基質(zhì)匹配曲線校正-HPLC-MS/MS法同時(shí)測定干性食品包裝紙中8 種甜味劑

廖惠云，吳 洋，馬夢婕，毛淑蕊，朱懷遠(yuǎn)，陳晶波*，張 華，曹 毅，朱龍杰，袁益來

（江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇 南京 210019）

近年來，非營養(yǎng)性合成甜味劑的消費(fèi)增加已成為全球趨勢[1]。為改進(jìn)食品口味和食用性質(zhì)，食品包裝紙常會施加人類喜好的甜味劑[2-3]。我國食品添加劑相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)允許使用十余種合成甜味劑，并對其在不同基質(zhì)食品中的使用量進(jìn)行了限定[4]。合理使用人工合成食品甜味劑是安全的，不會對食用者的健康產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。但如果超限量、超范圍，或者使用劣質(zhì)的人工合成食品甜味劑，則會對消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生負(fù)面影響[5-7]。因此，建立一種具有高通量、高準(zhǔn)確度、高靈敏度的甜味劑檢測方法，加強(qiáng)監(jiān)測紙質(zhì)食品包裝材料中甜味劑的應(yīng)用情況就顯得尤為必要。

目前，對于甜味劑的測定主要集中于飲料、白酒、乳制品等食品基質(zhì)[8-9]。分析方法分別有液相色譜法[10-11]、離子色譜法[12-14]、毛細(xì)管電泳法[15-17]、氣相色譜法[18-21]等，主要以液相色譜法為主。由于不同甜味劑的物理化學(xué)性質(zhì)、電化學(xué)性質(zhì)和光譜性質(zhì)存在顯著差異，液相色譜法很難滿足多種甜味劑同時(shí)檢測要求，離子色譜法、毛細(xì)管電泳法等也由于靈敏度低等原因應(yīng)用不多。隨著各國對甜味劑使用要求越來越嚴(yán)格，使得開發(fā)更為簡單快速、靈敏度高的檢測方法成為必要。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有檢測通量大、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，被廣泛用于食品領(lǐng)域的檢測，運(yùn)用該技術(shù)同時(shí)分析多種甜味劑已經(jīng)成為一種趨勢[22-27]。然而，在分析基質(zhì)復(fù)雜樣品時(shí)，樣品本身所帶來的基質(zhì)效應(yīng)給質(zhì)譜分析帶來一定挑戰(zhàn)，必須采用適當(dāng)?shù)拇胧┙档突蛳龢悠坊|(zhì)效應(yīng)，以確保分析結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性。

考慮到現(xiàn)代食品工業(yè)對甜味劑的使用都以多種復(fù)配的形式添加。因此，在參考相關(guān)研究基礎(chǔ)上[28-29]，基于優(yōu)選樣品前處理方式和目標(biāo)物檢測效率考慮，創(chuàng)新采用基質(zhì)匹配溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）儀同時(shí)測定干性食品包裝紙中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、新橙皮苷二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑的含量。該方法基本上排除了基質(zhì)效應(yīng)的影響，具有簡單、快捷、準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。在確保檢測結(jié)果質(zhì)量的同時(shí)，也在很大程度上提高了檢測效率，適用于干性食品包裝紙中甜味劑的監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

包裝材料用原紙由高郵衛(wèi)星卷煙材料有限公司提供；市售不同品牌共10 個(gè)不同規(guī)格糖果、巧克力用干性食品包裝紙。

甲醇、乙腈（均為HPLC級） 美國Tedia公司；甲酸、三乙胺（均為色譜純）、乙酸銨（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；安賽蜜（CAS號為33665-90-6）、糖精鈉（CAS號為128-44-9）、甜蜜素（CAS號為139-05-9）、三氯蔗糖（CAS號為56038-13-2）、阿斯巴甜（CAS號為22839-47-0）、新橙皮苷二氫查爾酮（CAS號為20702-77-6）、紐甜（CAS號為165450-17-9）及甜菊糖苷（CAS號為57817-89-7）均為標(biāo)準(zhǔn)品，含量≥98.0%，分別購自美國Aladdin公司、美國Sigma-Aldrich公司和北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260/6460 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（配備電噴霧電離源） 美國Agilent公司；KQ-500DE超聲波發(fā)生器 昆山市超聲儀器有限公司；TDZ4A-WS離心機(jī) 湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；T201電子天平（感量0.000 1 g） 瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

