雷公藤紅素單用和聯(lián)用抗腫瘤作用機制的研究進展

徐資怡，石金鳳，鮮 靜，張 晨，章津銘

成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137

近年來，全球腫瘤發(fā)病率和死亡率正在迅速增長，惡性腫瘤嚴重危害了人們的健康，影響了人們的正常生活[1]?；熓悄壳澳[瘤治療的主要方式，但大多數(shù)化療藥物水溶性較差、生物利用度不高且化療藥物對正常細胞的非選擇性作用，大多數(shù)常規(guī)化療患者出現(xiàn)嚴重的不良反應[2]。中藥活性成分具有高效、低毒、作用廣和靶點多等優(yōu)勢，可有效克服或彌補化療藥物嚴重的不良反應和腫瘤耐藥性[3]，這使得中藥活性成分逐漸成為研究熱點，通過研究中藥活性成分以獲得更好的腫瘤治療。

雷公藤紅素又名南蛇藤素，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.中提取的五環(huán)三萜類單體化合物，除了具有抗炎、抗風濕、止痛、治療神經(jīng)性退化疾病等多種藥理活性，還具有顯著的抗腫瘤活性，對前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、膠質(zhì)瘤、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌等細胞均有抑制作用[4-8]?，F(xiàn)代研究表明，雷公藤紅素具有廣譜、高效的抗腫瘤活性，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，自身細胞毒性作用輕，抗腫瘤活性更強，并能表現(xiàn)出明顯的放療及化療增敏作用[9]。隨著近年來雷公藤紅素研究的深入，其廣泛的應用和獨特的優(yōu)勢使其有望成為抗腫瘤的有效藥物。本文綜述了近幾年雷公藤紅素單用及聯(lián)用抗腫瘤作用機制及其遞藥系統(tǒng)的研究進展，以期為今后雷公藤紅素的深入研究和廣泛應用奠定基礎。

1 抗腫瘤作用機制

1.1 抑制腫瘤細胞增殖

腫瘤細胞具有無限增殖的特性，雷公藤紅素可以通過促進腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞自噬、阻滯細胞周期等抑制腫瘤細胞增殖，從而達到治療腫瘤的作用。

1.1.1 誘導腫瘤細胞凋亡 細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞程序性死亡，通過一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用，其異常功能是腫瘤生長和抗腫瘤發(fā)展的基礎。由雷公藤紅素介導的細胞凋亡主要通過3種通路實現(xiàn)：線粒體參與的內(nèi)源性信號通路、外源性信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導的細胞凋亡。

線粒體參與的內(nèi)源性信號途徑主要是由關鍵調(diào)節(jié)因子B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）家族蛋白導致的線粒體膜的破壞或通透，從而導致細胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）的釋放和其他凋亡因子的表達。在細胞質(zhì)中，Cyt-c與三磷酸腺苷形成一種稱為凋亡酶激活因子的復合物，該復合物激活半胱氨酸天門冬氨酸特異的蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）進而激活下游Caspase-3等相關靶點[10]。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bcl-xL和Survivin）和凋亡前Bcl-2家族蛋白[B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子（Bcl-2 asociated death promoter，Bad）、Bcl相關X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）、BH3結構域凋亡誘導蛋白（BH3 interacting domain death agonist，Bid）和Bcl-2細胞死亡調(diào)節(jié)因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）]，他們通過調(diào)節(jié)Cyt-c的釋放來抑制或促進細胞凋亡[11-13]。Yang等[14]在研究雷公藤紅素對人乳腺癌MCF-7細胞的作用機制時發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素通過降低Bcl-2表達，增加Bax表達來誘導Cyt-c和凋亡誘導因子釋放從而使得Caspase-7、8、9活化，誘導聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）裂解以及Caspase-8介導的Bid裂解。雷公藤紅素還可以通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）途徑誘導細胞凋亡[15]。當用雷公藤紅素5 μmol/L和拉帕替尼5 μmol/L組合處理人乳腺癌MDA-MB-453細胞時，可以在體外生長抑制和凋亡方面顯示出強大的協(xié)同作用，表明凋亡相關蛋白（Caspase-9、3）與生長途徑相關蛋白[人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、磷酸化HER2（p-HER2）、磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases 1/2，p-ERK1/2）]的下調(diào)[15]。雷公藤紅素處理后的細胞線粒體通透性發(fā)生改變，使得線粒體膜電位破壞[16]。另外有研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過抑制肽基脯氨酰順/反異構酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1）表達，從而抑制Akt、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、p38、c-Jun氨基端激酶（c-Junamino-terminal kinases，JNK）、p65和白細胞介素（interleukin，IL）-6表達[17]。Zhang等[18]研究表明雷公藤紅素2、4 μmol/L處理2 d后，人卵巢癌OVCAR3細胞中miRNA-21的相對表達水平降低，miRNA-21表達的下調(diào)會導致細胞OVCAR3中PI3K/Akt-核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factorκB，NF-κB）的表達水平降低，從而通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。

