毛蘭素的提取分離、化學(xué)合成和生物活性的研究進(jìn)展

高 園，蔣松偉，戚 香，黃昌港，惠 子*，葉向陽，謝 恬, *

1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣東藥科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院），廣東 廣州 510080

2.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，浙江省欖香烯類抗癌中藥重點(diǎn)實(shí)驗室，浙產(chǎn)中藥材資源開發(fā)與應(yīng)用浙江省工程實(shí)驗室，浙江省浙八味等浙產(chǎn)中藥材綜合利用開發(fā)2011協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 311121

毛蘭素最早是從蘭科的足莖毛蘭中提取分離得到的，故此而得名[1]。后來發(fā)現(xiàn)毛蘭素廣泛存在于各種石斛品種中。毛蘭素的分子式C18H22O5，相對分子質(zhì)量318.364 3，化學(xué)名2-甲氧基-5-[2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-乙基]-苯酚[2]，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，毛蘭素是2個多取代苯環(huán)通過2個飽和碳原子連接起來。這2個多取代苯環(huán)含有多個甲氧基和1個酚羥基取代基。純品毛蘭素為無色晶體，密度1.147 g/cm3，沸點(diǎn)439.1 ℃，閃點(diǎn)219.4 ℃，mp 78.5～79 ℃，遇光易變色，應(yīng)密封遮光，貯存于干燥、陰涼、通風(fēng)良好處，若長時間暴露在空氣中，含量會有所降低，很可能是多取代酚醚和酚官能團(tuán)在空氣中易被氧化的緣故[3]。毛蘭素的多取代酚醚和酚官能團(tuán)，很可能是毛蘭素的生物活性（抗病毒、抗菌、抗炎和抗癌活性）的來源所在。如與毛蘭素結(jié)構(gòu)相似的化合物combretastatin A-4（CA-4）也具有顯著的抗腫瘤活性。CA-4與毛蘭素結(jié)構(gòu)上的微小差異在于毛蘭素的2個芐位飽和碳變成了不飽和的烯烴。這種從南非植物南非灌木矮柳樹Combretum caffrumEckl.&Zeyh.中分離出來的一種新生血管抑制劑，能抑制腫瘤演進(jìn)過程中異常血管的形成，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，也是一種有前景的抗腫瘤候選藥物[4-6]。

圖1 毛蘭素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of erianin

關(guān)于毛蘭素及其衍生物的抗腫瘤活性研究已有文獻(xiàn)報道，并有相關(guān)的綜述[2,7-8]。但所涉及的文獻(xiàn)大部分為2015年之前的，尚未有系統(tǒng)總結(jié)毛蘭素提取和化學(xué)合成方法的綜述。因此，本文對毛蘭素的提取分離和化學(xué)合成進(jìn)行了歸納和總結(jié)，并對2016年以來有關(guān)毛蘭素的文獻(xiàn)進(jìn)行了梳理，主要包括毛蘭素生物活性及作用機(jī)制方面的新進(jìn)展，以及在治療牛皮蘚和抗菌、抗炎等方面的應(yīng)用。本文旨在通過系統(tǒng)的歸納，為今后毛蘭素相關(guān)領(lǐng)域的深入研究、開發(fā)和綜合利用（包括藥物化學(xué)方面的結(jié)構(gòu)修飾及圍繞毛蘭素的創(chuàng)新藥物研究）提供理論基礎(chǔ)。