1.3.1.1 基質(zhì)匹配溶劑

取包裝材料用原紙，準(zhǔn)確裁取面積為4 cm×4 cm試樣，將其剪碎成約1 mm×1 mm大小紙片，并全部轉(zhuǎn)移至50 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL甲酸-三乙胺緩沖溶液（pH 4.5），于60%功率條件下超聲萃取45 min，結(jié)束后搖勻，靜置片刻，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，得基質(zhì)匹配溶劑。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

分別準(zhǔn)確稱取40 mg安賽蜜、50 mg糖精鈉、30 mg甜蜜素、60 mg三氯蔗糖、40 mg阿斯巴甜、20 mg新橙皮苷二氫查爾酮、10 mg紐甜、30 mg甜菊糖苷（精確至0.1 mg），轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用基質(zhì)匹配溶劑稀釋并定容至刻度，混勻，制得8 種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液10、25、50、250、500 μL和1 000 μL，用基質(zhì)匹配溶劑稀釋定容至10 mL容量瓶中，配制得到6級標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

將0.8 mL甲酸加入1 L水中，然后在攪拌的狀態(tài)下用約2.5 mL三乙胺調(diào)pH值至4.5，配制成三乙胺緩沖溶液。然后，取干性食品包裝用紙，裁取面積為4 cm×4 cm試樣，并準(zhǔn)確稱其質(zhì)量（精確至0.1 mg），將其剪碎成約1 mm×1 mm大小紙片，并全部轉(zhuǎn)移至50 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL三乙胺緩沖溶液，浸潤1 h，然后于60%功率條件下超聲萃取45 min，結(jié)束后搖勻，試樣溶液4 000 r/min離心5 min，靜置片刻，取上層清液得樣品進(jìn)樣液，待上機(jī)分析。

1.3.3 儀器分析

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.4 mL/min：流動相：A相為甲醇，B相為5 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～8 min為30% A和70% B，8.1～30 min為60% A和40% B，30.1～35 min為80% A和20% B，35.1～40 min為30% A和70% B。離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：100 ℃；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：9 L/min；霧化氣壓力：275.79 kPa；毛細(xì)管電壓：正離子為4 000 V，負(fù)離子為3 500 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在電噴霧離子源正負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測，得出被測化合物一級質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示：阿斯巴甜[M+H]+和紐甜[M+H]+在正離子模式豐度較高，而安賽蜜[M－K]－、糖精鈉[M－Na－2H2O]－、甜蜜素[M－Na]－、三氯蔗糖[M－2H]－、新橙皮苷二氫查爾酮[M－H]－、甜菊糖苷[M－H]－在負(fù)離子模式豐度較高，選擇每個(gè)化合物豐度最高的特征離子為其對應(yīng)的母離子。在優(yōu)選的離子模式下對各化合物進(jìn)行選擇離子掃描，對裂解電壓進(jìn)行優(yōu)化。得到合適的裂解電壓后，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描確定其子離子，選取兩組特征離子作為定量和定性子離子，其中安賽蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、新橙皮苷二氫查爾酮和甜菊糖苷裂解時(shí)得到的碎片離子較少，依據(jù)豐度較強(qiáng)、信號穩(wěn)定的原則，分別選擇m/z162、177、94.3、610.7、802為其定性子離子。最后分別進(jìn)行碰撞能量優(yōu)化，得到安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、新橙皮苷二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑的較佳質(zhì)譜參數(shù)，如表1所示。

