植物源農(nóng)藥丁子香酚與苦參堿及其混配對葡萄灰霉病的毒力測定及田間防效

楊勇++王建華++吉沐祥++吳祥++陳宏州+李國平

摘要：為篩選防治葡萄灰霉病的高效低毒新型植物源復配殺菌劑，降低有效用藥量，提高防治效果，減少和替換對葡萄灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性的一些常用化學殺菌劑。采用菌絲生長速率法測定植物源農(nóng)藥丁子香酚、苦參堿及其混配制劑對葡萄灰霉病菌的毒力，并通過田間試驗評價其對葡萄灰霉病的防治效果。結果表明，丁子香酚與苦參堿及 6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3、1 ∶[KG-*3]6混配組合對葡萄灰霉病菌的EC50（半最大效應濃度）值分別為1.454 7、357.536 9、0.384 8、0.757 5、1.312 0、2.087 3、4.960 1 μg/mL；5種混配組合對葡萄灰霉病菌的增效系數(shù)（SR）分別為4.41、2.56、2.21、2.75、2.00，幾種配比均具有明顯增效作用，其中以6 ∶[KG-*3]1混配的組合增效系數(shù)最大。田間防效調(diào)查結果表明，0.5% 丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液（高濃度）、0.5%丁子香酚可溶液劑375倍液+1.3%苦參堿水劑750倍液（中濃度）、0.5%丁子香酚可溶液劑500倍液+1.3%苦參堿水劑1 000倍液（低濃度）、0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液、1.3%苦參堿水劑500倍液對葡萄灰霉病防治效果分別為86.31%、67.03%、55.34%、8014%、57.73%。丁子香酚和苦參堿6 ∶[KG-*3]1～1 ∶[KG-*3]6混配對葡萄灰霉病菌均增效明顯，果穗套袋前采用0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液混用浸果處理后套袋，采收前調(diào)查對葡萄灰霉病害防效為85%以上，明顯優(yōu)于各單劑和中、低濃度混配處理的防效。

關鍵詞：葡萄灰霉?。欢∽酉惴?；苦參堿；復配；抑制活性；田間防效

中圖分類號：S436.631.1+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0160-04

收稿日期：2016-05-16

基金項目：國家科技富民強縣專項（編號：BN20156222）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）2056]。

作者簡介：楊勇（1990—），男，安徽宣城人，碩士，研究實習員，主要從事果樹栽培與植保研究。Tel：（0511）80978060；E-mail：yl0656@163.com。

通信作者：吉沐祥，研究員，主要從事果樹植保與農(nóng)藥開發(fā)研究。Tel：（0511）80978060；E-mail：jilvdun2800@163.com。

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）引起的真菌病害，腐生性強、寄主廣泛，已報道的就超過200種。在葡萄生產(chǎn)上，灰霉病是常見病害，也是最嚴重的病害之一，每年因灰霉病造成的葡萄損失為20%左右，發(fā)病嚴重的果園損失高達50%[1]。該病主要侵染葡萄的花冠、花序、果實、葉片及新梢，同時也會對貯藏期的葡萄造成嚴重危害，如何有效控制灰霉病的發(fā)生成為葡萄產(chǎn)業(yè)的當務之急。