1 提取分離

毛蘭素廣泛存在于多種石斛中，可直接從石斛中提取分離獲得毛蘭素。截至目前為止，已發(fā)現(xiàn)多種石斛屬植物如鼓槌石斛、鐵皮石斛、金釵石斛、球花石斛、流蘇石斛、球花石斛、長蘇石斛、小黃花石斛、大苞鞘石斛、兜唇石斛等，均含有一定量的毛蘭素。首先要對石斛中的毛蘭素進(jìn)行定性定量檢測，羅陽等[9]建立了一種檢測石斛中7種化學(xué)成分的反相高效液相色譜-紫外光譜法（RP-HPLCUV），用此方法檢測出21種石斛中有11個品種含有毛蘭素，其中鼓槌石斛中的毛蘭素高達(dá)0.120 3%，顯著高于其他品種。母多等[10-11]研究了6個石斛品種的HPLC指紋圖譜，經(jīng)與毛蘭素對照品對照，確認(rèn)這6個石斛品種均含有毛蘭素。此方法可用于對毛蘭素進(jìn)行定性分析，也證實(shí)了在6種被測定的石斛品種中鼓槌石斛中含有最多的毛蘭素（0.135 1%）。張聰[12]建立一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法對12種石斛進(jìn)行定性定量檢測，只發(fā)現(xiàn)鼓槌石斛、金釵石斛、流蘇石斛這3種石斛里含有毛蘭素，依次含有0.16%、0.06%、0.04%。張聰[12]測定的鼓槌石斛中毛蘭素的含量略高于羅陽等[8]和母多等[10-11]的檢測結(jié)果，這可能是由于鼓槌石斛產(chǎn)地不同的原因。

Liu等[13]報道了一種可篩選和測定石斛中酚類物質(zhì)的超高效液相色譜-微型質(zhì)量檢測器，可同時測定12種酚類物質(zhì)，包括雙芐基、菲和氟酮等亞型。其中雙芐基化合物含量最高，而雙芐基化合物的典型代表則為毛蘭素。通過建立毛蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積之間的關(guān)系，可對毛蘭素進(jìn)行定量分析。Li等[14]采用RP-HPLC對鐵皮石斛中提取的毛蘭素進(jìn)行定性和定量，通過對各種提取方法的檢測和比對，提出了快速有效的提取鐵皮石斛中毛蘭素的工藝流程。

從以上研究可以看出毛蘭素廣泛存在于多種石斛中，可直接從石斛中提取分離獲得純品毛蘭素。這是最初獲得毛蘭素的途徑。用該途徑獲得毛蘭素所需要解決的關(guān)鍵問題是如何比較高效地提取，且得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的純品。肖志勇等[15]報道了一種從鐵皮石斛中提取高純度毛蘭素的方法：將新鮮鐵皮石斛洗凈加水?dāng)囁槌墒?，接著按體積比1∶4.5加入石油醚進(jìn)行多次萃取，合并石油醚層，濃縮成膏狀，再經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行梯度洗脫分離，得粗品；最后將粗品用二氯甲烷溶解后，進(jìn)行重結(jié)晶3～5次，即得毛蘭素白色結(jié)晶粉末，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為98%，收率在1.8%以上。該法為以毛蘭素為主要成分的抗腫瘤藥物的研究和制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

與肖志勇等[15]經(jīng)過石斛汁這個工藝略不同，雷世英[16]的工藝則是將石斛原料烘干、粉碎、再從石斛粉末中提取毛蘭素。方法為將新鮮的鐵皮石斛烘干并粉碎，用有機(jī)溶劑萃取，并濃縮至干；接著經(jīng)2～3次硅膠柱色譜分離；最后將含有毛蘭素的組分濃縮后進(jìn)行重結(jié)晶，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)在95%以上的純品毛蘭素，該工藝未報道具體的收率。

上述2種提取法原理大體相同，前一種用石斛汁，后一種從烘干粉碎后的原材料溶劑提取。所經(jīng)過的工藝包括萃取、濃縮、硅膠柱色譜分離、重結(jié)晶等步驟，并需要多次重復(fù)，才能得到純品毛蘭素。從結(jié)果來看前一種提取方法可以得到較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的毛蘭素。