表1 8 種甜味劑的MRM參數(shù)Table 1 MRM MS parameters for eight sweeteners

2.2 色譜條件優(yōu)化

一般來說，反相色譜的流動相常由水和有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈）等組成，由于部分被測物質(zhì)極性較強(qiáng)，流動相的洗脫能力剛開始不宜過強(qiáng)，同時(shí)待分離的8 種甜味劑有些極性相近，保留時(shí)間相近，采用乙腈為有機(jī)相時(shí)易導(dǎo)致個(gè)別組分共流出情況較甲醇嚴(yán)重，而甲醇可使8 種甜味劑保留時(shí)間相對延遲，同時(shí)考慮到各目標(biāo)物的峰面積響應(yīng)相差不大，且乙腈的毒性較甲醇大，故選擇甲醇為實(shí)驗(yàn)的有機(jī)相。進(jìn)一步，由于流動相要進(jìn)入質(zhì)譜儀，添加一定量的緩沖溶液可以增加響應(yīng)值，所以考慮甲醇-水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-甲酸溶液3 種流動相體系。以目標(biāo)物在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標(biāo)，對3 種流動相體系進(jìn)行比較。結(jié)果表明，體系中添加乙酸銨，不僅更有利于目標(biāo)物在色譜柱上的保留，而且能夠提高部分物質(zhì)的電離化程度，增加信號響應(yīng)，從各目標(biāo)物分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性等指標(biāo)進(jìn)行綜合衡量，甲醇-乙酸銨溶液作為流動相時(shí)（圖1），各目標(biāo)物色譜峰出峰情況良好，色譜峰峰形、響應(yīng)強(qiáng)度以及分離效果總體上優(yōu)于其余兩種流動相。因此，本研究為了避免較高濃度的緩沖鹽體系對質(zhì)譜的影響，在滿足要求的情況下選用甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

圖1 MRM模式下種8 種甜味劑總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of eight sweeteners under MRM mode

2.3 樣品前處理優(yōu)化

綜合考慮8 種甜味劑的理化性質(zhì)，可知阿斯巴甜、紐甜等二肽類化合物一般在pH 3～5環(huán)境下較為穩(wěn)定[9]，因此以食品包裝紙樣品對象，添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察純水和三乙胺緩沖溶液作為溶劑對目標(biāo)物萃取效率的影響，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，樣品溶液中大部分甜味物質(zhì)檢測結(jié)果較為一致，唯有阿斯巴甜的檢測結(jié)果分別為1.55 μg/mL和1.87 μg/mL，兩者相差較大。這可能與目標(biāo)物所處的環(huán)境有關(guān)，即阿斯巴甜主要是由天冬氨酸和苯丙氨酸合成的二肽類物質(zhì)，對酸堿穩(wěn)定性相比于紐甜稍差，且溫度高于80 ℃時(shí)不穩(wěn)定，然而樣品前處理采用超聲萃取，隨著萃取時(shí)間延長，水浴溫度逐漸升高，進(jìn)而對目標(biāo)物的量化結(jié)果產(chǎn)生一定影響。為此，選用三乙胺緩沖溶液為樣品萃取溶劑。

表2 不同溶劑對8 種甜味劑的檢測效果（n=3）Table 2Effect of solvents on the results of determination of eight sweeteners (n= 3)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評估