死亡受體介導的外源性信號通路是通過促凋亡配體與促凋亡受體結合導致死亡誘導信號復合體的形成[19]，如自殺相關因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-αR、DR3、DR4和DR5等死亡受體通過激活配體誘導細胞凋亡。雷公藤紅素通過增加TNF受體（TNF receptor，TNFR）-1、TNFR-2、Fas、DCR2、DR5、RIP和TNFR相關死亡結構域蛋白的表達來誘導口腔癌SASV16細胞凋亡[20]。NF-κB途徑是細胞因子刺激、細胞周期、凋亡和血管生成的關鍵調(diào)節(jié)因子[21]。Ni等[22]在使用雷公藤紅素處理骨髓瘤細胞后，采用免疫印跡法對NF-κB信號通路進行了檢測，NF-κB和IκB激酶α（IκB kinase α，IKKα）的表達降低，用免疫熒光法檢測雷公藤紅素處理后NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，結果表明雷公藤紅素以時間相關的方式有效地阻止了p65亞基的核轉(zhuǎn)位和NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κBα，IκBα））裂解。此外，Mou等[23]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素作用人肺癌A549細胞48 h后激活自殺相關因子配體與Fas結合，并通過激活Caspase-8觸發(fā)外部途徑細胞凋亡。雷公藤紅素可以減弱豆蔻酰佛波醇乙酯、TNF-α對IL-6基因表達的激活作用，下調(diào)IKKα、p50和p65的表達，通過NFκB依賴途徑下調(diào)IL-6基因表達，達到抑制前列腺癌細胞增殖的目的[24]。TNF相關凋亡誘導配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是TNF超家族成員之一，其與DR4/DR5結合可誘導細胞凋亡。在研究雷公藤紅素誘導骨肉瘤細胞凋亡的實驗中，Li等[25]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以上調(diào)外源性凋亡途徑蛋白DR5的表達。

ERS是細胞的一種保護機制，但是當長時間過度應激或功能障礙時，可能會誘導凋亡。ERS通常伴隨著能誘導ERS活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成的增加，過多的ROS水平干擾氧化還原動態(tài)平衡從而誘導細胞凋亡[26-27]。同時，ERS也會導致線粒體功能障礙，增加線粒體ROS生成[28]。研究表明，雷公藤紅素可以誘導JNK的激活進一步的誘導C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP），從而誘導DR5死亡受體的表達，最終引起細胞凋亡[29]。在用雷公藤紅素1 μmol/L處理MCF-7細胞后，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過ROS-蛋白激酶C-AMP活化蛋白激酶-p53蛋白-Polo激酶1通路誘導細胞凋亡[30]。同樣，Chen等[27]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素誘導ROS積聚激活JNK，進而啟動線粒體介導的細胞凋亡。雷公藤紅素通過ROS積聚誘導HSP90客戶蛋白表達下調(diào)，并通過抑制線粒體呼吸鏈復合體I活性促進ROS積聚。雷公藤紅素誘導產(chǎn)生的ROS可以激活多種信號通路，如包括p38、JNK和ERK1/2在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族成員進而誘發(fā)細胞凋亡[31]。研究表明，雷公藤紅素3 μmol/L處理人骨肉瘤HOS細胞24 h可誘導發(fā)生凋亡，該作用是通過上調(diào)ERS相關蛋白[兔抗人結合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）、p-蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇依賴酶1α、鈣聯(lián)蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶]、凋亡相關蛋白（CHOP、Caspase-12）和Caspase-3的表達等[32]。Yoon等[33]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素通過誘導細胞凋亡來殺死乳腺和結腸癌細胞系，這種細胞死亡模式的特征是通過擴張內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體而出現(xiàn)廣泛的空泡化。雷公藤紅素誘導活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、CHOP、賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸受體的積累，同時通過線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體介導的線粒體Ca2+攝取、三磷酸肌醇受體介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。雷公藤紅素通過誘導線粒體功能障礙從而增加ROS生成，破壞線粒體膜，促進Cyt-c的釋放，進而激活Caspase-3和Bax的表達，誘導人肝癌HepG2細胞凋亡[34]。雷公藤紅素誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制見圖1。

圖1 雷公藤紅素誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制Fig.1 Mechanisms of celastrol inducing apoptosis in tumor cells

