50 mmol/L 的 Tris-HCl（pH 7.0）、40 μmol/L 的DCPIP、1.5 mmol/L 的 PMS、500 μmol/L AD（溶于體積分?jǐn)?shù)2%的甲醇）所組成，檢測600 nm 處的吸光值變化。 酶活單位定義：將在1 min 內(nèi)還原1 μmol DCPIP 所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3 主要試劑與儀器

基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒：購自上海捷瑞生物工程有限公司；抗生素、阿拉伯糖、2，6-二氯酚靛酚（DCPIP）及吩嗪硫酸甲酯（PMS）等：購自阿拉丁試劑公司；Taq 酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等：購自TaKaRa 公司；植物甾醇（大豆甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）：購自禮來生物技術(shù) （湖州） 有限公司；ADD 及 AD 標(biāo)準(zhǔn)樣品： 購自Sigma 公司； 一步法克隆試劑盒、RT-qPCR 試劑盒及相關(guān)用品： 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR 儀：購自 Eppendorf Mastercycler nexus X2；電轉(zhuǎn)化儀：購自 BIO-RAD pulse controller（Gene Pulser）；熒光定量 PCR 儀： 購自 StepOnePlus；HPLC 高效液相色譜儀：購自島津LC-20AB。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建與基因的克隆

1.4.1 CasEffactor 的選擇與表達(dá)載體的構(gòu)建 以pCas9 為模板，P1/P2 為引物克隆出 wtCas9； 以 pC為模板，P3/P4 為引物克隆出Sp-Cas9cg （為谷氨酸棒桿菌密碼子優(yōu)化的Cas9 基因）； 以pJYS1 為模板，P5/P6 為引物克隆出Fn-Cpf1cg 基因；以上基因的克隆均用高保真酶Phanta Max Master Mix （購自南京 Vazyme）， 再將BamH I 線性化 pMV261 載體與 Cas Factor 表達(dá)框架通過 ClonExpress II One Step Cloning Kit（購自南京Vazyme）構(gòu)建組成型的表達(dá)Cas 效應(yīng)蛋白質(zhì)的載體 pMV261-spCas9wt、pMV261-spCas9cg、pMV261-FnCpf1。 通過蘇州金唯智生物科技有限公司合成了LigD和mku基因。 通過P7/P8 和P9/P10 引物將LigD和mku基因融合成Pj23119-LigD-mku-rrnB 表達(dá)框架， 再通過 Clon-Express II One Step Cloning Kit 將 NHEJ 表達(dá)框架構(gòu)建到Cas 表達(dá)載體上得到pML-Cas9。

1.4.2 sgRNA 載體的構(gòu)建 以ptrc99A-Spc 載體為基本骨架， 以P11/P12 從pMV261 載體上克隆得到OriM， 以 P13/P14 克隆得到 sgRNA 框架 168 bp，ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit 將 OriM、sgRNA 連接得到 pMJ-sgRNA。 通過根據(jù)靶序列sgRNA 軟件 CRISPR/Cas9 gRNA Finder 設(shè)計(jì)靶向ksdd基因CDS 區(qū)的sgRNA 以及靶向啟動(dòng)子區(qū)域的sgRNA。通過P15/P16 引物以pMJ-sgRNA 為模板克隆出靶向ksdd編碼區(qū)的pMJ-sgRNA，命名為pMJ-sgRNA1-ksdd，通過 P17/P18 引物 pMJ-sgRNA 為模板克隆出靶向ksdd啟動(dòng)子區(qū)的pMJ-sgRNA， 命名為pMJ-sgRNA2-ksdd。 將純化后的PCR 產(chǎn)物通過Solution I（Takara，上海）連接后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，并通過測序鑒定sgRNA 的N20 序列，所用引物見表2。

