響應(yīng)面法優(yōu)化酥李果汁的酶法提取工藝

李德燕，賀紅早

（1.安順學(xué)院，貴州安順 561000；2.貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009）

酥李是薔薇科李屬多年生落葉果樹，成熟的酥李果實呈暗橙黃色，口味酸甜，因其富含維生素、蛋白質(zhì)和多種氨基酸等物質(zhì)，味美多汁，既可以鮮食又可作為加工保健食品的重要原材料[1]。然而，酥李為呼吸躍變型果實，果實在貯藏運輸過程中極易腐爛，貨架期短，嚴重阻礙了酥李產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[2]。因此，以酥李果汁為原料，開發(fā)酥李果酒和飲料等高附加值產(chǎn)品，已成為解決酥李貯運問題的有效途徑，對酥李產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[3]。

生物酶解法利用酶催化反應(yīng)促進了果肉組織浸解和液化，有利于汁液和養(yǎng)分物質(zhì)流出，從而有效提高果汁出汁率和穩(wěn)定性，具有專一性強、成本低、無有機殘留等優(yōu)點[4?7]。研究表明，酶法制汁已成功用于棗[8?10]、無花果[11?12]、香蕉[13?14]、花紅[15]、葡萄[16?19]、蘋果[20?22]、刺梨[23?25]、樹莓[26?27]、獼猴桃[28?29]和布朗李[30]等多種果汁生產(chǎn)過程中。然而，目前專門針對酶法提高酥李出汁率的相關(guān)研究尚未見報道，使得酥李飲料及果酒開發(fā)緩慢。

因此，本研究以酥李果漿出汁率為指標，通過研究果膠酶、纖維素酶以及復(fù)合酶（由果膠酶和纖維素酶組成）酶解提取酥李果汁的最佳工藝條件，旨在為貴州李資源深加利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酥李 貴州省貴定縣盤江鎮(zhèn)獅撲村；果膠酶（酶活100000 U/g），上海兔杰工貿(mào)有限公司；纖維素酶（100000 U/g） 食品級，和氏璧生物科技有限公司；D-異抗壞血酸、K2S2O5、檸檬酸等化學(xué)試劑 國產(chǎn)分析純。

CL-S 去核機 肇慶市鳳翔餐飲設(shè)備有限公司；JJ-2 組織搗碎勻漿機 無錫沃信儀器有限公司；精密pH 計 上海雷磁儀器廠；JY10002 電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DZKW 數(shù)字顯示電熱恒溫水浴鍋 上海振宇化工科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酥李果汁制備工藝 選取成熟的酥李鮮果，在分選、清洗、陰干后經(jīng)沸水熱燙3 min，冷卻后去核。分別稱取100 g 酥李果肉并按1:2 料水比（g/mL）加入勻漿機，同時加入0.04 g/100 mL D-異抗壞血酸護色，在3000 r/min 打漿30 s，并用K2S2O5調(diào)節(jié)果漿SO2濃度至100 mg/L，制得均勻的酥李果漿。根據(jù)實驗要求，采用1.0%檸檬酸調(diào)節(jié)酥李果漿pH，再添加酶進行酶解處理。將酶解后的酥李果漿置于85 ℃水浴鍋處理15 min，冷卻后在4500 r/min 離心10 min，測定酥李果汁出汁率。每組處理重復(fù)三次。

1.2.2 酶解單因素實驗 加酶量設(shè)計：取酥李果漿各100 mL 于三角瓶中，在38 ℃、pH3.8 條件下分別添加果膠酶或纖維素酶0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65 g/L，酶解時間為90 min，測定出汁率。

酶解溫度設(shè)計：取酥李果漿各100 mL 于三角瓶中，在0.35 g/L 果膠酶或0.45 g/L 纖維素酶、pH3.8條件下分別置于26、29、32、35、38、41、44 ℃的恒溫環(huán)境中，酶解時間為90 min，測定出汁率。

酶解pH 設(shè)計：取酥李果漿各100 mL 于三角瓶中，在0.35 g/L 果膠酶或0.45 g/L 纖維素酶、38 ℃條件下分別調(diào)節(jié)果汁pH 為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8，酶解時間為90 min，測定出汁率。

酶解時間設(shè)計：取酥李果漿各100 mL 于三角瓶中，在0.35 g/L 果膠酶或0.45 g/L 纖維素酶、pH3.8、38 ℃條件下分別酶解45、60、75、90、105、120、135 min，測定出汁率。

1.2.3 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以加酶量（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、酶解時間（D）為自變量，酥李果漿出汁率（Y）作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 試驗設(shè)計，響應(yīng)面試驗因素及水平詳見表1。