1.1.2 阻滯細胞周期 細胞周期的調(diào)控由細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）、CDKs抑制劑三者共同協(xié)調(diào)完成[35]。研究表明，雷公藤紅素通過下調(diào)miR-21的表達明顯抑制細胞增殖，并抑制細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和CDK6的表達，誘導G2/M細胞周期阻滯[36]。雷公藤紅素上調(diào)G2/M期相關蛋白細胞周期檢測點激酶2（checkpointkinase 2，Chk2）、磷酸化Chk2（phosphorylate Chk2，p-Chk2）、p-周期蛋白依賴性激酶 1（cyclin-dependent kinases 1，Cdc2）和p-Cdc25C的表達，下調(diào)Cdc25C的表達，增加Cyclin B1的表達。此外，雷公藤紅素還增加了p21的蛋白質(zhì)水平，阻斷Cdk1/Cyclin B1的激活[31]。Li等[17]分別用雷公藤紅素0.25、0.5、1 μmol/L處理人卵巢癌SKOV3細胞24 h，當雷公藤紅素劑量為1 μmol/L時可以顯著抑制Cyclin D1、CDK2、CDK4和Bcl-2的下調(diào)以及Caspase-3的增加，從而顯著抑制G2/M期細胞的活力并誘導凋亡和細胞周期停滯。另一項研究表明雷公藤紅素通過上調(diào)p-Chk2、Chk2、p-Cdc25C、p-Cdc2、p21和Cyclin B1的表達，并下調(diào)Cdc25C和Cdc2的表達，誘導G2/M期的細胞蓄積，并且G0/G1和S期相應減少[25]。Cyclin E是一種核蛋白，與CDK2締合，并在G1期晚期形成活性復合物，引導其進入S期。在雷公藤紅素處理的人骨髓瘤RPMI-8226細胞中發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)Cyclin D1和Cyclin E水平，上調(diào)p21和p27水平誘導細胞凋亡[37]。雷公藤紅素阻滯腫瘤細胞周期的作用機制見圖2。

圖2 雷公藤紅素阻滯腫瘤細胞周期的作用機制Fig.2 Mechanism of celastrol blocking tumor cell cycle

1.2 抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移

癌癥患者的死亡通常是由于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移造成的。細胞黏附是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程中的關鍵步驟，阻斷這一步驟被認為是預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的合理策略。實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新形成的鄰近血管的血液供應。因此，腫瘤血管成為潛在治療干預的關鍵靶點[38]。據(jù)研究報道，雷公藤紅素抑制β-1整合素介導的活性從而抑制人臍靜脈內(nèi)皮HUVECs細胞與纖連蛋白的黏附。Ke等[38]用1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL雷公藤紅素作用于HUVECs細胞1 h，細胞黏附率分別降至87%、68%、52%、46%。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，用雷公藤紅素處理人肺癌95-D細胞和小鼠黑色素瘤B16F10細胞，可以明顯抑制該細胞外基質(zhì)黏附。這種抑制是通過增強β-1整合素配體親和力以及降低黏著斑激酶磷酸化實現(xiàn)的[39]。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖通過激活細胞表面受體toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）促進血管生成，雷公藤紅素可以下調(diào)脂多糖誘導的人多發(fā)性骨髓瘤Lp-1細胞上TLR4的表達[40]。雷公藤紅素還可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌以及Akt/一氧化氮合酶信號轉(zhuǎn)導[41]。關于雷公藤紅素抑制腫瘤細胞遷移的通路，有報道表明雷公藤紅素誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡并抑制Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）通路。研究者用VEGF 50 ng/mL和雷公藤紅素0、0.5、1、2、5 μmol/L共同處理PC-3細胞后，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素以濃度相關地方式有效抑制VEGF觸發(fā)的HUVECs細胞的mTOR信號級聯(lián)反應，包括Akt、mTOR和S6K激酶的激活，提示雷公藤紅素通過阻斷mTOR信號通路抑制腫瘤血管生成[42]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是癌癥侵襲的重要組成部分，用雷公藤紅素0、0.1、0.5、1 μmol/L處理HepG2細胞后，通過免疫印跡法檢測到雷公藤紅素以劑量相關地方式顯著降低MMP-2和MMP-9蛋白水平，進一步的研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-224的表達可以降低MMP-9的蛋白水平[43]。同樣，Ma等[44]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素通過抑制mTOR/p70S6K/真核生物翻譯起始因子4E和ERK信號通路來抑制缺氧誘導的缺氧誘導因子1α的激活，從而抑制VEGF的表達。