2 化學(xué)合成

由于毛蘭素在石斛中的含量相對較低，且石斛生長條件較為苛刻，不少石斛品種如野生的鐵皮石斛是國家重點(diǎn)二級保護(hù)的珍稀瀕危植物，禁止采挖，因此尋求化學(xué)合成方法來替代或互補(bǔ)天然植物提取法是非常必要的?；瘜W(xué)合成法可以避免石斛屬植物過度開采而導(dǎo)致的個別寶貴種屬滅絕，從某種意義上保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。本文對毛蘭素的化學(xué)合成法進(jìn)行了歸納總結(jié)，并比較各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在為毛蘭素的結(jié)構(gòu)改造提供新的思路。

2.1 經(jīng)炔烴中間體合成

Petrov等[17]以廉價的愈創(chuàng)木酚（1）和3,4,5-三甲氧基苯甲酸（3）為原料制備毛蘭素（圖2）。先用氯乙酰氯保護(hù)原料1的羥基。所得的化合物2和化合物3進(jìn)行傅克?；磻?yīng)得到化合物4。在堿性條件下脫去酚保護(hù)基團(tuán)上的氯乙?；?，并與叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）進(jìn)行反應(yīng)得到化合物6。化合物6與三甲基硅重氮甲烷（TMSCHN2）經(jīng)過Colvin重排反應(yīng)直接轉(zhuǎn)化為炔烴7，再通過四丁基氟化銨（TBAF）脫去羥基保護(hù)基得到化合物8。最后催化氫化還原得到毛蘭素。該路線總收率為38.07%。在這條路線中，Colvin重排反應(yīng)是本合成法的關(guān)鍵。具體步驟見圖2。

圖2 經(jīng)炔中間體合成毛蘭素的路線Fig.2 Synthetic route of erianin via alkyne intermediate

2.2 經(jīng)烯烴中間體合成（Wittig反應(yīng)法）

2007年李亦平等[18]報道了以3,4,5-三甲氧基苯甲醛（9）和3-羥基-4-甲氧基苯甲醛（13）為原料制備毛蘭素（圖3）。從2個方向進(jìn)行，一方面先用硼氫化鈉（NaBH4）將化合物9還原為苯甲醇10，再用三溴化磷（PBr3）對化合物10進(jìn)行溴代反應(yīng)得3,4,5-三甲氧基芐溴（11），接著和三苯基膦（PPh3）反應(yīng)得到3,4,5-三甲氧基芐基三苯基膦溴鹽（12）。另一方面將化合物13的酚羥基先用芐基保護(hù)，得化合物14，再與12進(jìn)行Wittig反應(yīng)，得到烯烴15（順反異構(gòu)體混合物，比例不確定）。烯烴15在Pd/C催化氫化下雙鍵被還原，同時芐基保護(hù)基被脫去，得到毛蘭素，路線總收率33.3%，具體方法見圖3。

圖3 經(jīng)烯烴中間體合成毛蘭素的路線（Wittig反應(yīng)法）Fig.3 Synthetic route of erianin via alkene intermediate (Wittig reaction)

李亦平等[18]在進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗時，優(yōu)先選用的鹵素為Br，即3,4,5-三甲氧基芐溴，羥基保護(hù)基團(tuán)選用芐基、四氫吡喃基、乙?；⑹宥』?。當(dāng)然還有不少基團(tuán)可用作酚羥基的保護(hù)基，由于芐基脫保護(hù)方便，且可以和最后一步的催化氫化同時完成，故李亦平等[18]的發(fā)明中優(yōu)選為芐基。此外Wittig反應(yīng)中所用的堿也有多種選擇，李亦平等[18]采用叔丁醇鉀替代正丁基鋰，更便宜更安全，且操作簡便。這條合成路線化學(xué)原料簡便易得，所用試劑也較便宜，適宜工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。這條路線使用比較廣泛，吳范宏等[19]、陳雨文[6]、Ma等[20]、Marset等[21]、Lam等[22]都相繼報道過毛蘭素或毛蘭素類似物的合成方法，所涉及的路線和圖2大體相同，都是用取代的芐基三苯基膦溴化物[23]和取代苯甲醛進(jìn)行Wittig反應(yīng)，形成毛蘭素的關(guān)鍵二苯乙烯母核結(jié)構(gòu)。區(qū)別之處往往是在原料的選擇、羥基保護(hù)基團(tuán)的選擇、芐基三苯基膦鹵代物的選擇以及Wittig反應(yīng)所用的堿的選擇。如陳雨文[6]的路線采用的是叔丁醇鉀做Wittig反應(yīng)的堿，最后一步還原時用了5% Pd/C。Lam等[22]采用氯甲基甲醚來保護(hù)羥基，同時用芐基三苯基膦氯化物替代溴化物，最后用1 mol/L鹽酸回流1 h脫去甲氧基甲醚。Zhao等[24]也報道了毛蘭素類似物的合成方法，并合成了一些類似物，如羥基旁的甲氧基換成了乙氧基，并探討了其生物活性。