表1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化果膠酶、纖維素酶酶解工藝Table 1 Optimization of pectinase and cellulose extraction by response surface methodolog

1.2.4 復(fù)合酶響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以果膠酶酶添加量（A）、纖維素酶添加量（B）、酶解溫度（C）、酶解pH（D）和酶解時間（E）為自變量，酥李果漿出汁率（Y）作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 試驗設(shè)計。酥李復(fù)合酶酶解制汁工藝響應(yīng)面試驗因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)合酶酶解工藝Table 2 Optimization of complex enzyme extraction by response surface methodology

1.2.5 出汁率測定 以不加酶的酥李果漿出汁率為對照（CK），對最優(yōu)酶解工藝條件下的酥李果漿出汁率進行測定，分析最優(yōu)酶解工藝對其出汁率的影響[15]。

式中：W 為出汁率，%；m1為酶解處理后酥李果汁的質(zhì)量，g；m2為酶解前酥李果實質(zhì)量，g；m3為加水量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)平均值，采用Excel 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，SPSS20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用Design-Expert 10.0.7 研究三種酶添加方式對酥李果漿出汁率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 加酶量對出汁率的影響 果膠酶添加量和纖維素酶添加量對提高酥李出汁率均有顯著作用（見圖1）。隨著果膠酶添加量增加，酥李果漿出汁率先快速增加，當果膠酶添加量高于0.35 g/L（出汁率為77.35%）后，其出汁率增加較緩慢。纖維素酶添加量為0.05～0.15 g/L 時酥李果漿出汁率緩慢增加，0.15～0.25 g/L 出汁率快速增加，當纖維素酶添加量高于0.45 g/L（出汁率為74.28%）后，其出汁率增加緩慢。因此，綜合成本考慮，酥李果漿酶解制汁過程中選擇果膠酶和纖維素酶最佳用量分別為0.35 和0.45 g/L。

圖1 不同酶添加量對酥李出汁率的影響Fig.1 Effects of different enzyme concentrations on juice yield of crisp plum

2.1.2 酶解溫度對出汁率的影響 不同酶解溫度下果膠酶和纖維素酶對酥李出汁率有顯著的影響，隨著酶解溫度的升高均為先升高后降低的變化趨勢（見圖2）。當果膠酶和纖維素酶酶解溫度分別在35 和38 ℃時，酥李果漿出汁率均達最高值，分別為78.56%和74.42%。因此，酥李果漿酶解制汁過程中果膠酶和纖維素酶的最佳溫度分別為35 和38 ℃。

圖2 不同酶解溫度對酥李出汁率的影響Fig.2 Effects of different enzyme hydrolysis temperature on juice yield of crisp plum

2.1.3 酶解pH 對出汁率的影響 不同酶解pH 下果膠酶和纖維素酶對酥李出汁率有顯著的影響（P<0.05），并隨pH 增加先升高后降低（見圖3）。當果膠酶酶解pH 為3.9 時酥李出汁率達到最高值，為78.37%；當纖維素酶解pH 為4.2 時，酥李出汁率達到最高值，為74.17%。因此，酥李果漿酶解制汁過程中果膠酶和纖維素酶酶解的最佳pH 分別為3.9 和4.2。

圖3 不同單酶酶解pH 對酥李出汁率的影響Fig.3 Effects of different enzyme hydrolysis pH on juice yield of crisp plum

2.1.4 酶解時間對出汁率的影響 不同酶解時間下果膠酶和纖維素酶對酥李出汁率具有顯著的影響（見圖4）。隨著酶解時間延長，果膠酶和纖維素酶對酶解酥李出汁效果逐漸提高，分別在75 和90 min 時出汁率達到一定高度，繼續(xù)延長酶解時間對出汁率增加不明顯，此時酥李出汁率分別為78.11%和73.91%。因此，酥李果漿酶解制汁過程中選擇果膠酶和纖維素酶酶解制汁的最佳時間分別為75 和90 min。

圖4 不同酶解時間對酥李出汁率的影響Fig.4 Effect of different enzymolysistime on juice yield of crisp plum

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

2.2.1 果膠酶酶解工藝

2.2.1.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗，以出汁率為響應(yīng)指標，結(jié)果見表3。通過Design-Expert 10.0.7軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，獲得以酥李出汁率為響應(yīng)值的回歸方程：Y=71.75+1.52A+3.97B?0.3C?0.02D+0.5AB?0.038AC+0.04AD?BC?0.012BD+0.18CD?0.26A2+1.29B2?1.48C2?0.2D2。