1.3 誘導腫瘤細胞自噬

自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，從而實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。p62在氧化應激反應途徑中起著關鍵作用[45]。p62表達的增加也可能與ROS的產(chǎn)生有關。Liu等[31]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素觸發(fā)了自噬，并上調(diào)了程序性死亡受體-1和微管相關蛋白輕鏈3B（microtubule-associatedprotein light chain 3 B，LC3B）的表達以及p62的水平，通過激活ROS/JNK信號通路和抑制Akt/mTOR信號通路，同時觸發(fā)膠質(zhì)瘤細胞凋亡和自噬。同樣，在HOS細胞和人骨肉瘤MG-63細胞中，Li等[25]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素誘導的LC3B-II表達的增加。雷公藤紅素1.2 μmol/L作用于人宮頸癌HeLa細胞12 h，可觀察到LC3點的形成和聚集，提示雷公藤紅素可誘導自噬小體的形成。雷公藤紅素處理的HeLa細胞12 h內(nèi)，上調(diào)自噬標志物LC-3I轉(zhuǎn)化為LC-3Ⅱ和LC3來誘導腫瘤細胞系[46]。此外，Guo等[47]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素下調(diào)雄激素受體及其靶標miR-17-92a，從而導致前列腺癌細胞自噬。

1.4 抑制炎癥應激

炎癥被認為是對病原體或受損細胞的生物反應。長時間的炎癥應激會引起過敏癥狀和許多疾病的進展，包括腫瘤的生成。炎癥的發(fā)生通常與NFκB調(diào)節(jié)的細胞因子有關，如TNF-α和IL-1β，然后抑制TNF-α誘導的抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xL和Survivin）、侵襲（如MMP-9）和血管生成相關蛋白的基因表達來發(fā)揮抗腫瘤作用。雷公藤紅素已顯示出對炎癥介導的腫瘤細胞的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可以通過調(diào)節(jié)Notch信號通路抑制腫瘤增殖，誘導人白血病U937細胞凋亡[48]。在人腦星形膠質(zhì)瘤細胞中，雷公藤紅素下調(diào)黏附分子（如細胞間粘附分子-1/血管細胞粘附分子1）和趨化因子[如單核細胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，CCL2）、CXC趨化因子8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和CXCL10]的表達。研究者通過使用雷公藤紅素處理人腦星形膠質(zhì)瘤CRT-MG細胞發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素通過抑制JNKMAPK-STAT1/NF-κB信號調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)的表達[49]。同樣，另一項研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素通過NF-κB調(diào)節(jié)的趨化因子（CCL2、CXCL10、CXCL12、CCR2和CXCR4）基因抑制人類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜RA-FLSS細胞的增殖和侵襲[50]。

2 聯(lián)合用藥

2.1 抗腫瘤作用機制

雷公藤紅素作為目前具有抗腫瘤前景的中藥活性成分之一，雷公藤紅素的臨床應用受到了嚴重的肝、腎毒性以及免疫抑制限制。迄今為止，對于許多類型的腫瘤，聯(lián)合治療被認為是臨床上優(yōu)選的治療過程。藥物聯(lián)合使用產(chǎn)生的協(xié)同作用可以提高單獨用藥治療功效，從而減少每種藥物的劑量，為患者帶來更好的耐受性，減輕藥物毒副作用。此外由于不同藥物的不同作用機制，單一用藥經(jīng)常會使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，聯(lián)合療法降低了耐藥性的風險。因此，雷公藤紅素聯(lián)合用藥為腫瘤治療提供了新的機遇。具體聯(lián)合作用機制主要包括抗腫瘤多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞自噬等。

2.1.1 協(xié)同增敏，逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR 腫瘤MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時，對于結構和作用機制不同的多種化療藥物表現(xiàn)出的交叉抵抗現(xiàn)象，是腫瘤難治療、易復發(fā)的主要原因之一。研究表明，雷公藤紅素聯(lián)合其他藥物增敏是解決腫瘤MDR的一種可靠方法。Lu等[51]發(fā)現(xiàn)TNFα與醉茄素A 2.5 μmol/L或雷公藤紅素0.5 μmol/L聯(lián)合作用時，以劑量相關地方式激活Caspase-3、9，下調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP），誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡。這種結合還導致蛋白酶體靶蛋白IκBα的積累，從而抑制NF-κB信號的激活，從而使MDA-MB-231細胞對醉茄素A和雷公藤紅素增敏。有研究者探討了雷公藤紅素聯(lián)合表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs）對T790M突變?nèi)朔伟〩1975細胞生長的影響及可能的機制，結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥抑制H1975細胞EGFR、STAT3、p-Akt和p-ERK的表達和磷酸化，提示通過抑制p-EGFR途徑抑制H1975細胞的侵襲[52]。同時，體內(nèi)實驗也證明了雷公藤紅素聯(lián)合EGFR-TKIs對小鼠腫瘤生長具有更顯著的抑制作用。Boridy等[53]通過雷公藤紅素與替拉替尼聯(lián)用，抑制了HSP90靶向蛋白毒性應激反應，可使人膠質(zhì)母細胞瘤對雷公藤紅素治療增敏，增加多泛素化聚集體和p62積累，直接影響蛋白穩(wěn)定，從而克服膠質(zhì)母細胞瘤中的MDR。雷公藤紅素除了與藥物聯(lián)用可以增加抗腫瘤效果以外，還可以通過增強肺癌細胞輻射敏感性來對抗腫瘤。Lee等[54]檢測了雷公藤紅素的放射增敏活性，結果表明EGFR、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，ErbB2）和Survivin水平降低，絲氨酸（serine，Ser）15和Ser20殘基磷酸化同時抑制其蛋白酶體降解以及上調(diào)p53水平。

