MicroRNA-9通過SIRT1/NF-κB通路促進TNF-α誘導心肌細胞損傷的機制研究

張朝華，劉旭幫，朱銀川，湯建民

國家心血管病中心發(fā)布的數(shù)據顯示，我國心腦血管病患病人數(shù)已達到2.9億，心血管疾病引起的死亡占居民疾病死亡構成40%以上，是引起居民疾病死亡的首位疾病[1]。炎癥是引起心血管疾病患者心肌損傷的主要誘因之一，腫瘤壞死因子α（TNF-α）是體內重要的炎癥細胞因子，是心血管疾病引起心肌損傷的關鍵炎癥因子，在急性心肌梗死、冠狀動脈（冠脈）硬化及心力衰竭（心衰）等心血管疾病中起重要作用，誘導心肌細胞損傷和破壞心肌組織[2,3]。microRNA-9（miR-9）是一個新發(fā)現(xiàn)的微小非編碼RNA，被證實可參與神經干細胞分化[4]，且被證實參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究以人心肌細胞H9c2細胞作為研究對象，敲低H9c2細胞內miR-9表達以觀察miR-9對TNF-α誘導心肌細胞損傷的影響，探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器人心肌細胞（H9c2）購買自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心；RNAiso plus和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購買自日本TARAKA公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、Lipofectamine? 2000轉染試劑均購買自美國賽默飛世爾科技公司；CCK8試劑盒和熒光素酶報告基因檢測試劑盒購買自中國碧云天生物技術有限公司；GoTaq? qPCR Master Mix購買自中國Promega公司；SIRT1抗體、p65抗體及p-p65抗體均購買自Cell Signaling Technology公司；酶標儀購買自BIORAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞活性檢測在96孔培養(yǎng)板每孔中接種100 μl濃度為1×105個/ml的心肌細胞，加入不同濃度（0、5、10、15和20 μg/ml）的TNF-α作用24 h，空白對照組（Control組）中心肌細胞不添加TNF-α培養(yǎng)24 h；或加入10 μg/ml的TNF-α刺激不同的時間（0、12、24、48和72 h），空白對照組（Control組）為心肌細胞不添加TNF-α分別培養(yǎng)不同時間（0、12、24、48和72 h）；最后，向每孔加入10微升CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，使用酶標儀在450 mm波長處讀取OD值。TNF-α刺激組細胞活性=[（TNF-α刺激組OD450-空白對照組OD450）/空白對照組OD450]×100%。

1.2.2 miR-9表達水平檢測10 μg/mL的TNF-α刺激心肌細胞24 h，通過胰酶消化作用以收集細胞，向心肌細胞中加入適量的RNAiso以提取RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的RNA反轉錄成cDNA。 PCR參數(shù)設定：37℃ 60 min；85℃ 5 s。RT-qPCR：根據GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒說明書制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進行擴增。PCR參數(shù)設定：95℃，30 s；[90℃ 5 s，65℃ 30 s]-40個循環(huán)。以U6為內參，用2-△t△t法計算目的基因的相對表達量。PCR引物如下：miR-9-F：5'-ACACTCC AGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3'；miR-9-R：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6-F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， U6-R：5'-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與轉染H9c2細胞均培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件是37℃，5%CO2。根據按照Lipofectamine? 2000轉染試劑盒說明書所示的轉染步驟將miR-NC（5'-GCUUAACCAUGCGACUAUUA-3'）或miR-9-inhibitor (5'-AGAAACCA AUGCGACAUACU-3'）分別轉入H9c2細胞內。轉染6 h后，更換細胞培養(yǎng)基，然后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)到37℃和5%CO2條件下以用于后續(xù)實驗。

1.2.4 熒光素酶基因報告通過PCR技術擴增miR-9的3'-UTR的SIRT1結合基因序列，將野生型（WT）或突變型（MUT）的SIRT1基因序列克隆到pmirGLO質粒上以獲得pmirGLO- SIRT1 WT/MUT，使用Lipofectamine? 2000轉染試劑將重組質粒與miR-NC或miR-9-inhibitor一起轉入H9c2細胞中。48 h后，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明所述步驟檢測熒光素酶活性。

1.2.5 蛋白表達檢測經不同條件處理后的H9c9細胞被收集以用于提取細胞總蛋白。通過10% SDSPAGE分離50 μg總蛋白。將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用磷酸鹽緩沖溶液洗滌膜3遍后，將膜與SIRT1抗體、p65抗體以及p-p65抗體等在4℃孵育過夜。室溫下添加二抗孵育2 h。用磷酸鹽緩沖液-洗滌3次后，加入ECL溶液（WBKLS0100，北京新晶科生物技術有限公司，中國）進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析方法研究數(shù)據由Grahpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α以劑量和時間依賴性降低心肌細胞活性使用不同濃度的TNF-α刺激心肌細胞（H9c2）24 h，然后通過CCK8試劑盒測定H9c2的細胞活性，結果顯示：TNF-α刺激H9c2細胞的濃度越高，H9c2細胞的活性就越低，與不加TNF-α的Control組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖1A。使用10 μg/mL的TNF-α刺激心肌細胞（H9c2）不同時間，檢測H9c2的細胞活性，結果顯示：TNF-α刺激H9c2細胞的時間越久，H9c2細胞的活性越低，與不加TNF-α的Control組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖1B。