表3 果膠酶制備酥李果汁工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Results of response surface method for pectinase extraction of crisp plum juice

該回歸模型極顯著（P<0.01），模型的決定系數(shù)R2=0.9510，調(diào)整系數(shù)RAdj2=0.9021，失擬項P=0.7999>0.05，說明該模型預(yù)測值與試驗值擬合度較高，可有效對果膠酶提取酥李果汁的出汁率進行理論預(yù)測，同時也能對果膠酶提取酥李果汁的工藝條件進行較好地分析（見表4）。在該模型中，一次項果膠加酶量A、酶解溫度B、二次項B2和二次項C2對結(jié)果的影響極顯著（P<0.01），其它項對結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。根據(jù)F值可知，對酥李出汁率影響程度依次為：

表4 出汁率回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of multiple regression model of juice yield

B（F=202.14）>A（F=29.73）>C（F=1.14）>D（F=5.141E?003），即果膠酶酶解溫度>添加量>酶解pH>酶解時間。

2.2.1.2 工藝優(yōu)化與驗證 采用Design-Expert10.0.7進行果膠酶對酥李果汁酶解工藝參數(shù)優(yōu)化組合，預(yù)測最佳工藝條件為：果膠酶添加量0.45 g/L、酶解溫度38 ℃、酶解pH3.76、酶解時間72.38 min，在此條件下酥李出汁率預(yù)測值79.06%?？紤]到實際情況，將最佳工藝條件參數(shù)調(diào)整為果膠酶添加量0.45 g/L、酶解溫度38 ℃、酶解pH3.8、酶解時間72 min。在此工藝條件下進行3 次平行試驗取平均值出汁率為78.63%，與預(yù)測值誤差率僅為0.54%，說明該回歸模型能較好地反映果膠酶制備酥李果汁的出汁率。同時，與未加酶處理（CK 出汁率為61.85%）相比，該工藝條件下出酥李出汁率提高了27.13%，說明在酥李制汁過程中適量添加果膠酶有利于提高果汁生產(chǎn)率。

2.2.2 纖維素酶酶解工藝

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗，以出汁率為響應(yīng)指標，試驗結(jié)果見表5。通過Design-Expert 10.0.7軟件對表4中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，獲得以酥李出汁率為響應(yīng)值的回歸方程：

表5 纖維素酶制備酥李果汁工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 5 Results of response surface method for cellulose extraction of crisp plum juice

Y=67.53+1.16A+3.42B?0.82C?0.19D+0.82AB 0.71AC+0.04AD?0.69BC+0.49BD+0.68CD?0.037A2+1.79B2?1.26C2?0.014D2

該回歸模型極顯著（P<0.01），模型的決定系數(shù)R2=0.9408，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.8815，失擬項P=0.7850>0.05，說明該模型預(yù)測值與試驗值擬合度較高，可有效預(yù)測纖維素酶酶解酥李果汁的出汁率，同時也能對纖維素酶酶解提取酥李果汁的工藝條件進行較好地分析（見表6）。在該模型中，一次項纖維素酶添加量A、酶解溫度B、酶解pH C 和二次項B2對結(jié)果的影響極顯著（P<0.01），二次項C2對結(jié)果的影響顯著（P>0.05）。由F值可知，影響酥李果漿出汁率的因素順序依次為：B（F=146.88）>A（F=16.95）>C（F=8.36）>D（F=0.44），即纖維素酶酶解溫度>酶添加量>酶解pH>酶解時間。

表6 出汁率回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of multiple regression model of juice yield

2.2.2.2 工藝優(yōu)化與驗證 采用Design-Expert 10.0.7對纖維素酶酶解提取酥李果汁的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，預(yù)測最佳工藝條件為：纖維素酶添加量0.55 g/L、酶解溫度41 ℃、酶解pH4.18、酶解時間105 min，在此條件下酥李果漿出汁率預(yù)測值為75.01%?？紤]到實際情況，將最佳工藝條件參數(shù)調(diào)整為纖維素酶添加量0.55 g/L、酶解溫度41 ℃、酶解pH4.2、酶解時間105 min。在該工藝條件下進行3 次平行試驗取平均值出汁率為74.33%，與預(yù)測值誤差率僅為0.91%，說明該回歸模型能較好地反映纖維素酶制備酥李果漿的出汁率。與對照（CK）相比，該工藝條件下出汁率提高了20.18%，表明適量添加纖維素酶對酥李果汁生產(chǎn)具有促進作用。