2.1.2 誘導腫瘤細胞凋亡 Yan等[15]對拉帕替尼5 μmol/L與雷公藤紅素5 μmol/L聯(lián)合誘導HER2/neu高表達的人乳腺癌MDAMB-453細胞凋亡進行研究，發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合可以通過上調(diào)凋亡相關蛋白（Caspase-9、3），下調(diào)生長途徑相關蛋白（HER2、p-HER2、p-Akt和p-ERK1/2）以及降低HER2膜蛋白表達來增強細胞的凋亡和生長抑制。Zhu等[55]發(fā)現(xiàn)Bcl-2抑制劑ABT-737 10 μmol/L與雷公藤紅素1.25 μmol/L聯(lián)合應用可協(xié)同抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。其作用的通路包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡和線粒體參與的內(nèi)源性信號途徑等。線粒體參與的內(nèi)源性信號途徑具體包括增強Caspase-3和PARP的裂解作用，誘導Bax積累，降低Bcl-2和Bcl-xL表達水平，同時上調(diào)Bim和重組p53，上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（recombinant p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）的表達及Cyt-c的釋放。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被激活，ATF4和CHOP蛋白的表達增強，eIF2α磷酸化的增加誘導了Noxa的激活。人類髓細胞白血病-1（myeloid leukemia cell-1，Mcl-1）作為一種重要的凋亡因子，由于其與ABT-737的親和力較弱而不能使ABT-737發(fā)揮出較強的腫瘤殺傷活性。將ABT-737與雷公藤紅素聯(lián)用促進了Noxa與Mcl-1的相互作用，導致Mcl-1的表達減少從而增強了細胞凋亡。在研究人惡性腦膠質(zhì)瘤U87-MG細胞的實驗中發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素聯(lián)合TRAIL可以通過上調(diào)DR5表達并激活Caspase-8、Caspase-3和PARP誘導死亡受體途徑的凋亡[56]。雷公藤紅素聯(lián)合順鉑也通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑促進人骨肉瘤U-2OS細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)其作用靶點包括上調(diào)Cyt-c、Caspase-3和C/EBP同源蛋白的表達，下調(diào)Bcl-2、PARP、葡萄糖（相對分子質(zhì)量78 000）調(diào)節(jié)蛋白和Caspase-9的表達[57]。

2.1.3 抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移 Zhang等[58]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素和索拉非尼聯(lián)用可以抑制Akt途徑和VEGF自分泌系統(tǒng)增強對HepG2細胞和小鼠肝癌Hepa1-6細胞的抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)miR-33a-5p在肺腺癌組織中表達下調(diào)，提示miR-33a-5p可能是一種抑癌基因[59]，且經(jīng)雷公藤紅素處理后，miR-33a-5p表達上調(diào)，其上調(diào)可以增強細胞對雷公藤紅素的敏感性，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。通過免疫印跡法顯示其抗腫瘤作用的機制主要是由于雷公藤紅素上調(diào)miR-33a-5p的表達，miR-33a-5p的高表達抑制mTOR及其下游效應（mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1的表達下降）。此外，有研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可與5-氟尿嘧啶、鹽霉素、誘導型一氧化氮合成酶抑制劑1400W和LNIO聯(lián)合應用增強抑制人結腸癌HT-29和HCT116細胞的增殖、遷移[60]。進一步研究表明雷公藤紅素抑制大腸癌細胞的血管生成主要是通過抑制血管生成途徑中的關鍵基因[胸腺嘧啶核苷酸磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）、人血管內(nèi)皮鈣黏蛋白5（cadherin 5，CDH5）、血小板反應蛋白2（thrombospondin 2，THBS2）、瘦素（leptin，LEP）、MMP-9和TNF]和蛋白（IL-1β、MMP-9、血小板衍生生長因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑E1和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-4）的表達。Shanmugam等[61]報道了通過雷公藤紅素與硼替佐米聯(lián)合使用可以抑制CXCR4和MMP-9的表達，降低血清IL-6和TNF-α水平來抑制多發(fā)性骨髓瘤MM細胞的侵襲和遷移，這可能成為治療骨髓瘤和其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效途徑。