目前對葡萄灰霉病的防治大多還是使用化學藥劑，然而灰葡萄孢菌具有高基因漂移潛力、種群尺度較大、繁殖速度快、遺傳變異大、適合度高[2-4]，加之用藥不科學，多年持續(xù)使用單一藥劑，造成灰霉病菌對一些殺菌劑（苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類）產(chǎn)生了抗藥性，甚至出現(xiàn)多重抗藥性，導致藥劑對葡萄灰霉病的田間防效大幅下降，給病害防治帶來很多困難[5-6]?；颐共【鷮Ρ讲⑦溥蝾?、二甲酰亞胺類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的多重抗藥性類型有RRS型（R表示抗，S表示感，RRS即為對前2類殺菌劑已有抗藥性而對后1類尚敏感）、RSS型、SSR型和RRR型，前人研究發(fā)現(xiàn)，我國各地區(qū)葡萄灰霉病菌對3類藥劑出現(xiàn)不同程度的抗藥性，對苯并咪唑類的抗藥性已普遍存在[7]。丁子香酚是存在于桃金娘科丁子香屬植物丁香（Eugenia caryophyllato Thunb）中的一種有香味的揮發(fā)性物質(zhì)。20世紀90年代，國內(nèi)首次將丁子香酚研發(fā)作為蔬菜等作物的殺菌劑[8]，作為治療性殺菌劑，丁子香酚具有殺菌譜廣、毒性低的特點，能迅速治療多種農(nóng)作物、水果感染的真菌、細菌性病害[9-11]，如灰葡萄孢菌、腐霉菌、鐮刀菌、雙疫霉菌等[12]。苦參堿是由苦參的根、莖、葉和果實經(jīng)乙醇等有機溶劑提取制成，主要成分為生物堿和黃酮類，被廣泛應用于臨床醫(yī)學。近年來，國內(nèi)逐漸開發(fā)出苦參堿農(nóng)藥，應用于防治果蔬、茶葉、煙草等作物的病蟲害，并取得了良好防效[13]。[JP2]丁子香酚與苦參堿作用機理各異，2種藥劑復配既具有保護作用又具有治療作用，或許有利于克服或延緩葡萄灰霉病菌抗藥性的發(fā)展，提高防治效果。為了進一步明確丁子香酚和苦參堿混配對控制葡萄灰霉病菌是否具有增效作用，本試驗進行了丁子香酚和苦參堿的混合物聯(lián)合毒力測定，通過田間藥效試驗評價了2種制劑混用對葡萄灰霉病的防治效果，旨在明確丁子香酚與苦參堿混配對葡萄灰霉病的毒力及合理配比，以及田間對葡萄果穗灰霉病的實際防效，為減少和替代化學農(nóng)藥，防止化學抗藥性和殘留，提高果品安全品質(zhì)，尋求有效防治葡萄灰霉病的生物產(chǎn)品提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1室內(nèi)抑菌活性測定

1.1.1試驗時間與地點于2014年4—7月在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室實驗室進行。

1.1.2供試菌株葡萄灰霉病菌，采自江蘇省句容市華陽鎮(zhèn)葡萄園，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所植保研究室分離、鑒定、保存?zhèn)溆?。菌株保存于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）斜面上（4 ℃）。

1.1.3供試藥劑20%丁子香酚（eugenol）水劑（江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）；5%苦參堿（matrine）母藥（北京三浦百草綠色植物制劑有限公司）；1.3%苦參堿水劑（山西德威生化有限責任公司）；0.3%丁子香酚可溶液劑（江蘇省南通神雨綠色藥業(yè)有限公司）。

1.1.4儀器設備電子天平（感量0.1 mg）、GZP-300A培養(yǎng)箱、直徑為75 mm的培養(yǎng)皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接種刀等。

1.1.5試驗方法

1.1.5.1藥液的配制及濃度設計（1）母液配制：將20%丁子香酚水劑和5%苦參堿母藥用適量丙酮溶解后加10%吐溫80，配制成1 000 μg/mL母液置于4 ℃冰箱中備用。

（2）各藥劑單劑與復配劑的濃度設計：丁子香酚在含藥PSA培養(yǎng)基中的有效成分濃度設計為：50.000 000、25.000 000、12.500 000、6.250 000、3.125 000、1.562 500、0.781 250、0390 625 μg/mL；苦參堿在含藥PSA培養(yǎng)基中的有效成分濃度設計為：100.000 00、50.000 00、25.000 00、12.500 00、6.250 00、3.125 00、1.562 50、0.781 25 μg/mL；丁子香酚 ∶[KG-*3]苦參堿（6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3和1 ∶[KG-*3]6）混配在含藥PSA中的有效成分濃度設計均為：50.000 000、25.000 000、12.500 000、6.250 000、3.125 000、1.562 500、0.781 250、0.390 625 μg/mL。單劑與混配劑的有效成分濃度設計均為7個不同濃度梯度含藥PSA培養(yǎng)基。

除母液外，所有試驗藥劑系列有效成分濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.5.2殺菌劑對葡萄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定采用菌絲生長速率法[14]，將各單劑與混配劑的藥液依次稀釋至所需濃度，然后將1 mL藥液與9 mL培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿內(nèi)混勻，制成含系列濃度藥劑的PSA培養(yǎng)基，采用無菌水作空白對照，各處理重復4次。將保留的葡萄灰霉病菌轉(zhuǎn)接到PSA平皿中，在25 ℃下活化72 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到含藥的PSA平皿和空白對照中。25 ℃ 培養(yǎng)96 h，待對照中菌落約長至平皿直徑的4/5時，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計算菌落直徑均值，并按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率：

菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。取抑制率在5%～95%的數(shù)據(jù)，采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出藥劑對葡萄灰霉病菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50及其95%置信限。

1.1.5.3聯(lián)合作用評價方法根據(jù)Wadley法[14]，計算增效系數(shù)（SR）。根據(jù)增效系數(shù)評價藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。

[JZ（]SR=EC50（Eth）/EC50（Eob）；[JZ）][JY]（1）

[JZ（]EC50（Eth）=（a+b）/[（a/EC50A）+（b/EC50B）]。[JZ）][JY]（2）

式中：A、B分別為丁子香酚和苦參堿單劑；EC50A、EC50B分別為丁子香酚和苦參堿單劑的EC50值；a、b分別為丁子香酚和苦參堿單劑在混劑中的比例；EC50（Eth）為混劑EC50理論值；EC50（Eob）為混劑EC50實測值。

1.2殺菌劑對葡萄灰霉病的田間防效試驗

田間試驗于2015年在句容市華陽鎮(zhèn)下甸村農(nóng)戶葡萄園進行，葡萄品種為夏黑，樹齡5年，栽培方式為籬架。試驗設0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液、0.5%丁子香酚可溶液劑375倍液+1.3%苦參堿水劑750倍液、0.5%丁子香酚液500倍液+1.3%苦參堿1 000倍液（以下分別簡稱高濃度、中濃度、低濃度）、0.5%丁子香酚250倍液、1.3%苦參堿500倍液及清水對照6個處理，每處理重復3次，隨機區(qū)組排列，每小區(qū)供試葡萄樹3株。

果粒直徑約為1 cm時選擇晴好天氣上午浸果處理，當天下午套袋，果實成熟后摘袋調(diào)查病果率。每個處理取10個果穗，記錄調(diào)查總果粒數(shù)、病果粒數(shù)，計算病果率及防治效果。

葡萄灰霉病以病果率表示各處理區(qū)的發(fā)病情況。

[JZ]病果率=（病果數(shù)/調(diào)查總果數(shù)）×100%；

防治效果=（對照區(qū)病果率-處理區(qū)病果率）/對照區(qū)病果率×100%。[JY]（3）

2結果與分析

2.1室內(nèi)抑菌活性測定研究

2.1.1丁子香酚與苦參堿對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制作用從表1可看出，當丁子香酚的濃度為0.390 625～50.000 000 μg/mL時，對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制率為 29.15%～93.47%；當苦參堿藥劑處理濃度為0.781 25～100.000 00 μg/mL 時，對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制率為 6.03%～38.19%。這表明2種殺菌劑對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制活性以及對葡萄灰霉病菌菌絲生長的最低抑制濃度（MIC值） 有差異。

2.1.2丁子香酚與苦參堿混配對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制作用從表2可看出，丁子香酚與苦參堿混配組合不同處理濃度對灰霉病菌表現(xiàn)不同程度的抑制作用。丁子香酚與苦參堿5種混配組合的濃度為0.390 625～50.000 000 μg/mL 時，6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3和1 ∶[KG-*3]6配比的混配組合對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制率分別為5276%～91.46、44.22%～90.45%、34.67%～87.44%、2613%～84.92%、18.09%～81.41%。表明丁子香酚與苦參堿混配組合不同處理濃度對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制活性和最低抑制濃度（MIC值）有較大差異。

2.1.3丁子香酚、苦參堿及其混配劑對葡萄灰霉病病菌的毒力測定2種單劑和5種復配組合對葡萄灰霉病病菌的作用模型見表3，濃度對數(shù)與防治效果概率值的相關系數(shù)均 ≥0.991 7，說明防治效果概率值的變異有99.17%或以上來自濃度對數(shù)的變異，[JP2]表明用所得模型表達濃度對數(shù)與防治效果概率值的關系可行。表3數(shù)據(jù)表明，丁子香酚、苦參堿單劑對葡萄灰霉病病菌的EC50分別為1.454 7、357.536 9 μg/mL，丁子香酚對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制活性高于苦參堿。從表3中也可看出，丁子香酚與苦參堿分別以質(zhì)量比6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3 和1 ∶[KG-*3]6混配后對葡萄灰霉病菌菌絲生長抑制的EC50分別為0.384 8、0.757 5、1.312 0、2.087 3、4.960 1 μg/mL，丁子香酚與苦參堿分別以質(zhì)量比6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1和1 ∶[KG-*3]1混配后對灰霉病菌的抑制作用均強于各單劑；5種混配組合對葡萄灰霉病菌的增效系數(shù)（SR）分別為4.41、2.56、2.21、2.75和 2.00，根據(jù) Wadley評價法，增效系數(shù)（SR）均大于1.5，表現(xiàn)出增效作用，其中以質(zhì)量比6 ∶[KG-*3]1混配，增效系數(shù)（SR）最高，為4.41。因此，從整體上判斷丁子香酚和苦參堿混配劑對葡萄灰霉病病菌的抑制作用較好，并且推薦的最佳混配比為 6 ∶[KG-*3]1。

