殺菌劑咯菌腈對(duì)根腐病的室內(nèi)毒力測(cè)定和田間防治效果

婁天成 左楊 張心寧 余文杰 孫凱 劉永鋒 劉郵洲

摘要：根腐病是生產(chǎn)中的一種重要的土傳真菌病害，為明確藥劑咯菌腈對(duì)根腐病的防效，給生產(chǎn)上提供合理有效的用藥方案。采用室內(nèi)離體試驗(yàn)和田間小區(qū)試驗(yàn)相結(jié)合的方式，進(jìn)行25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑對(duì)根腐病的室內(nèi)毒力測(cè)定和田間防效試驗(yàn)。結(jié)果表明，咯菌腈對(duì)病原菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和高粱鐮孢菌（Fusarium andiyazi）菌絲生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxyporum）菌絲生長(zhǎng)的抑制作用次之，對(duì)層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）菌絲生長(zhǎng)無抑制作用。在25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑按照使用劑量200、400、600 g/100 kg種子進(jìn)行大豆根腐病的防治試驗(yàn)中，出苗后10 d，對(duì)大豆根腐病的防效為75.60%～90.58%;出苗后30 d，對(duì)大豆根腐病的防效為69.61%～84.43%;出苗后60 d，對(duì)大豆根腐病的防效為58.37%～75.31%。隨著用量的增加防效顯著提高，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效具有顯著差異。在25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑進(jìn)行花生根腐病防治試驗(yàn)中，出苗后10 d，咯菌腈低、中、高3個(gè)使用劑量對(duì)花生根腐病的防效為61.26%～83.79%;出苗后30 d，對(duì)花生根腐病的防效為56.18%～79.30%;出苗后60 d，對(duì)花生根腐病的防效為49.76%～69.78%，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效具有顯著差異。此外，對(duì)照藥劑350 g/L精甲霜靈種子處理乳劑的平均防效與咯菌腈低劑量防效相當(dāng)，30 g/L苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑的防效與咯菌腈中劑量防效相當(dāng)。結(jié)果表明，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑能有效防治大豆根腐病和花生根腐病，隨著時(shí)間的推移，其防效呈逐漸下降趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：根腐病;咯菌腈;抑制作用;田間防效;懸浮種衣劑;毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S482.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）11-0080-05

收稿日期：2021-01-04

基金項(xiàng)目：江蘇省蘇州市科技計(jì)劃（編號(hào)：SNG2018095）;2020年度江蘇省第五期“333工程”科研項(xiàng)目（編號(hào)：BRA2020256）。

作者簡(jiǎn)介：婁天成（1991—），男，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事殺菌劑開發(fā)和利用研究。Tel：（025）84390230;E-mail：714386158@qq.com。

通信作者：劉郵洲，博士，研究員，主要從事植物病害生物防治與農(nóng)藥開發(fā)研究。Tel：（025）84390230;E-mail：shitouren88888@163.com。

根腐病是生產(chǎn)中一種重要的土傳真菌病害，病原菌主要包括疫霉菌、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、鐮孢菌（Fusarium spp.）等，以尖孢鐮孢菌（F. oxyporum）、茄腐鐮孢菌（F. solani）為主，此外，其他鐮孢菌如高粱鐮孢菌（F. andiyazi）、禾谷鐮孢菌（F. graminearum）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）等也可引起根腐病[1-2]。根腐病寄主范圍廣，可危害小麥、玉米、大豆、花生等多種作物，在我國各大產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，平均發(fā)病率在10%～30%之間，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%～60%，甚至絕產(chǎn)[1，3]。該病害主要發(fā)病部位在植株根部及維管束，染病后植株矮化，葉色發(fā)黃萎蔫，病株根部變褐腐爛，進(jìn)而導(dǎo)致植株死亡[4-5]。根腐病病原菌在田間植株病殘?bào)w、土壤內(nèi)可以長(zhǎng)期存活，根腐病一旦發(fā)生，往往很難防治[6-7]。

種衣劑處理是防治土傳（種傳）病害的一種有效措施，具有防效高、成本低、使用方便等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，還能有效延緩或避免病原菌抗藥性的產(chǎn)生，因此被廣泛應(yīng)用于作物的種子處理[1]?？┚妫╢ludioxonil）別稱氟咯菌腈，商品名Maxim等，1994年由諾華（現(xiàn)先正達(dá)）公司開發(fā)和上市，是一種安全、高效、低毒的吡咯類殺菌劑[8]?？┚媸呛芏嗉賳伟置诘奶烊灰志镔|(zhì)——硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）的類似物，但是它與硝吡咯菌素相比，對(duì)光線敏感性明顯降低，不易光解，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要真菌病害的防治[9-10]。

