基于Captiva EMR-Lipid凈化的嬰兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定

張 昊，蔣曉宏，霍宗利,*

（1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009；2.拉薩市疾病預(yù)防控制中心，西藏 拉薩 850000）

氯酸鹽和高氯酸鹽是水體中常見的2 種氯化消毒副產(chǎn)物。高氯酸鹽的離子半徑和碘離子的離子半徑接近，同時兩者電荷價態(tài)相同，因此兩者在甲狀腺吸收中存在競爭關(guān)系，體內(nèi)高濃度的高氯酸鹽會抑制碘離子的吸收進而抑制甲狀腺素的分泌，從而影響人體的正常代謝，影響身體機能[1-3]。氯酸鹽在人體內(nèi)可以誘發(fā)呼吸困難、高鐵血紅蛋白癥等[4]。這兩種氯氧化物具有極好的水溶性，可以通過環(huán)境水體遷移至土壤中，并被植物根部吸收在果實、莖、葉等部位富集[5-6]，動物通過飲水和食用植物將氯氧化合物攝入體內(nèi)在生物體內(nèi)進一步富集。目前在糧食、果蔬、飲料、肉制品、乳制品等各類食品中均存在氯酸鹽和高氯酸鹽的檢出[5-13]。通過日常的飲食生活暴露接觸氯酸鹽和高氯酸鹽，人尿液、血液中存在一定程度的高氯酸鹽的檢出[14-15]。嬰幼兒由于自身生長發(fā)育需要攝入碘，但存在通過配方奶粉等嬰幼兒食品暴露接觸高氯酸鹽的可能性[10-11]，有研究指出長期攝入高氯酸鹽會對嬰幼兒的認知能力甚至是未來的生育能力造成不利影響[16-17]。因此對于配方奶粉中的高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測一直是食品檢驗工作者的一個關(guān)注點。

目前乳制品中氯酸鹽或高氯酸鹽的檢測方法主要集中在離子色譜[18]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ion chromatographytandem mass spectrometry，IC-MS/MS）[9,11,19-22]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[6,23-29]。離子色譜法中使用電導(dǎo)檢測器為通用性檢測器，目標化物的定性只能通過目標化合物在標準品中的保留時間與在樣品中的保留時間進行比對確定，但在復(fù)雜樣品基質(zhì)中目標物容易受到樣品中其他陰離子的干擾。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法一般采用HILIC柱等親水色譜柱進行分離[23-24]，或測定時在流動相中添加甲酸或乙酸等調(diào)節(jié)流動相的酸度增加氯氧化物在色譜柱的保留[25-29]，但是流動相中添加的酸在一定程度上會抑制在負離子模式下的氯氧化物的電離能力，降低信號響應(yīng)。IC-MS/MS法分為抑制型[9,19-21]和非抑制型[11,22]兩種。抑制型IC-MS/MS法在測定時需要在色譜分離后將淋洗液中氫氧根通過抑制器轉(zhuǎn)變?yōu)榧兯?，并在離子色譜與質(zhì)譜之間添加專用的插件裝置才能進行測定。同時需要在離子色譜與質(zhì)譜連接處加入管路引入如乙腈作為有機溶劑降低流動相的黏度，提高目標物質(zhì)的離子化效率。非抑制型IC-MS/MS法主要使用有機胺溶液或在離子源中易分解的無機銨鹽溶液作為洗脫液，使用離子色譜柱作為分析柱，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上完成相應(yīng)的檢測工作，目前尚無非抑制型IC-MS/MS法對于嬰兒配方奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽同時測定的相關(guān)報道。