2.3 經(jīng)烯烴中間體合成（羥醛縮合法）

Zou等[25]采用羥醛縮合的方法構(gòu)建雙鍵，與Wittig反應(yīng)法有所不同（圖4）。首先用單質(zhì)溴在化合物16的芳香環(huán)進(jìn)行溴代，在甲氧基的鄰位引入溴得到化合物17。將化合物17和化合物9在三乙胺的作用下羥醛縮合并脫水，得烯烴化合物18，再通過親核取代反應(yīng)用羥基取代溴，隨后羧酸在喹啉（quinoline）、硫酸銅（CuSO4）的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)，最后催化氫化將雙鍵還原，得到毛蘭素，該路線總收率為30.8%。

圖4 經(jīng)烯烴中間體合成毛蘭素的路線（羥醛縮合法）Fig.4 Synthetic route of erianin via alkene (aldol condensation)

2.4 經(jīng)烯烴中間體合成（砜類法）

Wang等[26]報道了不同于上面2種方法的砜類合成法（圖5）。其關(guān)鍵就是經(jīng)過硫醚氧化為砜，進(jìn)而重排構(gòu)筑碳-碳雙鍵。芐醇21（從相應(yīng)的取代醛如化合物9和14還原得到）既可以經(jīng)光延反應(yīng)（Mitsunobu反應(yīng)）和硫代乙酸轉(zhuǎn)化為乙酸硫酯22，也可以與三溴化磷反應(yīng)得到芐溴23。乙酸硫酯22和芐溴23在氫氧化鉀（KOH）作用下發(fā)生了硫酯水解和烷基化反應(yīng)，一鍋生成不對稱硫醚24。硫醚24經(jīng)oxone氧化得二芐基砜類化合物25。二芐基砜在KOH、Al2O3和CF2Br2條件下反應(yīng)，得到以反式雙鍵為主的異構(gòu)體多取代二苯乙烯26（＞95%）。最后在Pd/C催化氫化下得到毛蘭素及類似物27，未報道總收率。

圖5 經(jīng)烯烴中間體合成毛蘭素的路線（砜類法）Fig.5 Synthetic route of erianin via alkene (sulfone method)

Robinson等[27]報道的合成方法與上述的合成方法相類似，但有2處不同：一是羥基保護(hù)基從芐基變?yōu)槭宥』谆柰椋═BDMS），相應(yīng)脫保護(hù)方法也有相應(yīng)改變；二是二芐基砜類變?yōu)槎揭蚁╊惢衔锏臈l件不同。Robinson等[27]采用C2F4Br2、t-BuOH、KOH-Al2O3，加熱下反應(yīng)12 h，這一步收率從原先47%升至89%（構(gòu)型比E∶Z為97∶3）。

3 生物活性

鐵皮石斛作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱、解毒和鎮(zhèn)痛的功效，常用作解熱劑和鎮(zhèn)痛劑。作為鐵皮石斛主要成分之一的毛蘭素具有多種藥理作用，包括抗氧化、抑制血管生成及腫瘤生長等，這在李震等[7]的文獻(xiàn)中已經(jīng)有總結(jié)。近年來有關(guān)毛蘭素的生物活性和藥理作用機(jī)制又有新的發(fā)現(xiàn)，除了抗腫瘤方面的獨(dú)特性外，文獻(xiàn)還報道了毛蘭素在對牛皮蘚的治療、抗菌、抗炎等方面也能發(fā)揮重要作用。本文對毛蘭素這些新的生物活性和作用機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié)。