本研究測(cè)定25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑對(duì)引起根腐病的立枯絲核病病菌和6種鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)抑制作用，同時(shí)開展咯菌腈拌種處理對(duì)大豆根腐病和花生根腐病的田間小區(qū)防治試驗(yàn)，為生產(chǎn)上有效防治根腐病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

立枯絲核菌、高粱鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、茄腐鐮孢菌、藤倉鐮孢菌（F. fujikuroi）、層出鐮孢菌，以上菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

病原菌的培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（200 g 馬鈴薯、10～20 g葡萄糖、17～20 g瓊脂、1 000 mL 水）。

1.1.3 供試藥劑

25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑、30 g/L 苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司）、350 g/L精甲霜靈種子處理乳劑（山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司）。

1.1.4 試驗(yàn)品種

大豆品種為徐豆18號(hào)，花生品種為徐花5號(hào)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備

將咯菌腈用丙酮（分析純）配制成10 000 μg/mL的母液，依次稀釋至一定濃度（分別是20、100、200、1 000、2 000 μg/mL）的藥液，再將25 μL各個(gè)濃度的藥液和母液與50 mL PDA固體培養(yǎng)基分別混合后倒培養(yǎng)皿，制成含不同梯度濃度的含藥平板（分別是0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5 μg/mL）。

1.2.2 毒力測(cè)定

參照農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則，采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法[11-12]進(jìn)行毒力測(cè)定。將實(shí)驗(yàn)室保存的各病原菌在PDA平板上活化生長(zhǎng)，28 ℃溫度 條件下培養(yǎng)3～7 d。沿菌落邊緣用無菌打孔器打孔，獲得直徑為5 mm的菌餅。在上述含藥平板中央接種病原菌菌絲塊，菌絲面朝下，置培養(yǎng)箱中恒溫28 ℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，設(shè)丙酮和空白對(duì)照。待空白對(duì)照菌落長(zhǎng)至平皿直徑約80%時(shí)，采用“十” 字交叉法量取各處理菌落直徑，計(jì)算菌落直徑平均值，按照以下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)平均抑制率：

菌絲生長(zhǎng)平均抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌餅直徑）/（對(duì)照菌落直徑-5 mm）× 100%。

將菌絲生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)換成幾率值，將藥劑濃度換算成對(duì)數(shù)值，以幾率值為毒力回歸方程應(yīng)變量y，藥劑濃度對(duì)數(shù)值為毒力回歸方程自變量x，計(jì)算毒力回歸方程和各藥劑的EC50。

1.2.3 咯菌腈對(duì)大豆根腐病和花生根腐病的防治試驗(yàn)

大豆試驗(yàn)于2020年5月中旬至7月底在江蘇省徐州市睢寧縣雙溝鎮(zhèn)陳王村進(jìn)行。露天種植，土壤為沙壤土，肥力水平中等。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，其中25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑設(shè)置3個(gè)用量處理，分別為200、400、600 g/100 kg種子;350 g/L精甲霜靈種子處理乳劑和30 g/L苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑按照常規(guī)使用劑量各設(shè)1個(gè)處理，分別為80、500 g/100 kg種子。另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照。于2020年5月18日大豆播種前拌種包衣，晾干后進(jìn)行播種。隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)面積為25 m2，重復(fù)4次，共計(jì)24個(gè)小區(qū)。按照67.5 kg/hm2的播種量進(jìn)行人工點(diǎn)播，行距為50 cm，株距為10 cm。各小區(qū)大豆長(zhǎng)勢(shì)較好且均勻一致，肥水管理及病蟲害防治按常規(guī)進(jìn)行，試驗(yàn)期間不再施用其他防治大豆根腐病的藥劑。

花生試驗(yàn)于2020年6月初至10月中旬在江蘇省睢寧縣雙溝鎮(zhèn)陳王村進(jìn)行。露天種植，土壤為沙壤土，肥力水平中等。試驗(yàn)處理同上。于2020年6月5日花生播種前對(duì)花生種子拌種包衣，晾干后進(jìn)行播種。隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)面積為20 m2，重復(fù)4次，共計(jì)24個(gè)小區(qū)。按照9 000穴/畝（1 hm2=15畝）的種植密度進(jìn)行播種，每穴2～3粒。各小區(qū)花生長(zhǎng)勢(shì)較好且均勻一致，肥水管理按常規(guī)進(jìn)行，試驗(yàn)期間不再施用其他防治花生根腐病的殺菌劑。