嬰兒配方奶粉與普通動物源性產(chǎn)品在樣品基質(zhì)上的區(qū)別在于除主要的蛋白質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)成分外，還會在原有基礎(chǔ)上添加一定量的低聚糖、不飽和脂肪酸（亞麻酸、二十二碳六烯酸）等營養(yǎng)成分。這些營養(yǎng)成分中維生素、脂肪和不飽和脂肪酸等脂質(zhì)會對檢測產(chǎn)生干擾，目前對于嬰兒配方奶粉中脂質(zhì)的凈化主要采取液液萃取[19,21,24,28]和固相萃取小柱凈化[18,20,22,25-27,29]兩種凈化方式。其中液液萃取需要使用具有高揮發(fā)性、低毒的正己烷，操作更為繁瑣、耗時。本實驗針對去除脂質(zhì)操作采用了增強基質(zhì)脂質(zhì)去除固相萃取小柱產(chǎn)品（Captiva EMR-Lipid固相萃取柱式凈化產(chǎn)品）。這類產(chǎn)品與傳統(tǒng)凈化方式相比，通過空間位阻和親水性的協(xié)同作用，對于C5及以上碳鏈化合物具有極強的選擇性吸附，可以在去除干擾脂質(zhì)的同時不吸附目標物，同時該產(chǎn)品無需活化和洗脫，操作簡便。目前，EMR-Lipid脂質(zhì)去除技術(shù)已廣泛用于動物源性食品中獸藥殘留[30-31]和環(huán)境污染物[32-34]的檢測，但是尚無采用EMR-Lipid技術(shù)對動物源性食品樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽等無機鹽進行凈化處理的報道。本實驗旨在建立了一種基于IC-MS/MS，使用Captiva EMRLipid選擇性脂質(zhì)凈化技術(shù)，測定嬰兒配方奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的方法。本方法凈化操作簡單快速、穩(wěn)定性好，滿足日常樣品的測定需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰兒配方奶粉（6～12 月齡，2 段），購于南京某超市。

氯酸鹽標準溶液（1 000 mg/L，以氯酸根計）北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)公司；高氯酸鹽標準溶液（1 000 mg/L，以高氯酸根計） 美國o2si公司；氯酸鹽-18O3同位素標準溶液（100 mg/L，以氯酸根-18O3計）、高氯酸鹽-18O4同位素標準溶液（100 mg/L，以高氯酸根-18O4計） 美國劍橋（CIL）公司；40%甲胺溶液（分析純） 美國Sigma Aldrich公司；乙腈（色譜純）德國Meker公司；實驗用水為實驗室自制超純水（電阻率≥18 MΩ·cm）。

0.7 mol/L甲胺溶液：30.6 mL 40%甲胺溶液使用純水定容至500 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀 美國Waters公司；QTRAP 5500質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及MultiQuant2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB SCIEX公司；K2-1臺式離心機美國Sigma公司；Vortex-Genie 2渦旋混合器 美國Scientific Industries公司；0.22 μm有機相針頭式濾器 上海安譜公司；ENVI-18固相萃取小柱（3 mL/500 mg）、ENVI-Carb固相萃取小柱（3 mL/200 mg）、ENVI-Carb/NH2雙層固相萃取小柱（6 mL/500 mg GCB+500 mg NH2） 美國Supelco公司；Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱（3 mL/300 mg） 美國Agilent公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPac AS16柱（250 mm×2.1 mm，9 μm）；柱溫：25 ℃；樣品室溫度：5 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；流動相A：0.7 mol/L甲胺溶液，B：乙腈。梯度洗脫程序：0～4 min，30% A、70% B；4～5 min，30%～1% A、70%～99% B；5～6 min，1% A、99% B；6～7 min，1%～30% A、99%～70% B；7～10 min，30% A、70% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI－；噴霧電壓：4.5 kV；多反應(yīng)監(jiān)測模式進行采集，離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓：40 psi；Gas 1：60 psi；Gas 2：60 psi。氯酸鹽和高氯酸鹽及其同位素內(nèi)標的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氯酸鹽和高氯酸鹽及其同位素內(nèi)標質(zhì)譜參數(shù)Table 1Mass spectrometric parameters for chlorate, perchlorate and their isotope-labelled internal standards

1.3.3 樣品前處理

稱取1 g（精確到0.01 g）嬰兒配方奶粉于50 mL離心管，加入160 μL同位素內(nèi)標使用液，加入7 mL純水渦旋3 min混勻，超聲提取10 min，加入9 mL乙腈混勻，靜置5 min沉淀蛋白，8 000 r/min離心5 min，移取3 mL上層清液分批轉(zhuǎn)移至Captiva EMR-Lipid小柱中，棄去前1 mL流出液，收集隨后流出液，濾液使用0.22 μm有機針式濾器過濾后上機測定。