3.1 抗腫瘤及作用機(jī)制

毛蘭素作為一種廣譜的抗腫瘤化合物，對多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。近期研究結(jié)果顯示，毛蘭素在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗中，對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞[28]、人骨肉瘤143B和MG63.2細(xì)胞[29]、人宮頸癌HeLa細(xì)胞[30]、人肺癌549細(xì)胞[31]、人膀胱癌EJ和T24細(xì)胞[32]、人結(jié)腸癌HCT-116和SW620細(xì)胞[33]、人乳腺癌T47D細(xì)胞[34]、肺癌2LL-IDO細(xì)胞[35]、肺癌H460和H1299細(xì)胞[36]、多種肝癌細(xì)胞[37-38]、鼻咽癌NPC-039和NPC-BM細(xì)胞[39]、多種口腔癌細(xì)胞[40]均顯示出了明顯的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（50%concentration of inhibition，IC50）見表1。近年來對于毛蘭素的作用機(jī)制已有大量研究，結(jié)果表明毛蘭素具有多種抗瘤作用機(jī)制。主要包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成和誘導(dǎo)腫瘤自噬。

表1 毛蘭素對不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of erianin on proliferation of different tumor cells

癌癥即惡性腫瘤，它是100多種相關(guān)疾病的統(tǒng)稱。當(dāng)身體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生突變后，它會不斷地分裂，不受身體控制，最后形成癌癥。人們身體內(nèi)所有器官都是由細(xì)胞組成。細(xì)胞增長和分化可滿足身體需要，這種有序的過程可保持人們身體健康。然而，如果細(xì)胞繼續(xù)分裂，這些額外的大量細(xì)胞就形成腫瘤。惡性腫瘤的細(xì)胞能侵犯、破壞鄰近的組織和器官[41]。毛蘭素在體外能夠有效抑制多種腫瘤細(xì)胞株的增殖，充分表明毛蘭素及其類似物具有治療各種癌癥的潛能。如何降低毛蘭素的毒性并保留其有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，一個主要的研究方向是對毛蘭素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和類似物的合成，研究構(gòu)效關(guān)系，這也是藥物化學(xué)家們一直在從事的研究領(lǐng)域。

3.1.1 阻滯細(xì)胞周期，抑制增殖 細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括分裂間期和分裂期。這個過程受到許多調(diào)控因子和調(diào)控蛋白的影響。若能干擾其中任一環(huán)節(jié)都將導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂而阻止細(xì)胞增殖。崔名揚(yáng)等[28]研究表明毛蘭素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的改變及阻滯細(xì)胞于G2期。從而對Caco-2細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用，且可通過線粒體途徑誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。Li等[30]研究了毛蘭素和陽性對照物紫杉醇對HeLa細(xì)胞內(nèi)的多個蛋白表達(dá)量的影響，闡述了毛蘭素通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和線粒體途徑將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，從而抑制細(xì)胞生長和導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。進(jìn)而推測毛蘭素具有治療宮頸癌的潛能。Zhu等[32]研究表明毛蘭素可通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)將EJ和T24細(xì)胞阻滯在細(xì)胞分裂周期的G2/M期，此外毛蘭素還可以通過啟動c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路，下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，改變線粒體膜電位來誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，致使膀胱癌細(xì)胞凋亡，而且毛蘭素對正常膀胱細(xì)胞無此作用。毛蘭素對患膀胱癌（EJ細(xì)胞）裸鼠的腫瘤生長抑制率為65%；Dong等[37]研究表明毛蘭素導(dǎo)致不可修復(fù)的DNA損傷，誘導(dǎo)G2/M期阻滯及異常有絲分裂，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。毛蘭素處理后，有絲分裂細(xì)胞異常增多，表明有絲分裂突變導(dǎo)致毛蘭素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。體內(nèi)實(shí)驗表明，毛蘭素能有效抑制肝癌的生長，并且對體內(nèi)其他正常器官毒性較小。

