不同基原忍冬屬藥材指紋圖譜的建立

王閩予，李國衛(wèi)，索彩仙，潘禮業(yè)，魏 梅，孫冬梅，何嘉瑩

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

《中國藥典》2015年版收載的忍冬屬LoniceraL.花類藥材共2種，分別為金銀花（基原為忍冬屬植物忍冬L.japonicaThunb.）及山銀花（灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq、華南忍冬L.confusaDC.和黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng[1]。而川銀花則是列入《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010年版，為忍冬屬植物細(xì)氈毛忍冬L.similisHemsl.、淡紅忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或帶初開的花，前者習(xí)稱“南江銀花”，后者習(xí)稱“肚子銀花”或“沐川銀花”[2]。忍冬始載于《名醫(yī)別錄》，后《新修本草》《證類本草》均有收錄[3]?！吨袊参镏尽分杏涊d了忍冬屬植物在我國有98種之多，廣泛分布于全國各省區(qū)，其中以金銀花、山銀花為主要商品在市場上流通，金銀花以山東平邑、河南封丘為主要產(chǎn)區(qū)；山銀花主產(chǎn)于湖北、云南、貴州、廣西等地區(qū)；川銀花則主產(chǎn)于四川。上述三者均具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、抑菌抗菌、抗病毒的功效，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等病癥[4-5]。

由于金銀花一直作為藥食同源使用，雖然目前人工種植已成規(guī)模，但仍供不應(yīng)求，加上忍冬屬植物種類繁多且形態(tài)相近、功效相似，所以藥材市場存在摻偽混淆等現(xiàn)象，因此，開展金銀花與同屬其它基原品種鑒別研究十分必要。目前采用HPLC指紋圖譜鑒別金銀花和山銀花的文獻(xiàn)較多，且鑒別多數(shù)為金銀花和山銀花[6-12]。本實(shí)驗(yàn)對忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬以及淡紅忍冬4個(gè)基原共47批藥材進(jìn)行研究，建立同時(shí)進(jìn)行UPLC指紋圖譜與多指標(biāo)含量測定方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）分析，比較不同基原忍冬屬藥材的差異性，為忍冬屬藥材鑒別和檢驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters BEH Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；Mettler XP-26型百萬分之一天平，ME204E型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q型超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（Merk公司）；水為Mili-Q純化水；其余試劑為分析純。

綠原酸（批號110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）、馬錢苷（批號111640-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、蘆?。ㄅ?0080-201811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.7%）、木犀草苷（批號111720-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%），由中國食品藥品檢定研究院提供；異綠原酸A（批號wkq18041207）、異綠原酸B（批號wkq17060705）、異綠原酸C（批號wkq18050905）、隱綠原酸（批號wkq16081903）、新綠原酸（批號wkq16050805）、獐牙菜苷（批號wqk17092203）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，由四川省維克奇生物科技有限公司提供；實(shí)驗(yàn)所用藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，JYH1～JYH12號樣品為忍冬L.japonicaThunb.，HZ1～HZ11號樣品為灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.；HH1～HH12號樣品為黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng；DH1～DH12號樣品為淡紅忍冬L.acuminataWall.。藥材具體信息見表1。

表1 藥材信息Table 1 Details of Lonicera

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters BEH Phenyl色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），體積流量0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，0～1 min，4%～5% A；1～9 min，5%～6% A；9～13 min，6%～10% A；13～15 min，10%～14% A；15～30 min，14%～25% A。

2.2 對照品溶液制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為12.201、456.609、7.901、7.790、14.906、17.916、11.851、8.129、270.480、30.679 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸為參照峰，計(jì)算15個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，以綠原酸為參照峰，計(jì)算15個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD＜2%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末約0.5 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，以綠原酸為參照峰，計(jì)算15個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜分析及評價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰歸屬 采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.0版）”對47批藥材樣品UPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，其中忍冬的色譜峰信息最豐富，確定15個(gè)共有峰（圖1）；灰氈毛忍冬確定8個(gè)共有峰（圖2）；黃褐毛忍冬確定9個(gè)共有峰（圖3）；淡紅忍冬確定11個(gè)共有峰（圖4）。4者共有峰個(gè)數(shù)為8，其中2號峰（綠原酸）分離度好，峰形對稱，為藥材中清熱、抗菌、抗病毒的主要成分之一，故以2號綠原酸峰為參照峰（S）。通過各對照品保留時(shí)間和紫外吸收光譜對藥材中共有峰的化學(xué)成分進(jìn)行歸屬，峰1為新綠原酸，峰2為綠原酸，峰4為隱綠原酸，峰7為馬錢苷，峰8為獐牙菜苷，峰10為蘆丁，峰11為木犀草苷，峰12為異綠原酸B，峰13為異綠原酸A，峰15為異綠原酸C（圖5）。

圖1 12批忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of 12 batches of L.japonica Thunb.

圖2 11批灰氈毛忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprints of 11 batches of L.macranthoides Hand.-Mazz.

