D-阿洛酮糖酶法生產的研究進展

李 勉 ， 唐文娟 ， 蔡 雪 ，， 程新平 ， 柳志強

（1. 浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 310013；2. 浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014）

1 D-阿洛酮糖概述

D-阿洛酮糖（D-allulose）屬于己酮糖，是D-果糖的C-3 差向異構體，因其較高的甜度和較低的能量以及獨特的生理功能和潛在的健康益處，D-阿洛酮糖被認為是具有較大潛力的新型甜味劑，已成為全球范圍內稀有糖生物合成領域的研究熱點。 然而，D-阿洛酮糖在自然界中存在量極其稀少， 化學法合成困難，而生物合成法步驟簡單，近些年有較大的突破。 因此，作者綜述了D-阿洛酮糖在近年內的生物合成研究進展， 包括D-阿洛酮糖的理化性質、生理功能、應用、體內代謝以及生物酶法生產涉及關鍵酶的來源、酶學性質、晶體結構、催化機理、異源表達、D-阿洛酮糖的分離與純化工藝。

1.1 D-阿洛酮糖的理化性質與來源

D-阿洛酮糖是一種六碳糖，熔點為96 ℃，易溶于水，密度為1.35 g/cm3[1]。D-阿洛酮糖的甜味是蔗糖甜味的70%[2]。D-阿洛酮糖是一種還原糖，能夠參與熱處理過程中的褐變反應。 經(jīng)大鼠實驗測得D-阿洛酮糖的熱值為0.029 kJ/g， 能量為蔗糖的0.3%，這表明D-阿洛酮糖的能量近乎為零[3-4]。

D-阿洛酮糖在自然界中非常罕見，植物來源極其稀少[5]，在某些細菌中也有發(fā)現(xiàn)少量阿洛酮糖[6]，動物中不存在D-阿洛酮糖。然而，D-阿洛酮糖也出現(xiàn)在各種食品中， 如經(jīng)過長期加熱處理的果汁，并且D-阿洛酮糖在各類食品中的含量與生產過程中的糖濃度、溫度和加熱時間密切相關[2，7]。

1.2 D-阿洛酮糖的生理功能與體內代謝

D-阿洛酮糖的生理功能包括： 減少膳食D-果糖和D-葡萄糖的吸收[8-9]；增強胰島素抵抗[7，10-11]；抗肥胖活性[12-14]；降血脂[15]。D-阿洛酮糖在大鼠體內的代謝途徑研究表明：1）D-阿洛酮糖在腸道內的轉運由葡萄糖轉運體5 型介導， 其相對于D-果糖親和力較低[16-18]；2）D-阿洛酮糖不參與葡萄糖的相關代謝[19]；3）D-阿洛酮糖在動物肝臟中無法代謝，進而無法促進肝臟能量的產生[20]。大約98%的D-阿洛酮糖通過口服或靜脈注射后以尿液和糞便這兩種形式從體內排出， 只有少量D-阿洛酮糖在盲腸微生物的作用下分解為短鏈脂肪酸[21]。

1.3 D-阿洛酮糖的應用

D-阿洛酮糖在2011 年被美國FDA 批準為“一般認為安全的”（GRAS，Generally Regarded As Safe）產品，并被允許作為食品配料和膳食補充劑[4，7]。 研究表明，D-阿洛酮糖最大攝入量每天每千克體質量為0.55 g，在此范圍內不會導致人類腹瀉[8-9]。

D-阿洛酮糖因其低熱量、高甜度、還原性強等特性，在食品行業(yè)具有廣闊的市場潛力。例如，D-阿洛酮糖通過美拉德反應可全面改善蛋清蛋白的性質，如優(yōu)異的凝膠強度、乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡性能和抗氧化活性等[22-23]。D-阿洛酮糖也可以改善發(fā)酵乳制品的品質， 調節(jié)過度發(fā)酵導致酸奶帶有的強烈酸味，但不影響發(fā)酵菌株的益生菌活性及其賦予發(fā)酵產品的益生健康功效[21]。 另外，在烘焙過程中使用25%的D-阿洛酮糖，配合使用其他添加劑，可生產無糖蛋糕[24]。