調(diào)查方法和藥效計(jì)算方法參照GB/T17980.88—2004《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（二）》第88部分：殺菌劑防治大豆根腐病的藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則進(jìn)行，在大豆或花生出苗后10、30、60 d分別調(diào)查防效。

按照每小區(qū)隨機(jī)挖取大豆或花生植株不低于30株，記錄總株數(shù)及各級(jí)病株數(shù)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：

0級(jí)：植株莖基部和主根均無病斑;1級(jí)：植株莖基部和主根上有少量病斑;3級(jí)：植株莖基部和主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1/4～1/2;5級(jí)：植株莖基部和主根上病斑較大，病斑面積占莖和根總面積的1/2～3/4;7級(jí)：植株莖基部和主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未死亡;9級(jí)：植系壞死，植株地上部萎蔫或死亡。

病情指數(shù)=[∑（各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×9）]×100;

防治效果=[（空白對(duì)照病情指數(shù)×處理區(qū)病情指數(shù)）/空白對(duì)照病情指數(shù)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 咯菌腈對(duì)根腐病病菌的室內(nèi)抑制作用

由圖1可知，咯菌腈對(duì)大多數(shù)參試的病原菌均有一定的抑制作用，但對(duì)不同病原菌的抑制能力有所不同。當(dāng)咯菌腈濃度為0.01～1.00 μg/mL時(shí)，對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為7.66%～90.43%，對(duì)高粱鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為4.16%～96.10%;當(dāng)咯菌腈濃度為0.01～0.50 μg/mL 時(shí)，對(duì)禾谷鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為8.38%～62.87%，對(duì)尖孢鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為5.54%～62.56%，對(duì)茄腐鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為1.70%～30.98%，對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為3.10%～29.18%;當(dāng)咯菌腈濃度為0.01～4.00 μg/mL時(shí)，對(duì)層出鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)無抑制作用。

2.2 咯菌腈對(duì)根腐病病菌的毒力測(cè)定

由表1可知，咯菌腈對(duì)立枯絲核菌的抑制中濃度最低，EC50僅為0.083 4 μg/mL;其次是高粱鐮孢菌，EC50為0.110 7 μg/mL;禾谷鐮孢菌和尖孢鐮孢菌的EC50分別為0.200 5、0.295 2 μg/mL;在測(cè)試菌株中，抑制中濃度最高的是藤倉鐮孢菌，EC50達(dá)5.722 3 μg/mL。結(jié)果表明，咯菌腈對(duì)立枯絲核菌和高粱鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)抑制作用較強(qiáng)，對(duì)禾谷鐮孢菌和尖孢鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)抑制作用次之。本試驗(yàn)中所有毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.94，表明藥劑濃度梯度設(shè)計(jì)合理，數(shù)據(jù)可靠有效。

2.3 咯菌腈對(duì)大豆根腐病和花生根腐病的田間防治效果

由表2可知，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑在按照使用劑量200、400、600 g/100 kg種子防治大豆根腐病試驗(yàn)中，分別在大豆出苗后10、30、60 d對(duì)大豆根腐病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果表明，出苗后10 d，咯菌腈低、中、高3個(gè)使用劑量對(duì)大豆根腐病的平均防效分別為75.60%、81.16%、90.58%，隨著咯菌腈懸浮種衣劑用量的增加防效顯著提高，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效有顯著差異;出苗后30 d，咯菌腈的低、中、高3個(gè)使用劑量對(duì)大豆根腐病的平均防效分別為69.61%、76.71%、84.43%，隨著咯菌腈懸浮種衣劑用量的增加防效顯著提高，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效有顯著差異;出苗后60 d，咯菌腈的低、中、高3個(gè)使用劑量對(duì)大豆根腐病的平均防效分別為58.37%、66.91%、75.31%，隨著用量的增加防效顯著提高，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效具有顯著差異。此外，出苗后60 d，對(duì)照藥劑350 g/L精甲霜靈種子處理乳劑處理的平均防效為57.52%，與咯菌腈低劑量防效相當(dāng);30 g/L苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑處理的平均防效為65.92%，與咯菌腈中劑量防效相當(dāng)。以上結(jié)果表明，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑防治大豆根腐病的持效期可達(dá)60 d，隨著時(shí)間的推移，其防效呈逐漸下降趨勢(shì)。