2.1.4 阻滯細胞周期 Jiang等[62]將雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)用處理人肺癌H1299細胞和人非小細胞肺腺癌H157細胞后，用PI染色流式細胞儀檢測細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)用可誘導2種腫瘤細胞的G2/M期積聚和G0/G1期減少。為進一步探討雷公藤甲素和雷公藤紅素阻滯細胞周期的分子機制，采用免疫印跡法檢測了細胞周期相關蛋白的表達。結果表明，這種機制主要是通過顯著上調(diào)G2/M期細胞周期調(diào)控蛋白CDK1、Cyclin B和p21蛋白水平以及降低CDK2/4/6、Cyclin D/E、膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）、p27蛋白水平來實現(xiàn)的。同樣，有研究者發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素1 μmol/L和柳氮磺胺吡啶600 μmol/L聯(lián)用可以誘導人膠質(zhì)瘤SNB-19細胞在G2/M期的進展明顯受阻，受阻率達到46.6%[63]。

2.1.5 誘導腫瘤細胞自噬 細胞自噬同樣是抑制腫瘤細胞增殖的重要方式，Duan等[64]用雷公藤紅素聯(lián)合鞣花酸處理人肺癌HOP62細胞和H1975細胞后，檢測了綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的LC3陽性自噬小體的形成。實驗發(fā)現(xiàn)與單獨在細胞中使用鞣花酸25 μmol/L或雷公藤紅素0.75 μmol/L進行處理相比，聯(lián)合治療可誘導細胞核和線粒體中的GFP-LC3點顯著增加和LC3-II積累，下調(diào)p-Akt并抑制mTOR磷酸化和p70S6K的表達，此外還降低蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）表達。靶向雄激素受體（androgen receptor，AR）軸是前列腺癌治療的標準策略，miR-101是一種自噬的抑制劑，Guo等[65]發(fā)現(xiàn)AR通過反式激活miR-101來抑制自噬。因此miR-101模擬物與雷公藤紅素聯(lián)合應用治療前列腺癌可能是一種有前途的治療方法。

雷公藤紅素聯(lián)合應用抗腫瘤機制見表1。

表1 雷公藤紅素聯(lián)合應用抗腫瘤作用機制Table 1 Antitumor mechanism of celastrol in combination

續(xù)表1

2.2 藥物遞送系統(tǒng)用于雷公藤紅素的聯(lián)合抗腫瘤

雖然雷公藤紅素聯(lián)合其他藥物有著良好的抗腫瘤效果，但由于其各種物理化學和藥動學限制，如低水溶性、低生物利用度和靶向性不足，限制了這些化合物在臨床中的使用。納米技術在藥物傳遞領域的積極探索為聯(lián)合用藥抗腫瘤帶來了新思路。納米粒通過粒徑控制、結構改造和表面修飾等途徑，可具有較強的載藥能力、體內(nèi)長循環(huán)、腫瘤組織被動或主動靶向等特點[35]。鑒于納米技術的優(yōu)勢，納米載體與前景較好的中藥相關單體活性化合物的結合，對于探索藥物與細胞相互作用的相關機制，促進納米載體在臨床治療中的潛在應用具有重要意義。