D-阿洛酮糖在其他領域也有廣泛的應用潛力。例如， 以D-阿洛酮糖為原料的植物基材料可用作光學設備和液晶顯示器的永久性、防水、環(huán)保、透光薄膜[25]。D-阿洛酮糖還是第一種被發(fā)現(xiàn)的糖類驅蟲劑，在抑制寄生蟲生長方面有一些積極作用[26-27]。D-阿洛酮糖也是其他己糖的前體，對D-阿洛糖[28-29]、D-阿洛糖醇[30]的生產起著極其重要的作用。

2 D-阿洛酮糖的生產

2.1 生物酶法

D-阿洛酮糖的化學合成法具有分離困難、副產物多、化學廢物的產生等較難克服的共性缺點。 因此，綠色與環(huán)保的生物酶法生產逐漸受到了世界范圍內廣泛的關注。

2.1.1 DTEase 家族酶的來源D-塔格糖-3-差向異構酶家族（DTEases）是一種催化酮單糖C3 位置使其發(fā)生異構化的酶，也是生產稀有糖的核心酶[32]。

DTEase 家族酶包括：D-塔格糖3-差向異構酶（D-tagatose 3-epimerase，DTEases）[33]，D-阿洛酮糖3-差向異構酶（D-allulose 3-epimerase，DAEase）[35]，酮糖 3-差向異構酶（Ketose 3-epimerase）[36]，這些酶都具有共同特性即能夠催化D-果糖轉化為D-阿洛酮糖。

DTEase 酶的編碼基因已相繼從Clostridium cellulolyticumH10[37]、Ruminococcussp.[38]、Clostridium scindens[34]以及Desmosporasp.[35]中分離鑒定出來，但仍需要進一步挖掘更多來源和更高效酶活的DTEase[32，37，39-40]用于D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產。

2.1.2 DTEase 的酶學性質 在DTEase 家族酶中，D-阿洛酮糖-3-差向異構酶（DTEase）在催化D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的反應中具有最高的效率。來自C. cellulolyticum和A. tumefaciens的 DAEases催化效率（Kcat/Km）分別為 186.4、205 L/（mmol·min），高于來自Clostridiumsp.的DTEase（D-塔格糖3-差向異構酶）的催化效率（141.4 L/（mmol·min））和來自Ruminococcussp.的催化效率（51 L/（mmol·min））[34，37-38]，見表1。

表1 DTEase 家族酶的酶學特性Table 1 Enzymatic properties of DTEases

金屬離子通過結合D-果糖進行固定，在D-果糖轉化為D-阿洛酮糖過程中起著至關重要的作用。Asp183 和His209 殘基通過金屬離子與底物進行有效結合。 DTEase 家族酶金屬離子Mn2+、Co2+和Mg2+的依賴程度明顯不同[41，44-45]。 然而，C.cellulolyticum中的 DAEase 和C. scindens中的 DTEase 酶活的發(fā)揮嚴格依賴于金屬離子 Mn2+和 Co2+[35，37]。

2.1.3 DTEase 的晶體結構 在DTEase 家族酶中，來自A. tumefaciens和C. cellulolyticum中 DAEases展現(xiàn)出最緊密的四聚體形式。 在DAEase 的四聚體中， 氨基酸殘基在2 個亞基之間形成34 個氫鍵，DAEase 的高催化活性歸因于寬的界面溶劑可及區(qū)域， 這是由DTEase 家族酶中兩個二聚體之間的廣泛相互作用引起的[42]。 此外，重組菌株表達的DAEase 仍表現(xiàn)出優(yōu)異的酶學性能。 來自C. cellulolyticumH10 中的DAEase 異源表達具有較長的半衰期、較高的動力學參數(shù)和較高的熱穩(wěn)定性[37]。

DAEase 的四聚體排列是由 A、B、C、D 共 4 個相同亞基組成的一個不對稱單元。 活性位點含有4個殘基的金屬離子， 八面體配位2 個水分子。 這4個亞基是與晶體對稱相關的二聚體，其中亞基A 和D 相互作用， 兩者都與亞基 B 和 C 密切接觸。DAEase 的活性位點暴露在二聚體的同一前側。 這些穩(wěn)定的二聚體提供了一個很好的可接近表面，以便結合在二聚體正面上的底物[16]。