在田間藥效試驗(yàn)中（表3），25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑在按照使用劑量200、400、600 g/100 kg種子進(jìn)行防治花生根腐病處理后，分別在花生出苗后10、30、60 d對(duì)花生根腐病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果表明，出苗后10 d，咯菌腈低、中、高3個(gè)使用劑量對(duì)花生根腐病的平均防效分別為61.26%、73.72%、83.79%，隨著用量的增加防效顯著提高，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效有顯著差異;出苗后60 d，咯菌腈的低、中、高3個(gè)使用劑量對(duì)花生根腐病的平均防效分別為49.76%、60.92%、69.78%，隨著用量的增加防效顯著提高，在0.05水平上，3個(gè)劑量的處理防效具有顯著差異。此外，出苗后10、30、60 d，對(duì)照藥劑350 g/L精甲霜靈種子處理乳劑處理的平均防效分別為59.09%、56.39%、50.48%，與咯菌腈低劑量防效相當(dāng);30 g/L苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑處理的平均防效分別為75.10%、68.85%、59.35%，與咯菌腈中劑量防效相當(dāng)。結(jié)果表明，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑600 g/100 kg 種子的使用劑量能有效防治花生根腐病，與其他處理相比，防效呈顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

目前根腐病最常用的防治方法為化學(xué)藥劑，如使用咯菌腈、精甲霜靈、苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯、甲霜靈、甲基硫菌靈等單劑或復(fù)配劑處理種子。此外，根腐病的防治還包括選育抗病品種、農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治[13]。由于根腐病病菌從種子發(fā)芽期到生長(zhǎng)中后期都能侵染大豆等植株，所以選育優(yōu)良的抗（耐） 病品種是防治根腐病最有效的方法，但目前成功應(yīng)用的抗病種質(zhì)資源仍很缺乏。農(nóng)業(yè)防治的主要措施是輪作，盡量避免重茬耕種，降低根腐病病原菌基數(shù)和發(fā)病率。生物防治主要是利用生物多樣性，通過在自然界釋放或引進(jìn)有益微生物，抑制病原菌活動(dòng)或與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)和空間來減少病原菌的數(shù)量，可持續(xù)控制植物病蟲害。目前報(bào)道的根腐病生防真菌主要有木霉菌（Trichoderma） 、酵母（Yeast） 、青霉菌（Penicillium），生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌（Bacillus） 、假單胞桿菌（Pseudomonas）等植物促生菌[14-18]。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)咯菌腈濃度為0.01～1.00 μg/mL 時(shí)，對(duì)立枯絲核菌和高粱鐮孢菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率隨著藥劑濃度增大而增大，對(duì)其他4種鐮孢菌（禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、茄腐鐮孢菌、藤倉鐮孢菌）菌絲生長(zhǎng)抑制率沒有嚴(yán)格地隨著藥劑濃度增大而增大，抑菌作用呈現(xiàn)不規(guī)律性。在離體含藥平板上，低濃度區(qū)間（0～0.5 μg/mL）咯菌腈對(duì)尖孢鐮孢菌和禾谷鐮孢菌有良好的抑菌效果，表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)抑制率隨藥劑濃度增大而增大;但是加大咯菌腈使用濃度時(shí)（>1.00 μg/mL），抑菌效果反而下降，表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)抑制率隨藥劑濃度増大而減小的抑菌規(guī)律。這個(gè)結(jié)果與前人報(bào)道[19]一致，其潛在原因仍需繼續(xù)研究探索。目前，推測(cè)的原因可能是殺菌劑咯菌腈是通過打斷病原菌體內(nèi)高滲透壓甘油途徑中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，簡(jiǎn)稱MAPK）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來控制植物病原真菌，在這個(gè)過程中病原菌為適應(yīng)外界環(huán)境刺激（如咯菌腈的濃度）會(huì)有不同反應(yīng)[19]。

近年來，大豆、花生等經(jīng)濟(jì)植物的根部病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，由于其病原菌復(fù)雜多樣，可長(zhǎng)期潛伏于土壤中，因此病原菌侵染早期不易被發(fā)現(xiàn)，待植株地上部位出現(xiàn)明顯病癥時(shí)往往已錯(cuò)過了最佳防治時(shí)期。因此，藥劑拌種是防治這類根部病害最理想的措施，可減少藥劑使用量、降低農(nóng)事操作成本、保護(hù)自然環(huán)境。本試驗(yàn)結(jié)果表明，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑對(duì)大豆和花生安全性好，對(duì)大豆根腐病和花生根腐病均有較好的防控效果，適合在生產(chǎn)中應(yīng)用。

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