• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)羊肉制品中的鼠源性成分

    2021-07-08 03:52:18陳珍金蔡凱賢顏棟林謝耐珍陳小聰
    食品科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:源性靈敏度特異性

    陳珍金,張 璜,石 磊,葉 蕾,蔡凱賢,顏棟林,韋 濤,謝耐珍,陳小聰,*

    (1.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院,廣東 廣州 510632;2.廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司,廣東 廣州 510000;3.廣西東盟食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,廣西 南寧 530000)

    肉類摻假的歷史非常悠久,自古代起就有“掛羊頭賣狗肉”的說法[1]。時(shí)至今日,從歐洲馬肉事件到近期報(bào)道的鼠肉冒充羊肉串等羊肉制品以及假冒偽劣的牛肉等事件,“肉類摻假”不停地沖擊著食品安全體系,給社會(huì)帶來了巨大的負(fù)面影響[2-3]。其中最值得關(guān)注的是羊肉制品的鼠肉摻假事件,雖然我國(guó)的食品監(jiān)察管理部門針對(duì)鼠肉摻假等一系列問題進(jìn)行嚴(yán)格的篩查,但是我國(guó)在鑒別肉類摻假方面尚未有完善的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)察體系[1,4-5],尤其像鼠肉這種特殊的肉源性成分,且由于肉類產(chǎn)品具有產(chǎn)品流通量大和常溫下貯藏保質(zhì)期短等特點(diǎn)[6],在實(shí)驗(yàn)室條件下常用的定量和定性檢測(cè)方法很難滿足實(shí)時(shí)、快捷、大批量的產(chǎn)品檢測(cè)需求,因此亟需開發(fā)出快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確、便捷的肉源性成分快速檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品。

    目前,對(duì)肉類制品中的種屬鑒定主要包括高效液相色譜、等電聚焦電泳和酶聯(lián)免疫測(cè)定等客觀儀器分析技術(shù)檢測(cè)方法[7-12],但都因?yàn)槠錂z測(cè)方法靈敏度低、操作周期長(zhǎng)、操作要求高等劣勢(shì)而未被基層廣泛推廣使用。以DNA為目標(biāo)的動(dòng)物種屬鑒定是當(dāng)前普遍使用的肉類摻假分子生物學(xué)檢測(cè)方法,實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測(cè)方法憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),且由于其具有高時(shí)效性和高準(zhǔn)確性,已經(jīng)逐漸取代了常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù),成為肉類種屬鑒定的主要檢測(cè)方法[13-17]。但是real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR需使用昂貴的儀器設(shè)備作為實(shí)驗(yàn)支撐,檢測(cè)成本相對(duì)較高,且反應(yīng)過程需要升降溫,導(dǎo)致該檢測(cè)技術(shù)不能很好應(yīng)用于廣大基層單位[18-19]。因此,亟待研究開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、性價(jià)比高、恒溫且易于廣大基層單位操作的分子檢測(cè)方法,為廣大基層單位肉制品摻假診斷提供新的選擇。

    環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)作為近幾年來的新型核酸擴(kuò)增技術(shù),克服了傳統(tǒng)PCR、real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測(cè)方法反復(fù)升降溫且檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)的缺點(diǎn),利用BstDNA聚合酶和根據(jù)特定靶序列設(shè)計(jì)的3 對(duì)特殊的內(nèi)、外、環(huán)引物,特異性識(shí)別靶序列上的6 個(gè)獨(dú)立區(qū)域,啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng),可實(shí)現(xiàn)恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增。因其具有恒溫、特異性強(qiáng)、靈敏度高、性價(jià)比高和操作簡(jiǎn)易等特點(diǎn)[20-22],本研究將基于LAMP檢測(cè)技術(shù)首次開發(fā)出大鼠、小鼠鼠源性檢測(cè)試劑盒,實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確、易于操作的檢測(cè)目的,從而向廣大基層單位推廣使用,實(shí)現(xiàn)對(duì)摻假羊肉制品中大鼠、小鼠鼠源性成分的檢測(cè),以期為肉制品質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羊、豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的動(dòng)物組織均購(gòu)自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市。大鼠、小鼠組織由暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院提供。將羊和2 種生鮮鼠肉分別按不同質(zhì)量比例進(jìn)行混合制備模擬樣品,用于確定混合肉制品當(dāng)中鼠源性成分的檢出限。

    BstDNA聚合酶 美國(guó)NEB公司;Tris、NaCl、Na2EDTA、甜菜堿 美國(guó)Sigma公司;TaqDNA聚合酶、dNTPs 大連寶生物工程有限公司;動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司;引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Dhelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司;Synergy UV超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;-80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