活性位點的疏水性溝槽和可接近的表面位于A亞基和B 亞基之間。 DAEase 的亞基側是封閉的，并在桶狀結構的兩端暴露。在DAEase 的四聚體中，兩個二聚體是封閉在桶狀結構側面。每個單體（A、B、C和 D 亞基）是由 8 個（β/α）結構的重復單位組成。 每個單體由13 個α-螺旋和8 個β-折疊組成，形成單體的主要結構[16]。

2.1.4 DTEase 的催化機理 DTEase 家族酶的催化作用取決于各亞基的分子排列，它們的活性位點位于底物上，以實現(xiàn)高效的酶反應。Mn2+和2 個水分子及 4 個氨基酸（Glu、Asp、His 和 Glu）形成八面體配位，這4 個氨基酸殘基在所有酮糖3-差向異構酶中完全保守。 來自A. tumefaciens中的 DAEase 和P.cichorii中的 DTEase 上的 6 個殘基（Glul50/Glul52、Aspl83/Aspl85、His209/His211、Glu244/Glu246、Glul56/ Glu158、His185/His188） 在位點定向誘變中對底物結合和熱穩(wěn)定性起著重要作用。

催化底物取代水分子后，活性位點發(fā)生差向異構化。兩個殘基Glul50 和Glu244 在Mn2+的協(xié)作下，D-果糖C3 上的質子被去除，生成D-阿洛酮糖的順式二元醇中間體，D-阿洛酮糖從DAEase 活性位點上的氫鍵和水分子之間的位置釋放出來。

目前， 對DTEase 家族酶進行分子修飾以提高其催化活性和熱穩(wěn)定性。 定點誘變是為了提高來自Caldicellulosiruptor obsidiansis中的L-鼠李糖異構酶在生產D-阿洛酮糖方面的熱穩(wěn)定性和催化行為， 在β1-α1-loop 中的疏水殘基被極性氨基酸全部取代， 與野生型酶相比，V48N/G59N/I63N 和V48N/G59N/I63N/F335S 突變體的相對活性分別提高了 105.6%、134.1%[57]。 定點誘變還提高了來自Doreasp. 中的D-阿洛酮糖-3-差向異構酶（DAEase）的熱穩(wěn)定性[50]。

對DTEase 家族酶的催化機理方面的研究還處于初步階段，酶結構與催化功能之間的關系有待進一步深入研究。 此外，DTEase 的熱穩(wěn)定性和底物特異性仍存在一些不足。 在稀有糖的生產中，應進一步利用DTEase 家族酶的底物特異性， 以實現(xiàn)功能性稀有糖的高效綠色生產。

2.1.5 DTEase 的異源表達 大多數(shù)DTEase 家族酶從細菌中鑒定和分離，在天然菌株中表達的酶的數(shù)量遠遠不能滿足應用的要求。 因此，在特征研究和酶學應用中構建表達載體并在異源生物中表達具有重要意義。

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母通常被用來構建DAEase 表達的重組系統(tǒng)。與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌沒有外膜，其分泌的蛋白質可以直接釋放到培養(yǎng)基中， 且枯草芽孢桿菌的安全性為食品級，分泌的蛋白質中沒有摻雜熱源性脂多糖（內毒素）。工程菌大腸桿菌E. coli具備遺傳背景清晰、載體受體系統(tǒng)完整、生長迅速、培養(yǎng)簡單、重組體穩(wěn)定等優(yōu)點。 此外，酵母表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)條件簡單、生長速度快、表達水平高、操作簡單等特點，翻譯后可對蛋白質進行加工和正確的修飾。 酵母表達系統(tǒng)的不足在于克隆基因表達低、發(fā)酵時間長、蛋白質糖基化錯誤、抗細胞分裂等，且上清液中多糖濃度過高不利于重組蛋白質的純化。

早期研究人員傾向于使用大腸桿菌作為宿主細菌來研究DTEase 家族酶的表達和酶學性質[34，37]。最近，許多研究人員將枯草桿菌和酵母菌作為宿主細菌來表達DTEase 家族酶，用于D-阿洛酮糖的生產[35]。 將來源于A. tumefaciens中的 DAEase 基因于E. coli和K. marxianus中重組表達后用于阿洛酮糖生產，D-阿洛酮糖的產量分別達到230 g/L[53]和190 g/L[56]。 經(jīng)比較，用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達A. tumefaciens中的DAEase 酶是目前為止表達量最高的，見表2。