2.2.1 與化療藥物聯(lián)合用于藥物遞送系統(tǒng) 有研究報道將雷公藤紅素負載到介孔二氧化硅納米顆粒中，將阿西替尼負載到聚乙二醇化脂質(zhì)雙層中，制備了負載阿西替尼/雷公藤紅素的復合納米顆粒，得到的納米粒粒徑約為120 nm，多分散指數(shù)狹窄（約0.07）。體外細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)復合納米顆粒能有效地抑制血管生成和線粒體功能，并能有效地內(nèi)化小鼠鱗狀細胞癌SCC-7細胞、人乳腺癌BT-474細胞和人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞。在異種腫瘤模型中，復合納米顆粒組小鼠的抑瘤率明顯高于其他組，抑瘤率達到64%[79]。Hu等[80]將疏水的雷公藤紅素和親水性的吲哚胺2,3-加雙氧酶抑制劑1-甲基色氨酸同時負載到透明質(zhì)酸包被的陽離子白蛋白納米粒（hyaluronic acid coated cationic albumin nanoparticle，HNPs）中，所得納米粒平均粒徑約為300 nm，實現(xiàn)了層次化的納米結構，并有效地將小分子藥物輸送到胰腺腫瘤部位。在透明質(zhì)酸酶存在的情況下，HNPs的粒徑減小，以促進深入腫瘤組織的滲透。在C57BL/6小鼠移植模型中的生物分布研究表明，HNPs增加了腫瘤的積聚，延長了HNPs的循環(huán)時間。與單獨使用雷公藤紅素相比，雷公藤紅素聯(lián)合1-甲基色氨酸通過改善腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，增強了抑制腫瘤的效果。同時HNPs可減輕體內(nèi)使用雷公藤紅素的不良反應如心臟毒性，提高安全性。在促結締組織增生性黑色素瘤中，腫瘤細胞和腫瘤相關成纖維細胞的纖維化以及腫瘤微環(huán)境的免疫抑制影響了抗腫瘤的療效。為了解決這一難題，Liu等[81]開發(fā)了一種基于米托蒽醌和雷公藤紅素靶向遞送的創(chuàng)新化學免疫策略，研究發(fā)現(xiàn)當米托蒽醌和雷公藤紅素以最佳比例（5∶1）有效地共傳遞到腫瘤部位時顯著地觸發(fā)了免疫原性腫瘤細胞凋亡并恢復了腫瘤抗原識別，從而激發(fā)了整體的抗腫瘤免疫，通過協(xié)同作用減少了藥物用量和不良反應。納米載體介導的化學免疫治療成功地重塑了纖維化和免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，阻止了腫瘤的發(fā)展，并進一步抑制了腫瘤向主要器官的轉(zhuǎn)移。

2.2.2與中藥活性成分聯(lián)合用于藥物遞送系統(tǒng) 秦越等[82]采用經(jīng)典的薄膜水合的方法制備了基于丹參酮IIA磺酸鈉和小粒徑的雷公藤紅素微乳的多組分脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體通過最初釋放丹參酮IIA磺酸鈉表現(xiàn)出協(xié)同的抗乳腺癌活性用于調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，隨后釋放雷公藤紅素微乳以消滅腫瘤組織。體外研究表明，該脂質(zhì)體可誘導MCF-7細胞大量凋亡，表明其對腫瘤細胞具有協(xié)同的細胞毒性作用。此外，與單獨使用雷公藤紅素相比，該脂質(zhì)體的全身毒性較小。沈展等[83]采用“混勻-滴注”方法制備轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的β-欖香烯-雷公藤紅素共傳遞微乳用于協(xié)同靶向抗結直腸癌。通過四甲基偶氮唑鹽法得到β-欖香烯與雷公藤聯(lián)合給藥的最佳比例40∶1，對人結腸癌Lovo、HT-29細胞的半數(shù)抑制濃度半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（11.7±0.6）、（27.4±1.2）μg/mL，聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）分別為0.61、0.72。該微乳與Lovo細胞孵育4 h后的攝取量為7.2 μg/mg，是β-欖香烯＋雷公藤紅素給藥組的3.3倍。該微乳能夠引發(fā)59.2%的Lovo細胞凋亡，對荷Lovo大腸癌裸鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用。相比單獨使用雷公藤紅素，該微乳給藥組裸鼠的腫瘤組織HE染色切片出現(xiàn)大量的細胞壞死，Ki-67免疫組化切片顯示腫瘤細胞增殖被明顯抑制。另外有研究者構建了轉(zhuǎn)鐵蛋白和葉酸雙重修飾的薏苡仁油-雷公藤紅素微乳，平均粒徑為（52.52±0.11）nm，多分散指數(shù)為0.124±0.019，Zeta電位為（-21.50±1.70）mV，且具有較好的體外穩(wěn)定性。細胞實驗表明，該微乳對MCF-7、A549細胞的IC50分別為0.77、0.85 μmol/L，游離雷公藤紅素對MCF-7細胞的IC50值（1.52 μmol/L）高于各微乳組，提示微乳可能通過攝取增強來提高細胞毒性[84]。