2.2.3 復(fù)合酶酶解工藝

2.2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗，以出汁率為響應(yīng)指標，試驗結(jié)果見表7。通過Design-Expert 10.0.7 軟件對表7中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，獲得以酥李出汁率為響應(yīng)值的回歸方程：Y=69.8+0.98A+2.41B+4.68C+0.4D+0.053E+0.16AB+0.4AC+0.65AD?0.072AE+0.85BC+0.4BD?0.28BE?0.1CD+0.39CE+0.23DE?0.26A2+0.11B2+1.11C2+0.53D2?0.16E2

表7 復(fù)合酶制備酥李果汁工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 7 Results of response surface method for complex enzyme extraction of crisp plum juice

該回歸模型極顯著（P<0.01），模型的決定系數(shù)R2=0.9635，調(diào)整系數(shù)RAdj2=0.9344，失擬項P=0.1818>0.05，說明該模型預(yù)測值與試驗值擬合度較高，可有效對該復(fù)合酶酶解酥李果汁出汁率進行理論預(yù)測，同時也能對該復(fù)合酶酶解提取酥李果汁的工藝條件進行較好地分析（見表8）。在該模型中，一次項果膠酶添加量A、纖維素酶添加量B、酶解溫度C 和二次項C2對結(jié)果的影響極顯著（P<0.01）。由F值可知，影響該復(fù)合酶酶解提取酥李果汁出汁率的因素依次為：C（F=477.34）>B（F=126.87）>A（F=20.90）>D（F=3.42）>E（F=0.060），即復(fù)合酶酶解溫度>纖維素酶添加量>果膠酶添加量>酶解pH>酶解時間。

表8 出汁率回歸模型的方差分析Table 8 Variance analysis of multiple regression model of juice yield

2.2.3.2 工藝優(yōu)化與驗證 通過響應(yīng)面分析法對復(fù)合酶酶解提取酥李果汁的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，預(yù)測最佳工藝條件為：果膠酶添加量0.45 g/L、纖維素酶添加量0.55 g/L、酶解溫度41 ℃、酶解pH4.0、酶解時間86.55 min，在此條件下出汁率預(yù)測值為82.26%。考慮到實際情況，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為果膠酶添加量0.45 g/L、纖維素酶添加量0.55 g/L、酶解溫度41 ℃、酶解pH4.0、酶解時間87 min。在該工藝條件下進行3 次平行試驗取平均值出汁率為81.51%，與預(yù)測值誤差率僅為0.91%，說明該回歸模型能較好地反映復(fù)合酶酶解提取酥李果漿的出汁率。與對照（CK）相比，該工藝條件下出汁率提高了31.79%，表明復(fù)合酶處理可有效提高酥李出汁率；同時，與添加單一酶（果膠酶或纖維素酶）制汁相比，采用復(fù)合酶酶解提取酥李果汁更有利于提高果汁的生產(chǎn)率。

3 結(jié)論

在酶法提取酥李果汁的過程中，果膠酶和纖維素酶的不同加酶方式對酥李出汁率的影響因素順序均為酶解溫度>加酶量>酶解pH>酶解時間。添加果膠酶的最佳工藝條件為加酶量0.45 g/L、酶解溫度38 ℃、酶解pH3.8、酶解時間72 min，實際出汁率為78.63%，提高了27.13%。添加纖維素酶的最佳工藝條件為加酶量0.55 g/L、酶解溫度41 ℃、酶解pH4.2、酶解時間105 min，實際出汁率為74.33%，提高了20.18%。添加復(fù)合酶的最佳制汁工藝條件為果膠酶添加量0.45 g/L、纖維素酶添加量0.55 g/L、酶解溫度41 ℃、酶解pH4.0、酶解時間87 min，實際出汁率為81.51%，提高了31.79%。在三種酶添加方式的最佳提取工藝條件下，酥李出汁率均與相應(yīng)預(yù)測值接近，得到的回歸模型均能較好地反映相應(yīng)酶提取酥李果汁的出汁率，表明所得工藝合理可靠。同時，出汁率增加表明不同酶添加方式對酥李果汁生產(chǎn)均有促進作用，其影響程度依次為復(fù)合酶（果膠酶和纖維素酶）>果膠酶>纖維素酶。本研究結(jié)果可為貴州李資源產(chǎn)品開發(fā)和利用提供一定的技術(shù)參考。

本研究中，僅針對酶法提取酥李果汁過程中果膠酶和纖維素酶的不同添加方式對果汁的提取效果展開了研究，而未對果汁中養(yǎng)分組成及其損失情況進行探討。因此，在相關(guān)的后續(xù)研究中還需對果汁的質(zhì)量狀況進行深入研究。