3.1.2 促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡效應(yīng) 細(xì)胞凋亡效應(yīng)在癌癥治療中起著重要作用 其中大多數(shù)癌癥治療藥物是通過激活凋亡因子或凋亡蛋白來發(fā)揮作用，使癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療癌癥的作用。鄧同興等[31]研究表明毛蘭素抑制超氧化物歧化酶活性，下調(diào)核因子E2相關(guān)因子2、醌氧化還原酶1和血紅素氧合酶-1表達(dá)，繼而導(dǎo)致ROS含量升高和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的啟動，進(jìn)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡；Tang等[33]研究表明毛蘭素通過啟動JNK信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯和凋亡，從而抑制SW620細(xì)胞的增殖，提供了治療結(jié)腸癌潛在可能性；Chen等[36]通過體內(nèi)、體外研究首次證實(shí)毛蘭素可以通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡和抑制肺癌細(xì)胞遷移而呈現(xiàn)高效、低毒的抗癌活性。進(jìn)一步研究顯示，誘導(dǎo)鈣離子依賴性鐵死亡是毛蘭素發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵分子機(jī)制。研究首次報導(dǎo)毛蘭素是一種新的鐵死亡誘導(dǎo)劑，并首次證實(shí)Ca2+/鈣調(diào)蛋白信號通路信號通路是其誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵靶點(diǎn)；Zhang等[38]研究表明毛蘭素可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體凋亡和免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗HepG2和SMMC-7721細(xì)胞活性，并且在體內(nèi)實(shí)驗?zāi)苊黠@抑制移植HepG2細(xì)胞小鼠腫瘤的生長，對正常組織毒性較??；Liu等[39]首次對毛蘭素在鼻咽癌上的活性進(jìn)行研究，毛蘭素通過線粒體膜交替、死亡受體激活和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（csyteine aspartic acic specific protease，Caspase）-3、8、9激活，顯著提高NPC-039和NPC-bm的凋亡激活，并明顯抑制細(xì)胞周期。磷酸化ERK1/2在毛蘭素處理的鼻咽癌細(xì)胞中也呈劑量相關(guān)性下降，可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Chen等[40]第1次報道了在口腔鱗狀癌細(xì)胞中毛蘭素通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和Caspase依賴性凋亡途徑發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。內(nèi)源性和外源性途徑都被發(fā)現(xiàn)參與了毛蘭素介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外，毛蘭素處理也增加了口腔鱗狀癌OSCC細(xì)胞的自噬。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，毛蘭素通過調(diào)控MAPK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。查桂平等[42]研究表明毛蘭素能夠有效抑制葡萄膜黑色素瘤C918、MUM-2B細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡，且其作用效果在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性，其作用機(jī)制與上調(diào)p21表達(dá)，抑制p38 MAPK表達(dá)有關(guān)，后者可削弱MAPK信號通路活化，并可活化細(xì)胞凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白Caspase-3從而誘導(dǎo)凋亡；Sun等[43]研究表明毛蘭素可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的表達(dá)來抑制T47D細(xì)胞遷移；毛蘭素還可下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡；此外，毛蘭素可下調(diào)周期蛋白依賴性激酶1、2、4、7、8、9、10的表達(dá)，致使乳腺癌細(xì)胞阻滯在G2/M期。