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于HPLC-MS/MS檢測中，表現(xiàn)為離子增強(qiáng)或離子抑制，從而導(dǎo)致定量結(jié)果有一定的偏差。為了考察本方法在去除基質(zhì)效應(yīng)方面的效果，按照Matuszewski等[30]報(bào)道的方法對其進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評估。按照1.3.1節(jié)所述，以不含目標(biāo)物的包裝材料用原紙為樣品對象進(jìn)行處理，制得基質(zhì)匹配溶劑，再配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。此外，用超純水配制同樣質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。最后用HPLC-MS/MS分別分析以上2 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照公式“基質(zhì)效應(yīng)/%=（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積）×100”計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，其中，基質(zhì)效應(yīng)大于100%時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于100%時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。不同質(zhì)量濃度條件下8 種甜味劑在食品紙張樣品中的基質(zhì)效應(yīng)見圖2?？梢钥闯?，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、紐甜5 種甜味劑的基質(zhì)效應(yīng)均在95%～105%之間，說明基質(zhì)效應(yīng)較弱；阿斯巴甜平均基質(zhì)效應(yīng)為92.34%，其中較低值為87.36%，說明存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)，而新橙皮苷二氫查爾酮和甜菊糖苷平均基質(zhì)效應(yīng)分別為107.03%和105.38%，其中較高值分別為116.39%和108.75%，說明存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液消除和（或）補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)給定量帶來的偏差。

圖2 8 種甜味劑在紙張樣品中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of eight sweeteners in paper samples

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限

采用優(yōu)化好的HPLC-MS/MS條件對系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并進(jìn)行線性擬合，計(jì)算線性回歸方程。采用不含目標(biāo)物樣品為對象添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)樣分析，經(jīng)逐步稀釋后以各種甜味劑信噪比（RSN）為3時(shí)的進(jìn)樣濃度確定為每種甜味劑的檢出限，以各種甜味劑RSN為10時(shí)的進(jìn)樣濃度確定為定量限。如表3所示，8 種甜味劑在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995，8 種甜味劑的檢出限和定量限分別在0.13～2.50 mg/kg和0.43～8.33 mg/kg之間，可以滿足各物質(zhì)的定量分析要求。

表3 8 種甜味劑的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3Calibration curve equations, linear ranges, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification for eight sweeteners

2.5.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

以巧克力包裝紙樣品對象，通過加標(biāo)樣品的回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度，并以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）考察精密度。參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法確認(rèn)的回收率和精密度測試要求[31]，在低、中、高3 個(gè)加標(biāo)水平（LOQ、2 倍LOQ、10 倍LOQ）下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平重復(fù)測定6 次，計(jì)算樣品中各種甜味劑的回收率和RSD，結(jié)果見表4。8 種甜味劑加標(biāo)回收率在85.49%～108.81%之間，RSD在2.24%～6.03%之間，表明方法具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，能夠滿足微量目標(biāo)物的定量分析。

表4 不同加標(biāo)樣品的回收率和RSD（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of eight sweeteners at different spiked concentrations (n= 6)

2.6 實(shí)際樣品的測定結(jié)果

采用本方法，對市售不同品牌共10 個(gè)不同規(guī)格糖果、巧克力用干性食品包裝紙進(jìn)行檢測分析，結(jié)果（圖3）顯示有1 個(gè)樣品中檢測出含有1#安賽蜜和7#紐甜，含量分別為0.56 g/kg和0.015 g/kg。對比GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中有關(guān)甜味劑的使用要求，安賽蜜在不同基質(zhì)食品中的最大使用量介于0.3～4.0 g/kg之間（其中糖果類為2.0 g/kg），紐甜在不同基質(zhì)食品中的最大使用量介于0.01～1.0 g/kg之間（其中干性食品中都在0.02 g/kg以上），可知抽檢樣品結(jié)果滿足標(biāo)準(zhǔn)限量使用要求。

圖3 典型食品包裝紙?zhí)鹞秳z測總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram of typical sweeteners in food wrappings

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以原紙為對象配制基質(zhì)匹配溶劑，采用三乙胺緩沖溶液為萃取溶劑對樣品進(jìn)行超聲提取，優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件及色譜條件參數(shù)，對比考察基質(zhì)效應(yīng)，建立基質(zhì)匹配曲線校正-HPLC-MS/MS法同時(shí)測定干性食品包裝紙中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、新橙皮苷二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑含量的方法。實(shí)際樣品測定結(jié)果表明，本方法簡便快捷、靈敏度高，可滿足現(xiàn)行法規(guī)的限量要求，適用于干性食品包裝紙中8 種甜味劑的檢測需求。