1.3.4 標準溶液及內(nèi)標溶液的配制

混合標準使用液：移取適量氯酸鹽標準溶液和高氯酸鹽標準溶液，使用純水配制成氯酸鹽質(zhì)量濃度為4 μg/mL和高氯酸鹽質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標準使用溶液。

同位素內(nèi)標使用液配制：移取適量氯酸鹽-18O3同位素標準溶液和高氯酸鹽-18O4同位素標準溶液，使用純水配制成氯酸鹽-18O3和高氯酸鹽-18O4質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標準使用溶液。

標準曲線溶液配制：使用空白提取液水-乙腈（7∶9，V/V）稀釋混合標準使用液和同位素內(nèi)標使用液配制成標準溶液序列：5、10、50、100、200 μg/L（以氯酸根計），同位素內(nèi)標質(zhì)量濃度為10 μg/L。

1.3.5 氯酸鹽和高氯酸鹽含量計算

通過標準溶液序列上機測定繪制標準曲線，將1.3.3節(jié)獲得樣品溶液上機測定，以標準混合溶液中氯酸鹽和高氯酸鹽色譜峰的保留時間定性，通過標準曲線計算得出樣品溶液中氯酸鹽和高氯酸鹽的質(zhì)量濃度，使用同位素內(nèi)標校正定量。樣品中氯酸鹽/高氯酸鹽含量（均以其酸根計算）按式（1）計算：

式中：C為樣品中氯酸鹽/高氯酸鹽含量/（μg/kg）；c為標準曲線中計算上樣溶液中氯酸鹽/高氯酸鹽的質(zhì)量濃度/（μg/L）；c0為標準曲線中計算出空白實驗中氯酸鹽/高氯酸鹽的質(zhì)量濃度/（μg/L）；16為定容體積（mL）；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 空白實驗

除不稱取樣品外其他操作均按照樣品前處理中步驟進行實驗后測定，結(jié)果作為空白實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

參考美國EPA Method 331.0中水中痕量高氯酸鹽的測定方法[35]，本實驗使用離子色譜柱作為分析柱。同時考慮到奶粉樣品中有機物的組成和含量都遠高于自來水，存在有機物殘留于色譜柱上、污染色譜柱的風險，于是選用甲胺溶液與有機溶液的兩相洗脫，同時使用梯度洗脫，使用高比例的有機相在目標物分離后將可能殘留的有機物洗脫下來，延長色譜柱的使用壽命。使用離子色譜柱能夠耐受的甲醇和乙腈作為有機相，從色譜柱壓力、目標物色譜峰峰形等方面考察兩種有機相的優(yōu)劣。結(jié)果顯示，0.3 mL/min流速時，甲醇和乙腈分別作為有機相溶劑時，兩個目標物的峰形良好。但使用甲醇時色譜柱分離是系統(tǒng)背景壓力較高（約1 700 psi），使用乙腈時系統(tǒng)背景壓力為較低（約1 400 psi），離子色譜柱的推薦操作背景壓力低于1 500 psi，因此選擇系統(tǒng)背景壓力較低的乙腈作為有機相溶劑。

隨后比較氯酸鹽和高氯酸鹽在3 種離子色譜柱AS11（250 mm×2.1 mm，13 μm）、AS16（250 mm×2.1 mm，9 μm）、AS19（250 mm×2.1 mm，7.5 μm）上的色譜行為，流動相0.7 mol/L甲胺-乙腈（3∶7，V/V），流速0.3 mL/min，3 種色譜柱的填料粒徑不同（AS11為13 μm，AS16為9 μm，AS19為7.5 μm），色譜填料的比表面積隨著粒徑的減小而增大，填料的吸附能力逐漸增大，在洗脫液洗脫能力相同的情況下導(dǎo)致目標物在這3 種色譜柱上的保留時間逐漸變長，色譜峰變寬。綜合考慮后使用AS16作為本實驗的分析柱。氯酸鹽和高氯酸鹽及其對應(yīng)同位素內(nèi)標在標準溶液中的提取離子流圖見圖1。