圖3 12批黃褐毛忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.3 UPLC fingerprints of 12 batches of Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng

圖4 12批淡紅忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.4 UPLC fingerprints of 12 batches of L.acuminata

圖5 共有峰歸屬UPLC圖Fig.5 Attribution graph of UPLC fingerprint common peaks

2.5.2 相似度評價(jià)結(jié)果 采用國家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.0版本）”分別對JYH1～JYH12、HZ1～HZ11、HH1～HH12、RD1～RD12共47批藥材樣品UPLC指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以峰2（綠原酸）為參照峰，采用平均數(shù)，時(shí)間窗口為1，自動(dòng)匹配，計(jì)算相似度系數(shù)，12批忍冬藥材的相似度均在0.980以上，11批灰氈毛忍冬藥材的相似度均在0.986～0.999，12批黃褐毛忍冬藥材的相似度均在0.791～0.981，12批淡紅忍冬藥材相似度均為1.000，樣品相似度最高。相似度結(jié)果說明不同來源、同一基原的忍冬屬藥材化學(xué)成分具有較好的一致性，結(jié)果見表2。

表2 不同基原藥材樣品相似度評價(jià)結(jié)果Table 2 Results of similarity evalution of samples from different origins

2.5.3 不同品種藥材UPLC指紋圖譜和相似度比較通過UPLC指紋圖譜結(jié)果顯示，忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬和淡紅忍冬藥材樣品共有峰個(gè)數(shù)分別為15、8、9及11個(gè)，四者共有峰有8個(gè)。分別將上述4個(gè)基原樣品的對照圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.0版本）”軟件，兩兩對比，其中忍冬與灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、淡紅忍冬的相似度分別為0.856、0.575、0.880；灰氈毛忍冬與黃褐毛忍冬、淡紅忍冬的相似度分別為0.800、0.979；黃褐毛忍冬與淡紅忍冬的相似度為0.723。結(jié)果表明，不同基原樣品間的指紋圖譜共有峰信息和相似度均有差異，說明即便是同屬藥材，其化學(xué)成分亦存在著差異。

2.6 聚類分類

運(yùn)用SPSS軟件對47批藥材樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚為4類（圖6）。JYH1～JYH12為忍冬聚為一類，HZ1～HZ11為灰氈毛忍冬聚為一類，HH1～HH12為黃褐毛忍冬聚為一類，DH1～DH12為淡紅忍冬聚為一類。從總體數(shù)據(jù)來看，不同品種的藥材樣品具有明顯差異。

圖6 47批藥材樣品聚類分析結(jié)果Fig.6 Cluster analysis result of 47batches of samples

2.7 樣品含量測定

基于上述研究結(jié)果，為了進(jìn)一步評價(jià)4個(gè)基原忍冬屬藥材的質(zhì)量，本研究對已進(jìn)行歸屬的10個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行含量測定，并對結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，以區(qū)分不同基原忍冬屬藥材之間的差異。

2.7.1 線性范圍 取“2.2”項(xiàng)下的對照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋制得6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，各對照品的線性關(guān)系良好，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程及線性范圍Table 3 Regression euqation and linear line

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末約0.5 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的的色譜條件測定，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的忍冬藥材（JYH3）0.25 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率。測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、綠原酸A、異綠原酸C平均加樣回收率分別為94.15%、95.56%、98.19%、96.57%、98.90%、106.79%、96.40%、96.92%、98.55%、97.93%，RSD分別為2.32%、0.53%、2.57%、1.68%、1.04%、0.62%、1.84%、1.80%、1.96%、1.80%。

2.7.6 含量測定 精密稱取47批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得到含量測定結(jié)果，見表4。結(jié)果顯示，不同基原忍冬屬藥材的10個(gè)成分含量差異顯著。經(jīng)過分析多批次樣品，發(fā)現(xiàn)獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷為忍冬基原的差異成分；馬錢苷在忍冬及淡紅忍冬與其他2個(gè)基原的樣品能檢出；新綠原酸為4個(gè)基原樣品的共有成分，但在灰氈毛忍冬中的含量明顯高于其他基原，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為5.429 mg/g，淡紅忍冬次之，含量均值為2.264 mg/g，忍冬與黃褐毛忍冬中的新綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，分別為0.707、0.613 mg/g。

2.8 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.8.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以10個(gè)成分含量測定結(jié)果為變量，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，由表5可知，共提取了3個(gè)特征值大于1的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)94.026%，表明可以用3個(gè)主成分反映不同基原忍冬屬藥材主要的質(zhì)量特征。從表6可以看出，在第1主成分有較高載荷的包括馬錢苷、異綠原酸C；在第2主成分有較高載荷的包括獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷，主要為黃酮類成分；第3主成分有較高荷載的包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸，主要為酚酸類成分（載荷值＞0.90）。以降維得到的3個(gè)主成分得分作為X、Y、Z軸，得到47個(gè)樣品的散點(diǎn)分布圖，結(jié)果顯示，4種不同基原忍冬屬樣品能實(shí)現(xiàn)明顯區(qū)分，同基原樣品能較好的聚在同一區(qū)域，說明4種不同基原忍冬屬藥材之間的成分存在一定差異，結(jié)果見圖7。從不同樣品的3個(gè)主成分得分可以看出，忍冬基原的樣品主成分2評分均為正值，可以較好的與其他基原的樣品實(shí)現(xiàn)分離；淡紅忍冬基原的樣品主成分1評分均為正值，可以較好的與其他成分實(shí)現(xiàn)分離；而灰氈毛忍冬與黃褐毛忍冬的差異主要體現(xiàn)在主成分3，灰氈毛忍冬的主成分3評分均為正值，結(jié)果見表7。