表2 本研究中所用的引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表2

1.5 運(yùn)用CRISPR 技術(shù)介導(dǎo)的基因編輯

1.5.1 CRISPR/Cas 介導(dǎo)的分枝桿菌基因組基因的敲除 新金色分枝桿菌JC-12 用于構(gòu)建突變菌株，其感受態(tài)的制作方法以及電轉(zhuǎn)方法見文獻(xiàn)[14]。 首先將構(gòu)建完整的pMLcas9 載體轉(zhuǎn)化到新金色分枝桿菌JC-12 中， 通過PCR 驗(yàn)證挑取含有 pMLcas9的轉(zhuǎn)化子，將其轉(zhuǎn)接到含有3 μg/mL 卡那霉素的分枝桿菌感受態(tài)種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h， 再轉(zhuǎn)接到分枝桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6~8 h 至OD 為0.6~0.8，回收菌體制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)。電轉(zhuǎn)時(shí)將300 ng 的pMJ-sgRNA1 載體加到感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔混勻，冰上放置30 min 后加到預(yù)冷的1 mm電轉(zhuǎn)杯中， 在2.2 kV 的條件下放入電轉(zhuǎn)儀 （Bio-Rad）中電轉(zhuǎn)，向電擊杯中加入900 μL 液體培養(yǎng)基，混勻并全部轉(zhuǎn)移至EP 管中，30 ℃搖床復(fù)蘇4~6 h；離心收集細(xì)胞，去除部分上清液，涂布于含30 μg/mL卡那霉素和30 μg/mL 鏈霉素抗性的固體平板上，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5~7 d，轉(zhuǎn)化子用PCR 驗(yàn)證。

1.5.2 利用CRISPR-activate 調(diào)控分枝桿菌基因組水平的表達(dá) Cas9 核酸酶剪切活性取決于結(jié)構(gòu)域RuvC 和HNH。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割DNA 鏈的兩條鏈， 通過對這兩個(gè)位點(diǎn)定點(diǎn)突變， 即得到dCas9（D10A&H840A），命名為 pdCas9。 從新金色分枝桿菌中用P23/P24 克隆得到轉(zhuǎn)錄激活因子α 亞基，然后利用Gibson 組裝通過linker（GGTGGCGGA GGGT CAGGTGGCGGA）將轉(zhuǎn)錄激活因子α 亞基偶聯(lián)到 dCas9 末端，得到 pdCas9-α 載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR-Cas 系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建

按照上述方法將擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行融合連接轉(zhuǎn)化，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后，將質(zhì)粒進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，出現(xiàn)特異性條帶，大小正確，后續(xù)的重組質(zhì)粒測序結(jié)果正確，見圖1。

圖1 新金色分枝桿菌CRISPR-Cas 雙質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)Fig. 1 CRISPR-Cas double plasmid system of Mycobacterium neoaurum

2.2 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在新金色分枝桿菌中的表達(dá)與穩(wěn)定性分析

將上述構(gòu)建完整的pML-SpCas9wt、pML-SpCas9cg和pML-FnCpf1cg載體分別電轉(zhuǎn)到新金色分枝桿菌JC-12 中， 通過抗性平板篩選出轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，分別對Caseffactor 表達(dá)框架用相應(yīng)的引物進(jìn)行驗(yàn)證，見圖2。 電泳結(jié)果證明，上述質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)入新金色分枝桿菌中，進(jìn)一步通過RT-qPCR驗(yàn)證了 Caseffactor 和sgRNA 的轉(zhuǎn)錄。 研究發(fā)現(xiàn)，野生型Cas9 質(zhì)粒在新金色分枝桿菌中不能穩(wěn)定遺傳。 為進(jìn)一步探索不同Caseffactor 對新金色分枝桿菌的菌株的影響，作者分析了同等條件下對新金色分枝桿菌生長的影響，結(jié)果見圖3。 發(fā)現(xiàn)spCas9wt對新金色分枝桿菌的生長是有影響的， 而spCas9cg和FnCpf1cg對生長的影響相對較小， 因而后期實(shí)驗(yàn)中采用spCas9cg作為本研究的Caseffactor。

圖2 新金色分枝桿菌Caseffactor 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證與RT-PCR 驗(yàn)證Fig. 2 Caseffactor transformant validation and RT-PCR validation of Mycobacterium neoaurum

圖3 不同Caseffector 對新金色分枝桿菌生長的影響Fig. 3 Effect of different caseffector on the growth of Mycobacterium neoaurum

2.3 基因突變菌株的鑒定

將上述構(gòu)建好的Caseffactor 表達(dá)載體和sgRNA 載體按1.5.1 的方法轉(zhuǎn)入到新金色分枝桿菌中， 篩選得到轉(zhuǎn)化子后， 挑取對應(yīng)的單菌落并用P27/P28 引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，初步判定敲除了ksdd基因，然后挑取單克隆于30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)5 d，用細(xì)菌DNA 提取試劑盒對突變株提取基因組DNA，以突變株基因組DNA 為模板，同樣用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增， 獲得了敲除ksdd基因成功的菌株，并將PCR 產(chǎn)物送至金維智生物科技有限公司測序，結(jié)果見圖4。