圖1 氯酸鹽和高氯酸鹽及其同位素內(nèi)標在標準溶液中的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of chlorate, perchlorate and their isotopic internal standards in standard solution

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 溶解樣品純水用量的選擇

目前市售的嬰兒配方奶粉由于品牌、原料奶奶源、段位的不同，配方中碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素均存在差異，因此不同品牌、不同段位的配方奶粉在沖調(diào)時推薦的用水量也不同，統(tǒng)計后得出目前常見的品牌嬰兒配方奶粉推薦1 g奶粉沖調(diào)時水的用量為5～7 mL?？紤]到適用性，選擇最高用水量7 mL作為溶解奶粉樣品的純水用量。

2.2.2 沉淀劑的選擇

嬰兒配方奶粉中主要的營養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)、糖、脂肪等，其中蛋白質(zhì)需要沉淀后才能進行進一步的凈化操作。因此考察溶解在7 mL水中的1 g樣品使用不同蛋白質(zhì)沉淀溶劑（乙腈、甲醇、丙酮）達到完全蛋白質(zhì)沉淀的最少用量，以及不同沉淀劑對模擬加標樣品（加標量：氯酸鹽400 μg/kg、高氯酸鹽100 μg/kg）的提取率的影響。表2顯示，3 種沉淀劑在提取率均高于80%，但是乙腈的使用量較少，說明樣品被溶劑稀釋的倍數(shù)較少，方法會具有較低的檢出限和定量限，因此選擇乙腈作為沉淀劑進行進一步優(yōu)化。

表2 不同沉淀劑對提取率的影響以及沉淀劑最小用量Table 2Effect of different precipitants on extraction efficiency and minimum amount of precipitants added

2.2.3 水和沉淀劑使用量的優(yōu)化

比較沉淀蛋白時乙腈加入量對模擬加標樣品（加標量：氯酸鹽400 μg/kg、高氯酸鹽100 μg/kg）提取率的影響，結(jié)果顯示沉淀劑用量為9 mL時兩個化合物的提取率最高，因此選擇9 mL作為沉淀劑的使用量，具體結(jié)果見表3。

表3 沉淀劑用量對于提取率的影響Table 3Effect of precipitant dosage on extraction efficiency

2.2.4 固相萃取小柱的選擇

考慮到沉淀蛋白后的提取液中有機物例如糖和維生素在不同類型的固相萃取小柱中的柱填料的保留存在不同，使用SPE小柱凈化后的殘留基質(zhì)對兩種氯氧化物產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)，以及不同類型柱填料對目標化物的保留程度不同，均會對方法回收率等產(chǎn)生影響。因此考察常見5 種固相萃取柱（PRiME HLB小柱、ENVI-18小柱、GCB小柱、GCB/NH2復(fù)合小柱、Capativa EMR-Lipid小柱）對模擬加標樣（加標量：氯酸鹽400 μg/kg、高氯酸鹽100 μg/kg）提取率以及提取基質(zhì)溶液對目標化合物產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。由于無法獲得陰性的配方奶粉樣品，因此需要計算基質(zhì)效應(yīng)，當基質(zhì)效應(yīng)值低于80%或高于120%時，表示基質(zhì)產(chǎn)生嚴重不可忽視的基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強?；|(zhì)效應(yīng)按下式計算：

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；Ai為樣品基質(zhì)中添加一定量的標準溶液后目標化合物的色譜峰信號峰面積；Ab為樣品基質(zhì)中未添加標準溶液前的目標化合物的色譜峰信號峰面積；As為在空白提取液（水-乙腈（7∶9，V/V））添加一定量的標準溶液后目標化合物的色譜峰信號峰面積。