2.2田間防治效果試驗

為了進一步驗證丁子香酚和苦參堿混用組合對葡萄灰霉病的防治效果，特進行了田間防治效果試驗。從藥后50 d采摘前調(diào)查對葡萄灰霉病病粒防治效果（表4）可以看出，混用組合高濃度防效為86.31%，顯著高于2個單劑和混用組合中濃度及低濃度，而0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液單劑對灰霉病的防效也達到了80%以上，顯著高于混合組合中、低濃度。因此，葡萄灰霉病防治效果，以高濃度混用組合最優(yōu)，0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液對套袋前浸果處理也有較好防效。

2.3安全性調(diào)查

套袋前浸果處理施藥后的10、30、50 d（采收時）拆袋目測觀察，各處理區(qū)葡萄果實生長發(fā)育正常，無明顯藥害或藥斑，表明供試藥劑在試驗劑量范圍內(nèi)對葡萄果穗安全。

[BT1#]3結論與討論

灰霉病是廣泛分布于全世界葡萄種植國家和地區(qū)的重要病害，它嚴重影響了葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量。傳統(tǒng)防治灰霉病的藥劑如腐霉利、嘧霉胺、多菌靈、百菌清等由于使用頻繁，灰霉病菌部分藥劑已產(chǎn)生抗藥性，防效較差。嚴紅等通過檢測葡萄灰霉病菌對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類殺菌劑的抗藥性發(fā)現(xiàn)，葡萄灰霉病菌對多菌靈的抗藥性嚴重，為83.5%，對腐霉利和乙霉威的抗藥性頻率分別為14.7%和17.4%，[JP2]抗藥性處于發(fā)展階段[7]。張瑋等研究表明，中國葡萄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性頻率為22.22%～62.50%，抗藥性普遍，并與多菌靈、腐霉利、乙霉威均存在交互抗藥性[15]。

本研究采用室內(nèi)毒力測定與田間藥效試驗相結合的方法，測試了丁子香酚、苦參堿及其混配組合對葡萄灰霉病的防治效果。試驗結果表明，通過室內(nèi)毒力測定，丁子香酚和苦參堿對葡萄灰霉病菌均具有抑菌活性，其中丁子香酚對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制活性明顯高于苦參堿。在單劑毒力的基礎上，結合不同殺菌劑的作用機理，選擇丁子香酚和苦參堿進行不同配比的毒力測定。試驗發(fā)現(xiàn)5個配比（6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3、1 ∶[KG-*3]6）均表現(xiàn)為明顯增效作用，其中丁子香酚、苦參堿6 ∶[KG-*3]1混配對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制活性最好，增效作用最高。將篩選出的新型混劑進行田間小區(qū)試驗，將丁子香酚和苦參堿進行不同稀釋倍數(shù)混配處理。結果表明，0.5% 丁子香酚250倍液+1.3%苦參堿500倍液，對葡萄灰霉病的防效達到了85%以上，室內(nèi)毒力測定與田間藥效試驗結果基本相符，室內(nèi)表現(xiàn)抑菌效果較好的混配劑組合在田間防效最高。在試驗濃度條件下浸果處理該藥劑對葡萄果穗安全，無藥害發(fā)生。因此，丁子香酚和苦參堿混配可作為生產(chǎn)上防控葡萄灰霉病的植物源新藥劑。

由此可見，植物源農(nóng)藥丁子香酚和苦參堿復配或混用防治葡萄灰霉病可行，研究結果為生產(chǎn)中減少和替代化學農(nóng)藥，減少化學農(nóng)藥殘留和提高葡萄安全品質(zhì)提供了試驗依據(jù)，從而為葡萄病害的防治提供了新方法，具有較好的應用前景，但在對葉部和花穗灰霉病及其他病害防治等方面還有待進一步研究。

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