冠狀動脈缺血再灌注對循環(huán)微粒的影響

王旭蘭，張煒，李喆，王亞萍，吳皓宇，王群讓，邢坤，常鳳軍，王英

急性心肌梗死（AMI）是在冠狀動脈（冠脈）發(fā)生狹窄的基礎(chǔ)上因各種誘因（如勞累、情緒波動等）導(dǎo)致斑塊破裂而激活血小板，激活的血小板進(jìn)一步刺激更多的血栓形成和產(chǎn)生縮血管物質(zhì)，最終致使冠脈持續(xù)性缺血缺氧和心肌壞死。臨床多表現(xiàn)為劇烈而持續(xù)的胸痛，同時伴血清心肌酶活性增高及心電圖動態(tài)演變，有極高的致死率[1]。循環(huán)微粒（MPs）是機(jī)體在各種刺激誘導(dǎo)下由內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等血管源細(xì)胞釋放的微小顆粒，既往研究發(fā)現(xiàn)MPs與內(nèi)皮功能損壞密切關(guān)系[2,3]。AMI的有效處理方式是冠脈介入治療，但AMI患者行冠脈介入治療時缺血再灌注是其常見并發(fā)癥，缺血再灌注時各種炎癥因子釋放和血小板的激活是否會影響MPs的功能和數(shù)量目前尚未報道。本研究通過比較行冠脈介入治療的穩(wěn)定型心絞痛及AMI患者（發(fā)生缺血再灌注者）的MPs功能及數(shù)量的差異，探討MPs在心肌缺血再灌注中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象本實驗為前瞻性研究，實驗組為2017年2～7月就診于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科的AMI患者30例，年齡40～62（48.62±10.41）歲，排除2型糖尿病、高血壓、腎功能衰竭、嚴(yán)重感染性疾病等患者。對照組為同期就診的穩(wěn)定型心絞痛患者30例，年齡42～65（50.79±11.38）歲。所有參與者均簽署知情同意書，本研究通過我院倫理委員會批注。

1.2 MPs提取冠脈介入治療結(jié)束時抽兩組患者的冠脈血（實驗組抽取缺血再灌注時冠脈血液），依參考文獻(xiàn)提取MPs：血液標(biāo)本低溫送至醫(yī)院實驗中心，離心（4℃ 4000 rpm，10 min）后提取上層血漿再次離心（4℃ 11 000 g，2 min），離心后上層血漿為乏血小板血漿。取乏血小板血漿2 ml行最終離心（4℃ 13 000 g，45 min）。最后MPs將沉淀于離心管底部，用RPMI1640培養(yǎng)基（美國，GIBCO公司，100 μl）重新懸浮MPs。BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國，Thermo Scientific 公司）測定MPs濃度后將其存放于4℃冰箱（中國，海爾公司）備用。

1.3 MPs來源檢測按文獻(xiàn)[4]報道采用流式細(xì)胞儀檢測MPs來源：取乏血小板血漿50 μl與5 μl anti-CD31-PE抗體和5 μl anti-CD41-FITC抗體（美國，Beckman Coulter公司）在室溫下孵育30 min。孵育結(jié)束后取50 μl流量計數(shù)儀珠（美國，Beckman Coulter公司）加入到孵育好的抗體標(biāo)記MPs中，對樣品進(jìn)行分析。內(nèi)皮來源的MPs（EMP）被定義為CD31（+）/（-），血小板來源（PMP）的MPs被定義為CD41 CD31（+）/（+）。