2.2.3 與其他治療方式聯(lián)合用于藥物遞送系統(tǒng) 除了與常規(guī)的化療藥物和中藥活性成分聯(lián)合，雷公藤紅素還可以聯(lián)合靶向腫瘤微環(huán)境的載體實現(xiàn)靶向協(xié)同抗腫瘤。Tan等[85]將親脂性陽離子(4-羧丁基)三苯基溴化膦與類糖脂結合物偶聯(lián)，得到線粒體靶向結合物，再負載弱酸性藥物雷公藤紅素后，得到CTPP-線粒體靶向結合物/雷公藤紅素膠束，對線粒體堿性pH值（8.0）有選擇性的響應。受膠束疏水核心與雷公藤紅素之間較弱的相互作用所控制，在pH值為8.0時，雷公藤紅素具有較高的溶解性，該膠束對線粒體堿性pH有較強的選擇性。但在pH值為7.4、5.0時，藥物有緩慢的釋放行為，減少藥物在細胞質(zhì)和溶酶體中的滲漏。體內(nèi)實驗中，以MCF-7裸鼠移植瘤為模型，該膠束的抑瘤率為80.17%，明顯高于類糖脂結合物/雷公藤紅素（58.35%）和雷公藤紅素（54.89%）。光敏感型納米材料目前研究熱點之一，其中TiO2納米纖維作為生物相容性最好的半導體納米材料之一，可以作為一種良好的光敏劑材料，在藥物載體和光動力療法治療疾病等領域顯示出潛在的應用前景。研究者將TiO2納米纖維引入雷公藤紅素后對所制備的納米進行表征，其表面呈針狀，寬度約為80 nm，長度為200～5000 nm。當雷公藤紅素和TiO2納米纖維結合后，在紫外線照射下HepG2細胞的凋亡率增加到43.9%，與對照組比較有顯著性差異。納米纖維與雷公藤紅素形成的納米復合材料還可以增強雷公藤紅素對HepG2細胞的細胞毒作用，降低藥物消耗，從而降低相關藥物的不良反應[86]。

3 結語

隨著越來越多中藥活性成分抗腫瘤研究的開展，中藥在抗腫瘤方面的作用在國內(nèi)外都得到了普遍認可。雷公藤紅素作為一種目前研究比較深入且具備較好成藥性的中藥活性成分，具有廣譜、多途徑、多靶點等特點，可以有效地抑制惡性腫瘤細胞和異種移植物。然而目前其作用機制仍有一部分尚未得到充分論證，為了進一步提高其在未來臨床實踐中的潛力，對于其抗腫瘤機制和免疫學靶點的研究是必不可少的。雖然雷公藤紅素具有良好的抗腫瘤作用，但還沒有上市藥品，主要是由于毒性較大，口服給藥后會引起胃腸道不良反應，且易產(chǎn)生全身性的不良反應，并且有報道發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素容易造成嚴重的器官毒性，如心臟、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)毒性，其有效劑量和毒性劑量還有待進一步探究[87-89]。另外，雷公藤紅素為難溶性物質(zhì)，口服生物利用度較低，上述因素嚴重限制了該藥物的臨床應用。

腫瘤發(fā)病機制復雜，單一的藥物治療難以達到預期的效果且容易產(chǎn)生耐藥性或嚴重的不良反應，使得抗腫瘤藥物的療效和長期使用相當有限。通過藥物聯(lián)合應用由于其作用機制不同，可以同時調(diào)節(jié)多種信號通路，從而起到協(xié)同增效的作用同時減少MDR現(xiàn)象和不良反應的發(fā)生。因此藥物的聯(lián)合治療已經(jīng)成為腫瘤治療的一種有效途徑，具有廣闊的前景。但聯(lián)合用藥易受不同藥物體內(nèi)代謝特性的影響，致到達腫瘤部位的藥量較少。納米遞藥系統(tǒng)可同時轉(zhuǎn)運2種或多種藥物，增加藥物溶解性，改善藥物的藥動學和藥理特性，提高藥物靶向性從而限制藥物在腎臟、肝臟、脾臟和其他非靶向器官中的蓄積等特點。因此，采用雷公藤紅素聯(lián)合用藥納米遞藥系統(tǒng)為藥物研發(fā)以及臨床運用提供了新道路。

即便如此，納米遞藥系統(tǒng)仍存在一些問題需要解決：（1）載藥率過低。在制備納米的時候注意材料的選擇，如選擇配體修飾及多孔結構的材料；此外制備工藝的考察篩選出最佳處方可以在一定程度上改善載藥率過低的問題；（2）在安全性方面，使用獲得上市許可的生物相容性較好的納米材料構建納米釋藥系統(tǒng)有望回避載體的安全性問題，尋找特異性更好的受體及相關配體也可以減少納米載體在其他正常組織中的分布，從而減少毒性；（3）代謝不穩(wěn)定。納米在進入人體以后還容易與一些蛋白形成蛋白冠，使得納米粒被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。多數(shù)納米載體特異性釋藥性能差，藥物被突然釋放，導致局部濃度過高產(chǎn)生較大的毒性。因此，如何改良藥物的緩控釋放性能，避免頻繁給藥，維持合適的血藥濃度，增加治療的穩(wěn)定性也是今后的研究方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突