表2 工程菌酶法生產D-阿洛酮糖Table 2 Bio-production of D-allulose by engineered strains

1）大腸桿菌表達系統(tǒng)：大腸桿菌表達系統(tǒng)具有成本低以及表達效率高的優(yōu)點。DTEase 家族酶在大腸桿菌中可進行可溶性過表達，用親和層析分離和純化重組的DTEase 酶，D-阿洛酮糖的產量在120~218 g/L，轉化率為24%~33%[34]。 利用全細胞反應法在重組大腸桿菌中表達Agrobacterium tumefaciens中的DAEase 酶，其產量和轉化效率分別為230 g/L和33%[53]。

2）芽孢桿菌表達系統(tǒng)：攜帶DAEase 編碼基因的重組枯草芽孢桿菌能以高效率和低成本的方式過表達DAEase 酶。 固定于陰離子交換樹脂基質上的重組DAEase 能夠促進阿洛酮糖的穩(wěn)定高效生產。 在枯草芽孢桿菌B. subtilis中表達的重組DAEase 酶活為 58.6 U/mg，高于大腸桿菌（8.95 U/mg）。此外，DAEase 的表達調節(jié)元件也影響酶的數(shù)量和活性。 在枯草芽孢桿菌B. subtilis中， 載體pMA5-Pxy/A-RDPE 能持續(xù)性地表達出酶活 95 U/mL 的DAEase。 該 值 高 于 在 大 腸 桿 菌E.coli中 以pBluescript-SK-DTE為載體表達的酶活值[54]。

3）酵母表達系統(tǒng)：外源DAEase 基因可在重組S. cerevisiae[55]和Kluyveromyces marxianus[56]中 高 效表達。 攜帶來自A.tumefaciens的 DAEase 基因的pRS424-TEFpr-ss-xy/A 的表達載體可以在S. cerevisiaeAN120 中表達出相對分子質量33 000的蛋白質[55]。T. thermophilus中的木糖異構酶基因和A. tumefaciens中的DAEase 基因在酵母孢子中共表達以增強協(xié)同催化作用。 將這兩種重組酶進行固定化，并以D-葡萄糖為底物來生產D-阿洛酮糖[55]。重組木糖異構酶催化D-葡萄糖轉化生成D-果糖，重組DAEase 將D-果糖轉化為D-阿洛酮糖。 Yang 等人提供了一條有價值的途徑來再生改造過的K. marxianus細胞， 從而能夠以循環(huán)催化方式來生產D-阿洛酮糖[56]。重組的K. marxianus在 12 h 內以底物質量濃度為750 g/L 的D-果糖生產出190 g/L的D-阿洛酮糖， 約100 g 殘留的D-果糖被工程菌轉化為34 g 的乙醇。 此外，還通過全細胞反應提供了以循環(huán)催化方式生產D-阿洛酮糖生產的想法[56]。

2.2 D-阿洛酮糖的分離與純化

D-阿洛酮糖的分離純化主要包括以下兩種方法：

第一種方法是離子交換樹脂。 采用陰離子交換樹脂基質和同步移動床層析法對DAEase 酶進行固定化，以D-果糖為底物生產D-阿洛酮糖。 采用離子交換樹脂透析法，R. sphaeroidesSK011 細胞能夠以初始底物質量濃度為50 g/L 的D-果糖生產出6.5 g/L 的D-阿洛酮糖[39]，生產速率為 0.82 g-1·h-1。對于含有D-阿洛酮糖和D-果糖的混合系統(tǒng)，首先將D-果糖轉化為葡萄糖酸， 然后通過陰離子交換樹脂得到純度為91.2%的D-阿洛酮糖[57]。

第二種方法采用生物法純化D-阿洛酮糖。 在含有D-阿洛酮糖和D-果糖混合體系中，利用酵母消耗殘留的D-果糖生產乙醇，進而得到D-阿洛酮糖。 此外，將滲透蒸發(fā)技術、陽離子交換色譜法和生物法相結合，對D-阿洛酮糖進行分離純化，其純度可達86.2%[58]。