圖4 突變菌株的PCR 驗(yàn)證圖與測序結(jié)果Fig. 4 Verification and sequencing results of mutant strains

2.4 突變菌株的生長與甾醇轉(zhuǎn)化效率及酶活的分析

對上述驗(yàn)證正確的敲除菌株轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，測定菌株的生長曲線變化。 如圖5 所示，突變型和野生型新金色分枝桿菌在生長上無顯著差異。 將KSDD 突變菌株轉(zhuǎn)接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng) 5 d， 在48 h 和96 h 取樣測定ADD 和AD 的產(chǎn)量，結(jié)果見圖6—7。ksdd敲除菌株已經(jīng)完全不產(chǎn)ADD，而且AD 的產(chǎn)量相比于野生型菌株提高了25%左右。 突變株的發(fā)酵結(jié)果也間接反映了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在新金色分枝桿菌中成功應(yīng)用于基因組的敲除。 同時(shí)對突變株的KSDD 的酶活進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖8。 突變株Mutksdd的酶活下降了80%左右。

圖5 突變菌株生長曲線Fig. 5 Growth curve of mutant strain

圖6 ADD 產(chǎn)量對比Fig. 6 Comparison with the production yield of ADD

圖7 AD 產(chǎn)量對比Fig. 7 Comparison with the production yield of AD

圖8 KSDD 酶活的對比Fig. 8 Comparison of the KSDD activity

2.5 ksdd 在不同轉(zhuǎn)錄激活因子下的表達(dá)調(diào)控分析

將突變后的dCas9 與RNA 聚合酶α 亞基偶聯(lián)后轉(zhuǎn)入到新金色分枝桿菌中，針對ksdd起始密碼子前-29、-83、-141 位置的設(shè)計(jì) 3 個(gè) sgRNA， 分別命名為 Ca-g1、Ca-g2、Ca-g3，并將其轉(zhuǎn)入到含 dCas9-α質(zhì)粒的新金色分枝桿菌中。 篩選得到轉(zhuǎn)化子后將轉(zhuǎn)化子接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d， 取樣用于RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 9。 dCas9-α 對ksdd轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控有顯著的影響， 其中靶向于-29 位點(diǎn)對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了一定程度的抑制，而靶向-83 位點(diǎn)和-141 位點(diǎn)則對ksdd的轉(zhuǎn)錄水平有了顯著提升。 同時(shí)對不同調(diào)控位點(diǎn)對甾醇產(chǎn)物的變化進(jìn)行了96 h 發(fā)酵分析， 對ksdd的轉(zhuǎn)錄調(diào)控使得AD 和ADD 的產(chǎn)量在-83 位點(diǎn)分別提升了26%和25%，在-141 位點(diǎn)分別提升了29.5%和36%， 而靶向-29位點(diǎn)卻無顯著變化，這與不同靶點(diǎn)的ksdd的表達(dá)水平也是吻合的，見圖10。 但總體而言，對ksdd的調(diào)控未達(dá)到理想效果，具體原因可能需進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)此CRISPRa 體系。

圖9 CRISPRa 對ksdd 的轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig. 9 Transcription changes of ksdd regulated by CRISPRa

圖10 CRISPRa 對甾醇產(chǎn)物的變化Fig. 10 Transcription changes of sterol products regulated by CRISPRa