3.1.3 通過自噬抑制腫瘤細(xì)胞生長 細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老一樣，是十分重要的生物學(xué)現(xiàn)象，參與生物的發(fā)育、生長等多種過程。因此引發(fā)癌細(xì)胞自噬可成為一種新的抗癌療法。Wang等[29]研究表明毛蘭素可通過增加微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubule-associatedprotein light chain 3 B，LC3B）II蛋白，上調(diào)p62和Beclin-1的表達(dá)致使人骨肉瘤細(xì)胞自噬。且毛蘭素顯著誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯，通過ROS/JNK信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬。同時在脛骨內(nèi)注射143B細(xì)胞建立原位人骨肉瘤小鼠模型，ip給藥8 d，2 mg/(kg·d)，對照組每隔1天ip 5%二甲基亞砜，8 d后發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯比對照組較小，實(shí)驗小鼠的體質(zhì)量沒有明顯下降，也證明了在沒有明顯毒性的情況下，毛蘭素可以顯著降低移植瘤小鼠的腫瘤生長。Chen等[40]研究發(fā)現(xiàn)毛蘭素顯著提高了人舌鱗狀癌SAS和SCC9細(xì)胞中LC3-I和LC3-II的表達(dá)，降低了P62的表達(dá)。結(jié)果表明，毛蘭素能夠誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞自噬。

3.1.4 抑制腫瘤細(xì)胞血管生成 腫瘤形成機(jī)制復(fù)雜多樣。腫瘤生長速度快，早期診斷困難，無有效治療措施，預(yù)后差，死亡率高。血管生成是腫瘤細(xì)胞獲得充足的血液供應(yīng)和營養(yǎng)以維持其生長的機(jī)制之一[44]。毛蘭素通過抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮其抗腫瘤作用，Su等[45]研究認(rèn)為毛蘭素通過靶向調(diào)控酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）途徑及其下游基因基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9，調(diào)控吲哚胺2,3-雙加氧酶誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管生成，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的血管生成。

3.2 其他

3.2.1 抗細(xì)菌感染和抗炎作用 在對毛蘭素的近期研究中發(fā)現(xiàn)，毛蘭素具有抗細(xì)菌感染的活性。袁中偉等[46]研究表明毛蘭素對金黃色葡萄球菌的體外最小抑菌質(zhì)量濃度為512 μg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度大于1024 μg/mL，且毛蘭素可緩解金黃色葡萄球菌引發(fā)的腹膜炎。毛蘭素使通過結(jié)合分選酶A的活性中心來影響結(jié)合分選酶A的生物活性，且毛蘭素在體外金黃色葡萄球菌引起的腹膜炎有良好的緩解作用，可減輕金黃色葡萄球菌所導(dǎo)致的小鼠膿腫癥狀。Ouyang等[47]研究表明毛蘭素通過阻止表面蛋白的T-G肽鏈和脂質(zhì)II進(jìn)入和結(jié)合到生物活性中心，從而抑制革蘭陽性菌中的轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合分選酶A的結(jié)合，達(dá)到抗金黃色葡萄球菌感染的目的，毛蘭素對金黃色葡萄球菌的IC50值為（65.7±7.2）μmol/L。毛蘭素與結(jié)合分選酶A殘基Ile182、Val193、Trp194、Arg197和Ile199結(jié)合，通過疏水相互作用形成穩(wěn)定的鍵。此外，與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時，毛蘭素抑制了金黃色葡萄球菌與纖維連接蛋白的結(jié)合活性和生物膜的形成。在體內(nèi)實(shí)驗時，經(jīng)尾靜脈注射的毛蘭素可提高感染金黃色葡萄球菌小鼠的存活率。研究毛蘭素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠抗炎作用發(fā)現(xiàn)給藥3周可使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量和結(jié)腸長度增加，并且肝、脾、腎各臟器指標(biāo)及病理觀察證實(shí)，毛蘭素?zé)o細(xì)胞毒作用，具有改善免疫器官功能的作用。蛋白質(zhì)組學(xué)分析和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗表明，毛蘭素可調(diào)節(jié)血清和結(jié)腸組織中炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)因子和免疫趨化因子的水平，從而減少細(xì)胞過氧化損傷和減輕免疫炎癥反應(yīng)。Western blotting進(jìn)一步證實(shí)，毛蘭素抗?jié)冃越Y(jié)腸炎是通過抑制Toll樣受體4和STAT3信號通路介導(dǎo)的[48-49]。