    1.3 方法

    1.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

    選用大鼠和小鼠的線粒體基因作為特異性基因,針對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的大鼠和小鼠的線粒體基因序列,采用BLAST對(duì)相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析,確定大鼠環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)基因(KP244683.1)和小鼠的16S rRNA基因序列(KY018919.1)為保守序列,使用軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計(jì)了LAMP引物。LAMP引物包括2 條外引物F3、B3,2 條內(nèi)引物FIB(F1c+F2)、BIP(B1c+B2)和2 條環(huán)引物FLP、BLP,分別如圖1所示,引物序列詳見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物純化方式為高效液相色譜。

    表1 用于檢測(cè)鼠源性成分的LAMP引物Table 1LAMP primers used for detecting murine-derived ingredients

    圖1 小鼠源性成分(A)和大鼠源性成分(B)LAMP引物設(shè)計(jì)Fig.1 Primer design for LAMP of mouse-derived (A) and rat-derived (B) ingredients

    1.3.2 DNA提取

    樣品DNA的提取參考廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作,取適量組織樣本剪碎后置于含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行消化,后續(xù)通過對(duì)總DNA的吸附、洗滌和洗脫,最終得到純化的樣品基因組DNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度,經(jīng)測(cè)定DNA的質(zhì)量濃度分布在200~300 ng/μL,采用TE溶液將DNA模板稀釋到100 ng/μL,于-80 ℃保存。

    1.3.3 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道初步確定25 μL LAMP預(yù)反應(yīng)體系,其組成包括:1 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO4、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8 μmol/L FLP、0.8 μmol/L BLP、1.6 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、0.4 μmol/L SYTO-9、8UBstDNA聚合酶及2 μL模板。以雙蒸水為陰性對(duì)照,分別以大鼠、小鼠DNA模板為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行引物篩選。使用DHelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀進(jìn)行,程序設(shè)置為63 ℃、45 min。對(duì)MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶用量進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)體系。

    1.3.4 鼠源性LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

    按照1.3.3節(jié)建立的最佳LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),以大鼠和小鼠的DNA為陽(yáng)性對(duì)照,以超純水作為陰性對(duì)照,以豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的DNA為特異性實(shí)驗(yàn)?zāi)0?,以確定該恒溫檢測(cè)方法的特異性。

    1.3.5 鼠源性LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)

    以羊肉為基底肉,分別制備大鼠、小鼠不同質(zhì)量比例制備的混合模擬樣品(50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%),提取各濃度模擬樣品的DNA,按照1.3.3節(jié)所述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,以確定該恒溫檢測(cè)方法對(duì)大鼠、小鼠的檢測(cè)靈敏度。

    1.3.6 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    以大鼠、小鼠的檢出限濃度進(jìn)行10 個(gè)平行實(shí)驗(yàn),按照1.3.3節(jié)所述的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP檢測(cè),以確定該恒溫檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。

    1.3.7 實(shí)際羊肉樣品鼠源性檢測(cè)

    利用本研究建立的LAMP方法與real-time PCR檢測(cè)方法針對(duì)市售的羊肉制品進(jìn)行鼠源性成分檢測(cè),對(duì)比分析檢測(cè)結(jié)果,評(píng)價(jià)并比較其實(shí)際應(yīng)用性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    本研究主要對(duì)MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶含量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表2所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終確定25 μL LAMP體系成分如下:8 mmol/L MgSO4,0.8 mol/L甜菜堿,內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L,外引物F3和B3各0.2 μmol/L,環(huán)引物FLP和BLP各0.8 μmol/L,2.5 μL 10×Thermo pol Buffer,1.4 mmol/L dNTPs,10 UBstDNA聚合酶,最佳的LAMP體系反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。

    表2 LAMP體系優(yōu)化篩選Table 2Optimized LAMP system

    圖2 鼠源性體系優(yōu)化擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves for murine-derived ingredients under optimized conditions

    2.2 鼠源性LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行大鼠和小鼠的特異性實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示陰性對(duì)照和豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢等樣品DNA均未發(fā)生擴(kuò)增,僅對(duì)大鼠、小鼠樣品DNA出現(xiàn)了S型擴(kuò)增曲線,表明該恒溫檢測(cè)方法的特異性良好。

    圖3 鼠源性特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specificity analysis of LAMP for murine-derived ingredients

    2.3 鼠源性LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    為確定本方法的靈敏度,以羊肉為基底肉制備大鼠、小鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%的混合肉樣品,進(jìn)行DNA提取后進(jìn)行LAMP檢測(cè)。結(jié)果表明,大鼠源性成分的檢測(cè)靈敏度為0.1%;小鼠源性成分的檢測(cè)靈敏度為0.5%,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 大鼠(A)和小鼠(B)源性成分的檢測(cè)靈敏度Fig.4 Sensitivity analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