表7 主成分得分Table 7 Principal component score

圖7 PCA得分分布圖Fig.7 Scatter diagram of principal component score

表5 特征根、各主成分的貢獻(xiàn)率Table 5 Contribution rate of characteristic roots and principal components

表6 各因子初始因子載荷矩陣Table 6 Initial factor load matrix of each factor

2.8.2 OPLS-DA 依據(jù)PCA結(jié)果，對不同基原的4組樣品進(jìn)行OPLS-DA分析。OPLS-DA模型，R2X＝0.94，R2X＝0.955，Q2＝0.95，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠，可用于不同基原忍冬屬樣品的區(qū)分。結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使4種樣本點(diǎn)完全被分開，相互之間沒有樣品出現(xiàn)交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區(qū)間之內(nèi)，結(jié)果見圖8。采用變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）篩選造成4種基原忍冬屬樣品差異性的標(biāo)志物，其中VIP值大于1的成分包括5個(gè)，分別為新綠原酸、馬錢苷、綠原酸、蘆丁、木犀草苷，這些成分是造成4種不同基原忍冬屬樣品間成分差異的主要標(biāo)志性成分，其余峰VIP值小于1，對區(qū)分樣品影響較小，結(jié)果見圖9。

圖8 OPLS-DA得分圖Fig.8 Chart of OPLS-DA score

圖9 10個(gè)化學(xué)成分的VIP值Fig.9 VIP chart of 10 ingredients

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

通過全波長掃描，著重考察350 nm及240 nm 2個(gè)檢測波長，通過2個(gè)檢測波長的對比，發(fā)現(xiàn)240 nm檢測波長所得到的色譜峰較350 nm檢測波長的色譜峰信息多，且峰形較好，故選用240 nm作為檢測波長。考察了不同色譜柱，最終確定以WatersBEH Phenyl色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）所得到的色譜圖峰形最好，峰數(shù)最多。

3.2 指紋圖譜結(jié)果分析

本研究建立了忍冬屬藥材UPLC指紋圖譜，在更短的分析時(shí)間下，分離度良好，提高了分析效率。建立的指紋圖譜基線平穩(wěn)，共有峰數(shù)目多，忍冬藥材共有峰15個(gè)，灰氈毛忍冬藥材有8個(gè)，黃褐毛忍冬藥材有9個(gè)，淡紅忍冬藥材有11個(gè)，4種忍冬的共有峰有8個(gè)，通過直觀分析可以對4個(gè)基原的忍冬屬藥材進(jìn)行區(qū)分。相似度評價(jià)結(jié)果顯示不同基原之間的存在一定差異，通過聚類分析可以將同基原的樣品聚為一類，說明同基原間的樣品質(zhì)量穩(wěn)定，具有一定的共性，同時(shí)也說明不同基原間的樣品其化學(xué)成分成分及含量均存在差異。

3.3 多指標(biāo)含量測定結(jié)果分析

本研究在已建立UPLC指紋圖譜方法的基礎(chǔ)上，對已進(jìn)行歸屬的10個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示不同基原忍冬屬藥材的質(zhì)量存在一定差異，與指紋圖譜分析結(jié)果一致。其中，直觀結(jié)果分析顯示，金銀花化學(xué)成分最豐富，含有3個(gè)差異成分（獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷），而新綠原酸為最直觀反映4種藥材差異的共有成分，其含量大小為：灰氈毛忍冬＞淡紅忍冬＞忍冬＞黃褐毛忍冬；主成分分析降維得到3個(gè)主成分，可以將47個(gè)樣本分為基原一致的4類，其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷和異綠原酸C 8個(gè)成分為區(qū)別不同基原藥材的關(guān)鍵因素；OPLS-DA分析同樣將47個(gè)樣本分為3類，分類效果顯著，與聚類分析、主成分分析結(jié)果一致，OPLS-DA分析顯示區(qū)分不同基原樣品的標(biāo)志性成分分別為新綠原酸、馬錢苷、綠原酸、蘆丁、木犀草苷，說明OPLS-DA分析與主成分分析的評價(jià)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明不同基原忍冬屬藥材之間存在差異的科學(xué)性。

本研究建立了同時(shí)測定忍冬屬藥材的UPLC特征圖譜及10個(gè)特征性成分含量的方法，采用聚類分析、PCA分析與OPLS-DA，對不同來源的47個(gè)不同基原的樣本進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示忍冬屬4個(gè)不同基原藥材存在一定差異，為忍冬屬藥材的質(zhì)量控制提供了可靠的分析方法與參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突