1.4 一氧化氮（NO）檢測6只雄性SD大鼠（180±10 g，本研究通過陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核，動物使用批準(zhǔn)號：SYXK2016-006），經(jīng)斬頭處死后取胸主動脈放置于預(yù)冷并通氣的Kreb’s平衡液（NaCl 119.0 mmol/L，NaHCO325.0 mmol/L glucose 11.1 mmol/L，CaCl21.6 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L和MgSO41.2 mmol/L， PH 7.4）中，小心剔除動脈周圍脂肪組織后縱行剖開血管，將血管放入含有DMEM培養(yǎng)基（美國，GIBCO公司）的6孔板內(nèi)并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定1 h，加入等量的兩組MPs孵育血管30 min（空白對照組血管不做任何處理）。用NO檢測試劑盒（中國，南京建成生物科技公司）檢測各組培養(yǎng)基中NO含量，各組血管烘干稱重用于計算單位重量NO含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Graph pad prism5進(jìn)行作圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較兩組除在MPs含量上有差異外，在性別、年齡、血脂、體質(zhì)指數(shù)等方面比較，均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。

表1 兩組一般臨床資料

2.2 MPs來源檢測與對照組比較， 實驗組MPs中血小板來源（PMP，黃框，46.52%±8.37%）及內(nèi)皮細(xì)胞來源（EMP，綠框，32.81%±6.58%）MPs均增多，其中以PMP增多更為顯著（圖1）。

圖1 MPs來源檢測

2.3 MPs對NO含量的影響與空白組比較，對照組MPs抑制離體血管NO產(chǎn)生；而實驗組MPs較對照組進(jìn)一步抑制了離體血管NO的產(chǎn)生（圖2）。

圖2 MPs對NO含量的影響

3 討論

本文通過比較AMI患者M(jìn)Ps與穩(wěn)定型心絞痛患者M(jìn)Ps含量與功能發(fā)現(xiàn)，患者行冠脈介入治療發(fā)生缺血再灌注時MPs含量明顯升高，升高的MPs以PMP為主，且明顯抑制離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生。

AMI的發(fā)病率隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展呈上升趨勢，AMI逐漸成為危害我國人民生命健康的重要疾病。研究發(fā)現(xiàn)：血小板激活、炎癥因子活化、內(nèi)皮功能紊亂在AMI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。先前研究[6]發(fā)現(xiàn)：MPs不但能抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活化影響血管新生，還能加強(qiáng)高脂血癥對血管新生的抑制作用。李蕓等[2]研究發(fā)現(xiàn)：急性ST段抬高性心肌梗死患者體內(nèi)MPs水平較正常人升高，且其體內(nèi)的MPs通過抑制eNOS活化和上調(diào)內(nèi)皮素-1（ET-1）表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。Ahn研究[7]顯示：主動脈瓣狹窄致使體內(nèi)MPs含量升高，而體內(nèi)升高的MPs通過損害內(nèi)皮功能反過來加重主動脈瓣膜損傷而形成“惡性循環(huán)”。本研究著眼于MPs與AMI在內(nèi)皮、血小板上的共性，研究發(fā)現(xiàn)：AMI患者行冠脈介入治療發(fā)生缺血再灌注后致使冠脈內(nèi)MPs含量升高，升高的MPs多數(shù)來源于血小板激活。

NO含量下降和氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)是反應(yīng)內(nèi)皮功能受損的重要指標(biāo)。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)，冠心病患者M(jìn)Ps可抑制離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生和內(nèi)皮依賴的血管舒張功能。既往研究[3]還顯示：肺動脈高壓大鼠體內(nèi)MPs含量隨肺高壓病情進(jìn)展而升高，且升高的MPs通過抑制eNOS活化和促進(jìn)彈性蛋白表達(dá)參與了肺高壓的發(fā)生發(fā)展。缺血再灌注導(dǎo)致冠脈血中升高的MPs對離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生有更強(qiáng)的抑制力，闡明了冠脈缺血再灌注時的機(jī)理。

綜上所述，缺血再灌注時機(jī)體冠脈內(nèi)內(nèi)皮及血小板來源的MPs水平升高，升高的MPs抑制了血管產(chǎn)生和釋放NO的能力，MPs的這一作用可能會進(jìn)一步加重冠脈缺血再灌注，形成惡性循環(huán)。為尋求新的和更有效的預(yù)防和緩解缺血再灌注的方法影響提供了理論依據(jù)。