表4顯示，除使用EMR-Lipid小柱凈化外的基質(zhì)溶液對高氯酸鹽均產(chǎn)生了不可無視的基質(zhì)效應(yīng)，同時使用GCB小柱凈化時高氯酸鹽的提取率大于120%，值得注意的是，使用GCB/NH2復(fù)合小柱和EMR-Lipid小柱凈化時樣品基質(zhì)對于氯酸鹽產(chǎn)生了一定基質(zhì)抑制。推測出現(xiàn)該情況的原因，EMR-Lipid填料的空間結(jié)構(gòu)對脂質(zhì)存在選擇性去除，能夠有效去除樣品基質(zhì)中的不飽和脂肪酸等脂質(zhì)，從而有效降低了這類脂質(zhì)對高氯酸鹽的基質(zhì)抑制，而PRiME HLB小柱和ENVI-18小柱的柱填料也具有一定的去除脂質(zhì)效果，但去除效果有限，因此只是降低了部分基質(zhì)抑制，而GCB小柱和GCB/NH2小柱的柱填料對脂質(zhì)去除的效果較差因此產(chǎn)生了嚴重的基質(zhì)抑制；而樣品基質(zhì)中除脂質(zhì)外還有其他有機物，例如低聚糖等，這類化合物無法被EMR-Lipid吸附去除，因此產(chǎn)生了一部分的基質(zhì)抑制。因此選擇了其余4 種小柱中基質(zhì)效應(yīng)和提取率均相對較好（回收率＞80%，基質(zhì)效應(yīng)＞70%）的ENVI-18小柱與EMR-Lipid小柱協(xié)同凈化，但是該協(xié)同凈化手段對氯酸鹽回收率和基質(zhì)抑制改善效果不明顯，考慮到使用兩種小柱凈化會增加凈化操作的復(fù)雜性和實驗成本，因此單獨使用EMR-Lipid小柱作為本實驗的樣品凈化手段。

表4 不同固相萃取小柱對模擬加標樣品的加標回收率和基質(zhì)效應(yīng)Table 4Recoveries and matrix effect of spiked samples by using different SPE columns

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性方程和檢出限

按照優(yōu)化好的條件將標準溶液曲線上機測定，以被測組分離子峰面積與同位素內(nèi)標離子峰面積之比為縱坐標，標準曲線中被測組分質(zhì)量濃度為橫坐標，作標準曲線。所得標準曲線的線性方程回歸系數(shù)均大于0.999。同時根據(jù)氯酸鹽和高氯酸鹽的信噪比為3確定儀器檢出限為0.3 μg/L和0.1 μg/L，計算得出方法檢出限分別為4.8 μg/kg和1.6 μg/kg，定量限（RSN=10）分別為16 μg/kg和5.0 μg/kg，結(jié)果見表5。

表5 線性方程、線性范圍、儀器檢出限Table 5Linear equations, linear ranges, and instrumental detection limits for analytes

2.3.2 回收率和相對標準偏差

分別對奶粉進行3 個加標水平的加標實驗，表6顯示，氯酸鹽和高氯酸鹽在陽性樣品中3 個不同加標水平下的加標回收率分別為98.8%～101%和97.2%～112%，相對標準偏差分別為1.1%～2.6%和1.3%～6.8%，說明方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

表6 模擬加標樣品的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 6Recoveries and RSD of simulated spiked samples (n= 6)

2.4 實際樣品測定結(jié)果

使用本方法對12 份購買于網(wǎng)店或超市的奶粉進行檢測，結(jié)果顯示12 份樣品均為氯酸鹽和高氯酸鹽陽性樣本，樣品中氯酸鹽含量為17.4～203.9 μg/kg，高氯酸鹽含量為5.1～14.8 μg/kg。

3 結(jié) 論

本實驗使用Captiva EMR-Lipid小柱與C18小柱協(xié)同凈化，IC-MS/MS分離檢測，建立了嬰兒配方奶粉中的氯酸鹽和高氯酸鹽的同時測定的方法。與傳統(tǒng)液液萃取除脂相比，Captiva EMR-Lipid小柱凈化操作簡單、無需活化，脂質(zhì)去除選擇性高，能夠有效降低奶粉樣品基質(zhì)對于高氯酸鹽的機制抑制。方法便捷、準確、可靠，適于嬰兒配方奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測。