圖1 TNF-α誘導心肌細胞損傷具有劑量和時間依賴性

2.2 TNF-α以劑量和時間依賴性促進心肌細胞表達miR-9使用不同濃度的TNF-α刺激心肌細胞（H9c2）24 h，收集細胞、提取細胞總RNA以檢測miR-9表達，結果顯示：TNF-α濃度越高，H9c2細胞中miR-9的表達水平越高，與0 μg/ml TNF-α刺激組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖2A。使用10 μg/ml的TNF-α分別刺激心肌細胞（H9c2）不同時間，收集細胞、提取細胞總RNA以檢測miR-9表達，結果顯示：TNF-α刺激H9c2的時間越久，miR-9在H9c2細胞中的表達水平越高，與TNF-α刺激0 h相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖2B。

圖2 TNF-α促進心肌細胞中miR-9的表達

2.3 敲低miR-9減少TNF-α誘導的心肌細胞損傷通過向H9c2細胞中轉入miR-9-inhibitor以敲低miR-9的表達，經檢測：與miR-NC組相比，miR-9-inhibitor組的H9c2細胞miR-9的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），圖3A。用10 μg/ml的TNF-α分別刺激miR-NC組及miR-9-inhibitor組H9c2細胞24 h，經檢測：與miR-NC組相比，TNF-α刺激后，miR-9-inhibitor組的H9c2細胞活性更高（P＜0.001），圖3B。

圖3 敲低miR-9較少TNF-α誘導的心肌細胞損傷

2.4 miR-9通過抑制SIRT1表達而促進心肌細胞中NF-κB通路激活通過TargetScanHuman（http://www.targetscan.org/vert_72/）數(shù)據庫查詢miR-9潛在的靶基因，miR-9與SIRT1具有相互結合的基因序列，圖4A。將pmirGLO-SIRT1 WT/MUT與miR-9-inhibitor共同轉入到H9c2細胞中，然后測定熒光素酶活性。結果顯示，在轉入pmirGLO-SIRT1 MUT的H9c2細胞中，轉入miR-9-inhibitor不影響熒光素酶活性；在轉入pmirGLO-SIRT1 WT的H9c2細胞中，轉入miR-9-inhibitor增強熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖4B。此外，使用10 μg/mL的TNF-α分別刺激miR-NC組及miR-9-inhibitor組H9c2細胞24 h，收集細胞檢測蛋白表達變化，結果顯示：miR-NC組相比，轉入miR-9-inhibitor以敲低miR-9的表達水平的H9c2細胞，在TNF-α刺激下SIRT1蛋白表達更高，而p-p65/p65蛋白表達比值更低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖4C、圖4D。

圖4 miR-9靶向抑制SIRT1表達而促進p65磷酸化

3 討論

TNF-α位于人染色體6q21.33位置上，與主要的相容性復合體基因緊密相連，這種緊密連接保證了TNF-α在免疫調節(jié)基因產物的聯(lián)合反應和調控中發(fā)揮重要作用[6]。在機體內，TNF-α是一種發(fā)揮多重生物學功能的炎癥細胞因子，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，被證實在參與調控急性心肌梗死、動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎及器官移植排斥反應的病理進程。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α以劑量和時間依賴形式促進心肌細胞損傷。之前研究已表明，TNF-α在心血管疾病中主要通過招募巨噬細胞等免疫細胞誘導血管內皮細胞和心肌細胞損傷，降低正常細胞增殖活性和誘導心肌細胞凋亡[7,8]。

microRNA是一類在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的、由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過其對靶基因轉錄的調控參與到真核細胞的分化、增殖、生長和凋亡的調解。在心血管疾病的中，miRNA不僅通過其對靶基因的調控而在心肌肥大、心肌壞死和凋亡中發(fā)揮著舉足輕重的作用，并且參與到急性心肌梗死發(fā)病的每個過程[9-11]。同時，由于miRNA在血液中異常的穩(wěn)定，且對各種病理生理條件下表達差異明顯，是一種理想的疾病血液檢測生物標志物。Liu等[12]研究指出，血漿miR-1，miR-208和miR-499是漢人群急性心肌梗死的潛在預測生物標志物。本次研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅以劑量和時間依賴性誘導心肌細胞損傷，且還以劑量和時間依賴性促進心肌細胞中miR-9表達。

為研究miR-9在TNF-α誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮的作用，向心肌細胞中轉入miR-9-Inhibitor以敲低心肌細胞中miR-9的表達。結果發(fā)現(xiàn)：敲低miR-9可顯著降低TNF-α誘導的心肌細胞損傷。MiR-9作為一種microRNA并不編碼蛋白而發(fā)揮生物學功能，而只能通過對其靶基因的調控而間接參與細胞生物學功能的調控。為了進一步研究miR-9對TNF-α誘導的心肌細胞損傷的調控作用，通過生物學信息手段查詢到SIRT1是miR-9的靶基因，且本文通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證發(fā)現(xiàn)，miR-9靶向抑制心肌細胞的SIRT1的表達。SIRT1是sirtuin蛋白家族的成員之一，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；福粌H可通過去乙?；M蛋白而維持染色質和基因組的穩(wěn)定，還可通過其去乙?；墙M蛋白的功能而參與細胞生物學功能的調控[13]。之前研究指出，上調SIRT1的表達不僅降低膿毒血癥小鼠體內的炎癥性損傷[14]，通過其去乙酰化功能而抑制p65蛋白進入細胞核，抑制NF-κB信號通路的激活，減輕炎癥[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低miR-9不僅顯著增加心肌細胞中SIRT1蛋白的表達，且顯著降低p65蛋白的磷酸化，提示miR-9可能通過靶向抑制SIRT1蛋白表達而促進NF-κB信號通路的激活，降低細胞活性。

綜上所述，miR-9可能通過靶向抑制SIRT1蛋白表達、促進NF-κB信號通路的激活從而在TNF-α誘導的心肌細胞損傷過程中發(fā)揮促進炎癥損傷的作用。而敲低miR-9可減輕TNF-α誘導的心肌細胞損傷，提高心肌細胞活性。