此外，人們還報道了毛蘭素具有抗炎作用。Zhang等[50]研究表明，在糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)展過程中，毛蘭素通過減少細(xì)胞葡萄糖攝取和消除下游ERK1/2-核因子κB通路的后續(xù)啟動，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的視網(wǎng)膜炎癥，毛蘭素還能減輕活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子-α引起的血-視網(wǎng)膜屏障損傷。從而達(dá)到治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變。

3.2.2 抗病毒作用 Meng等[51]研究表明毛蘭素可通過誘導(dǎo)G2/M期阻滯而抑制人腸道EVD68病毒的產(chǎn)生，毛蘭素對感染人腸道病毒RD細(xì)胞的IC50為22.75 nmol/L，流式細(xì)胞儀顯示毛蘭素處理后和對照組相比，G2/M期細(xì)胞的比例從原來的（35.23±1.40）%增加到（96.94±1.01）%，并且經(jīng)形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)毛蘭素對EVD68感染誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。毛蘭素能夠起到抗EVD68病毒的作用，成為治療人腸道病毒的潛在藥物。

3.2.3 抑制視網(wǎng)膜內(nèi)血管生成作用 Yu等[52]發(fā)現(xiàn)毛蘭素可通過抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的生成來治療高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞病變。研究表明毛蘭素可通過抑制ERK1/2調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子1α、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2信號通路，減少ERK1/2、絲裂原活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶cRaf的磷酸化活性來減輕高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮RF-6A細(xì)胞的病變程度，且毛蘭素對正常的視網(wǎng)膜BV2細(xì)胞沒有此作用。

3.2.4 抗牛皮蘚作用 Mo等[53]發(fā)現(xiàn)毛蘭素對人永生化角質(zhì)形成HaCaT細(xì)胞具有增殖抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡。研究表明毛蘭素通過ROS的產(chǎn)生增加了JNK/c-Jun的表達(dá)，抑制了蛋白激酶B、絲/蘇氨酸激酶信號通路；此外，毛蘭素還能促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和聚(ADP-核糖)聚合酶的表達(dá)，最終抑制HaCaT細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡，而ROS抑制劑能逆轉(zhuǎn)這種作用。毛蘭素對HaCaT細(xì)胞的作用使其可能成為潛在的抗牛皮癬藥物。

4 結(jié)語

石斛屬植物已經(jīng)被制成多種中藥產(chǎn)品和保健品，是我國中藥瑰寶之一。石斛中存在的眾多天然產(chǎn)物中，毛蘭素是生物活性最為突出和廣泛的一種，且被研究最多。除了已經(jīng)報道的體內(nèi)、外對各種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用外，毛蘭素的生物活性范圍還在不斷地被拓展。如近年來人們發(fā)現(xiàn)了毛蘭素對治療牛皮蘚和抗菌等方面有著潛在的功效。這些新發(fā)現(xiàn)歸功于科學(xué)家們對毛蘭素研究的不斷深入。從藥物研發(fā)的角度來看，毛蘭素是單一的分子實(shí)體?，F(xiàn)有毛蘭素的研究成果顯示它很可能是潛在的臨床候選藥物或藥物研發(fā)的先導(dǎo)化合物。今后對毛蘭素的研究工作可能要轉(zhuǎn)入對毛蘭素的藥動學(xué)、成藥性、毒理學(xué)評價等領(lǐng)域，以及對毛蘭素藥物化學(xué)的優(yōu)化。本文對近年來有關(guān)毛蘭素提取分離、化學(xué)合成及生物活性等的研究成果進(jìn)行歸納和總結(jié)，旨在為毛蘭素藥物研發(fā)工作的進(jìn)一步推進(jìn)打下基礎(chǔ)，也可以激發(fā)新思路。這方面的深入研究有助于我國名貴中藥材的開發(fā)及利用，并進(jìn)一步推動中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突