    2.4 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    為確定該方法的檢測(cè)穩(wěn)定性,對(duì)大鼠的檢出限0.1%,小鼠的檢出限0.5%各設(shè)置10 個(gè)平行,進(jìn)行LAMP檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明,該檢測(cè)方法具有良好的穩(wěn)定性。

    圖5 鼠源性檢測(cè)方法0.1%大鼠(A)和0.5%小鼠(B)重復(fù)性Fig.5 Repeatability analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

    2.5 實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果

    用建立的LAMP檢測(cè)方法和real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)49 份市售羊肉制品進(jìn)行檢測(cè),如表3所示。本研究的LAMP檢測(cè)方法與real-time PCR方法特異性為100.00%,靈敏度為100.00%,總符合率為100.00%。由于目前檢測(cè)陽(yáng)性樣本數(shù)較少,需后續(xù)增加樣本數(shù)判斷2 種方法的一致性。

    表3 鼠源性成分的LAMP和real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果Table 3Results of LAMP and real-time PCR for murine-derived ingredients adulterated in real samples

    3 討 論

    在利益的驅(qū)動(dòng)下,市面上肉制品摻假行為時(shí)有發(fā)生,自從“歐洲馬肉”事件曝光以來,肉制品摻假逐漸成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題[23-25]。隨著時(shí)間的推移和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,肉制品鑒偽領(lǐng)域的檢驗(yàn)技術(shù)日益完善。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸成為食品檢驗(yàn)領(lǐng)域監(jiān)管的有效手段,基于PCR和real-time PCR的羊、牛、豬、鴨等動(dòng)物源性快速檢測(cè)技術(shù)已日趨成熟,并逐步進(jìn)入國(guó)內(nèi)外檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。然而,使用鼠肉假冒羊肉違法行為被揭露的時(shí)間較短,而且,如今LAMP技術(shù)在肉制品摻假領(lǐng)域還沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)可供應(yīng)用。因此,國(guó)內(nèi)外使用LAMP技術(shù)進(jìn)行鼠源性成分定性和定量檢測(cè)鮮有報(bào)道。目前,李欣南[1]使用PCR、電泳檢測(cè)、LAMP等方法對(duì)小白鼠鼠源性成分進(jìn)行檢測(cè);Suryawan等[28]基于PCR對(duì)牛肉丸子的大鼠肉摻假進(jìn)行檢測(cè)。而基于快速、靈敏、準(zhǔn)確的LAMP技術(shù)建立的食品中大鼠和小鼠源性成分定性、定量檢測(cè)方法鮮見有報(bào)道。

    本研究設(shè)計(jì)了用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分鑒定的LAMP引物,擬建立鼠源性成分的定性檢測(cè)方法,基于鼠線粒體基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物,與核DNA相比,線粒體DNA因?yàn)槠洫?dú)特的遺傳方式和多拷貝而具有靈敏度高的特點(diǎn),因此,線粒體DNA被廣泛用于國(guó)內(nèi)外飼料、生鮮及肉制品的來源追蹤和食品中動(dòng)物源性成分的鑒別以及摻假肉類的定性、定量檢測(cè)[29-34]。本研究以大鼠COX基因(KP244683.1)和小鼠的16S rRNA基因(KY018919.1)作為目的基因設(shè)計(jì)LAMP引物,開發(fā)出鼠源性成分LAMP檢測(cè)體系。結(jié)果表明,本研究建立的LAMP方法具有較好的特異性,大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.1%和0.5%,對(duì)市售羊肉制品的恒溫檢測(cè)和real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性,總符合率為100.00%。