3 討 論

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3 差向異構體，具有諸多生理功能，在食品、醫(yī)藥和保健等領域有著廣泛應用。 2019 年4 月美國FDA 通過了將阿洛酮糖排除在添加糖和總糖計數(shù)外的利好措施后，各大企業(yè)開始對阿洛酮糖產生了極大的興趣。 目前，全球D-阿洛酮糖的主要生產商韓國希杰第一制糖株式會社、英國泰萊和日本松谷集團都采用生物方法生產D-阿洛酮糖。 因此，構建可催化產D-阿洛酮糖的基因工程菌是實現(xiàn)D-阿洛酮糖產業(yè)化的重要基礎。 盡管目前阿洛酮糖還只能在個別國家合法使用，但無疑它將成為未來甜味劑領域中的“巨星”。

盡管D-阿洛酮糖的生物酶法研究已經(jīng)取得了很大突破，尤其是基因挖掘和細胞構建技術發(fā)展迅速， 但是生物法制備D-阿洛酮糖的工業(yè)化前景依然不容樂觀。 后續(xù)的研究可以從以下兩方面入手：1） 通過基因挖掘的方法篩選具有較高活性和較高穩(wěn)定性的DTEase 家族酶， 建立高效的高通量篩選法，對DTEase 家族酶進行分子改造，使其更能滿足工業(yè)化的需求，從而實現(xiàn)D-果糖與D-阿洛酮糖的高效轉化；2） 由于工業(yè)上制備D-阿洛酮糖面臨著酶催化后的混合液中去除殘留D-果糖的問題，分離純化D-阿洛酮糖增加了其生產成本。 目前有關D-阿洛酮糖的分離純化、結晶等技術類的研究比較少，表明下游的產業(yè)化相對滯后，需要通過簡化下游的工藝步驟，如分離純化、結晶、干燥等工藝步驟進一步降低D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產成本和提高D-阿洛酮糖的生產效率。

圖1 展示了較為先進的D-阿洛酮糖綠色可回收的工藝技術[16]。整個反應體系在生物反應器A（用于蔗糖水解和D-阿洛酮糖酶法轉化） 和生物反應器B（用于乙醇生產、D-阿洛酮糖分離和酵母增殖）之間進行。 以未加工的甘蔗汁或甜高粱汁為原料生產蔗糖，使用的工程酵母菌含有天然的蔗糖酶和重組的外源DTEase 家族酶基因， 因此工程酵母能夠通過蔗糖酶水解蔗糖生產D-葡萄糖和D-果糖，D-果糖在55~60 ℃被DTEase 家族酶轉化為D-阿洛酮糖，而剩余的D-葡萄糖和D-果糖在27~30 ℃被發(fā)酵生成乙醇，乙醇收集后可作為燃料使用。 該方法的優(yōu)點為原料成本低，盡可能利用過程中產生的中間產品，減少了繁瑣的分離純化步驟，同時減少了廢物形成，降低能耗，提高了糖產量。

圖1 D-阿洛酮糖的綠色、可回收的工藝技術路線Fig. 1 Green and recycling process for D-allulose conversion and ethanol production

4 展 望

目前在中國、日本、韓國、美國和英國，D-阿洛酮糖已經(jīng)實現(xiàn)了噸級工業(yè)化生產。 生產D-阿洛酮糖的企業(yè)要在激烈的行業(yè)競爭中脫穎而出，必須提升工藝流程中各個環(huán)節(jié)的技術。 目前主要的生產壁壘在于異構酶的活性不高、轉化率低和重復利用頻率低。 因此，提高酶活性、穩(wěn)定性和催化效率應該是未來DTEase 家族酶研究和開發(fā)的關鍵目標。 通過脫色、脫鹽、結晶、干燥等工藝的改進，降低D-阿洛酮糖的生產成本。 采用高效的高通量篩選技術進行合理的設計或改變不合理的工藝是改變DTEase 家族酶結構的直接途徑。 通過對DTEase 家族酶的改良和生產工藝的改進， 可以降低D-阿洛酮糖的生產成本、降低其價格，從而保證D-阿洛酮糖能夠方便地供給廣大消費者。