3 結(jié) 語

作者構(gòu)建了可在新金色分枝桿菌這一重要甾醇藥物合成微生物基因組中實(shí)現(xiàn)敲除和插入等編輯功能的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，基于該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對新金色分枝桿菌甾醇藥物代謝途徑中的重要中間體AD 和ADD 合成的關(guān)鍵基因ksdd的單基因敲除與基因組水平的表達(dá)調(diào)控，該系統(tǒng)參考相關(guān)類似的研究[15-16]，以分枝桿菌表達(dá)載體pMV261，該載體含有一個(gè)分枝桿菌復(fù)制原點(diǎn)OriM 和大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)OriE，能夠在大腸桿菌和分枝桿菌中穩(wěn)定復(fù)制和表達(dá)； 以此載體為骨架分別用Pj23119 和tac 啟動(dòng)子表達(dá)了NHEJ 修復(fù)框架和Cas9 表達(dá)框架，并重新構(gòu)建了一個(gè)含有OriM 的在強(qiáng)啟動(dòng)子下sgRNA 表達(dá)載體。 將雙質(zhì)粒體系導(dǎo)入到新金色分枝桿菌中，表達(dá)產(chǎn)生的Cas9 和轉(zhuǎn)錄形成的目標(biāo)靶向sgRNA 結(jié)合靶向目標(biāo)靶點(diǎn)對其進(jìn)行切割，致使基因組形成雙鏈DNA 斷裂（Double strand breakage，DSB），絕大多數(shù)細(xì)胞因此死亡。 由于介入了NHEJ 修復(fù)從而激活NHEJ 的修復(fù)，Ku 蛋白復(fù)合物識(shí)別結(jié)合到DSBs 末端， 再招募 DNAligase4 （LigD） 將 DSB 末端連接。NHEJ 雖能高效連接修復(fù)斷裂DNA， 但是也能造成不確定性的缺失從而導(dǎo)致基因的缺失。 而轉(zhuǎn)錄激活是參考CRISPR-Cas9 的這種形式引入轉(zhuǎn)錄激活因子， 從而招募更多的RNA 聚合酶使得靶向基因的表達(dá)水平提高[17]。 作者構(gòu)建的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)初步實(shí)現(xiàn)了新金色分枝桿菌的基因編輯，開拓了新金色分枝桿菌的基因編輯方式，從而為進(jìn)一步探索和提升分枝桿菌甾醇代謝途徑和相關(guān)基因提供了依據(jù)。

雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對新金色分枝桿菌的基因敲除，但是未達(dá)到理想效果。 首先未對Cas9 的表達(dá)在新金色分枝桿菌中做相對的優(yōu)化以及對NHEJ 的修復(fù)效率做進(jìn)一步的提升，初期實(shí)驗(yàn)篩選過程中出現(xiàn)未敲除菌株和敲除菌株的混合菌落，有其他研究者也出現(xiàn)過類似情況[18]，究其原因是大多數(shù)原核微生物缺乏DSB 斷裂修復(fù)方式導(dǎo)致產(chǎn)生DNA 斷裂的菌株不能修復(fù)而死亡，使得脫靶的菌株能夠以優(yōu)勢菌存活，通過引入HDR 或者NHEJ 修復(fù)可以顯著提升敲除菌株的存活；其次對于sgRNA 的脫靶率是該領(lǐng)域一直探索的問題，本研究中為降低脫靶效應(yīng)帶來的影響，參考了相關(guān)的研究[19]，在設(shè)計(jì)靶向目標(biāo)靶點(diǎn)區(qū)域的序列設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA。

近年來隨著研究者在Cas 蛋白的功能與新型Cas 蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)， 研究者Choudhary. Eira 等人通過對化膿性鏈球菌原始dCas9 中的191 個(gè)密碼子進(jìn)行修飾以及采用四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pmyctet0， 使得dCas9 穩(wěn)定表達(dá)同時(shí)降低了dCas9對菌體生長的影響[11]。 Jeremy M. Rock 等人通過對11 種不同來源的Cas9 蛋白的篩選， 鑒定出其中4種對分枝桿菌靶向基因敲除是廣泛適用的，而來自嗜 熱 鏈 球 菌 （Streptococcus thermophilus） 的CRISPR1 Cas9（dCas9Sth1）介導(dǎo)的基因敲除率低，是穩(wěn)定的且具有最小的蛋白質(zhì)毒性[13]。 2015 年張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)掘了 CRISPR 家族的新成員—Cas12a（Cpf1），隨后Mei-Yi Yan 等人使用CRISPR-Cas12a 輔助的同源重組系統(tǒng)進(jìn)行恥垢分枝桿菌的基因組編輯時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)的Cpf1 蛋白對恥垢分枝桿菌的生長并無顯著影響[12]。 這些研究也將為進(jìn)一步完善新金色分枝桿菌CRISPR/Cas 系統(tǒng)提供參考依據(jù)， 進(jìn)一步改進(jìn)和應(yīng)用其他編輯效率更高的Cas蛋白，完善以及提升新金色分枝桿菌的CRISPR/Cas基因編輯工具，為新金色分枝桿菌的基因組水平的研究和功能探索提供高效的方法。