    與李欣南[1]使用PCR、電泳檢測(cè)和LAMP等對(duì)鼠源性成分進(jìn)行檢測(cè)方法相比,本研究建立的LAMP方法分別對(duì)大鼠和小鼠2 種鼠源性成分進(jìn)行研究,而李欣南[1]僅針對(duì)小白鼠展開鼠源性檢測(cè),在實(shí)驗(yàn)對(duì)象方面本實(shí)驗(yàn)建立的鼠源性檢測(cè)方法覆蓋面更廣。與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,本實(shí)驗(yàn)在確保檢測(cè)方法特異性的前提下,將鼠源性檢測(cè)的靈敏度提高了1 個(gè)數(shù)量級(jí);同時(shí),通過10 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,本研究建立的鼠源性成分檢測(cè)方法具有更高的穩(wěn)定性。因此,本研究建立的鼠源性LAMP檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性良好、操作簡(jiǎn)單、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)。補(bǔ)充和完善了鼠源性檢測(cè)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法,適用于基層檢測(cè)單位或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),實(shí)用性強(qiáng),具有良好的研究、推廣價(jià)值和應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    源性靈敏度特異性
    后溪穴治療脊柱源性疼痛的研究進(jìn)展
    導(dǎo)磁環(huán)對(duì)LVDT線性度和靈敏度的影響
    地下水非穩(wěn)定流的靈敏度分析
    精確制導(dǎo) 特異性溶栓
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
    穿甲爆破彈引信對(duì)薄弱目標(biāo)的靈敏度分析
    雄激素源性禿發(fā)家系調(diào)查
    兒童非特異性ST-T改變
    健康教育對(duì)治療空氣源性接觸性皮炎的干預(yù)作用
    久久久久久久大尺度免费视频| 成人漫画全彩无遮挡| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产色婷婷99| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 免费黄网站久久成人精品| 午夜激情久久久久久久| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲不卡免费看| av电影中文网址| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 在线观看一区二区三区激情| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜免费鲁丝| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品成人在线| 国产成人精品久久久久久| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品456在线播放app| 最近手机中文字幕大全| 国产精品偷伦视频观看了| 久久精品人人爽人人爽视色| 人妻 亚洲 视频| 亚洲图色成人| 简卡轻食公司| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久国产一区二区| 美女国产视频在线观看| av播播在线观看一区| 亚洲av日韩在线播放| 国产在线视频一区二区| 日本欧美视频一区| 午夜精品国产一区二区电影| 人妻系列 视频| 婷婷色综合www| av在线播放精品| 制服人妻中文乱码| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 制服诱惑二区| 两个人的视频大全免费| .国产精品久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 老熟女久久久| 春色校园在线视频观看| 日日撸夜夜添| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩一区二区三区影片| 99九九在线精品视频| av天堂久久9| 各种免费的搞黄视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产精品999| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 三级国产精品欧美在线观看| videos熟女内射| 日韩欧美精品免费久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 中国三级夫妇交换| 最新中文字幕久久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 成人亚洲欧美一区二区av| 91精品三级在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久久精品性色| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲内射少妇av| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人毛片60女人毛片免费| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲国产精品999| 国产成人午夜福利电影在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久午夜综合久久蜜桃| 成人国语在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 天天操日日干夜夜撸| av.在线天堂| 亚洲在久久综合| 欧美+日韩+精品| 免费看不卡的av| 成人综合一区亚洲| 国产高清三级在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 午夜免费鲁丝| 桃花免费在线播放| 黄片无遮挡物在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产av精品麻豆| 波野结衣二区三区在线| 亚洲中文av在线| 成年人免费黄色播放视频| a级片在线免费高清观看视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲第一av免费看| 久久久久久久国产电影| 婷婷成人精品国产| 国内精品宾馆在线| 午夜免费鲁丝| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜日本视频在线| 在线天堂最新版资源| 久久精品国产亚洲av涩爱| 人妻 亚洲 视频| 男人添女人高潮全过程视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 在线观看www视频免费| 麻豆乱淫一区二区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲综合精品二区| av国产精品久久久久影院| 欧美国产精品一级二级三级| 美女国产视频在线观看| 日本wwww免费看| 中文欧美无线码| videosex国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久国产欧美日韩av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av国产精品久久久久影院| 中文字幕av电影在线播放| 在线观看国产h片| 夫妻午夜视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲综合色惰| 桃花免费在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲欧洲国产日韩| 国产一区二区在线观看日韩| 日本av免费视频播放| 一区二区三区精品91| 制服丝袜香蕉在线| 国产深夜福利视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| av黄色大香蕉| 亚洲图色成人| 内地一区二区视频在线| 乱人伦中国视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品一二三区在线看| 久久精品夜色国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲av综合色区一区| 日本黄色片子视频| 少妇 在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 最近的中文字幕免费完整| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲成人手机| 久久青草综合色| 国产男女内射视频| 有码 亚洲区| 色哟哟·www| 亚洲欧洲日产国产| 日韩三级伦理在线观看| 午夜久久久在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 伦理电影免费视频| 人人澡人人妻人| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久99一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 国产极品天堂在线| 午夜av观看不卡| 欧美日韩在线观看h| 国产 一区精品| 99热国产这里只有精品6| 亚洲国产av新网站| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 国产成人免费观看mmmm| 国产熟女午夜一区二区三区 | 精品午夜福利在线看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲av男天堂| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久精品94久久精品| 我的女老师完整版在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美性感艳星| 校园人妻丝袜中文字幕| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 高清不卡的av网站| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久精品性色| 国产精品一二三区在线看| 简卡轻食公司| 性色av一级| 欧美亚洲日本最大视频资源| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 男女免费视频国产| freevideosex欧美| 最新中文字幕久久久久| 久久久久视频综合| 亚洲国产精品一区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 大香蕉97超碰在线| 简卡轻食公司| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲综合精品二区| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲人与动物交配视频| 91精品国产九色| 高清毛片免费看| 丝袜喷水一区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99国产综合亚洲精品| 看免费成人av毛片| 亚洲性久久影院| 国产一区二区三区综合在线观看 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 国精品久久久久久国模美| 好男人视频免费观看在线| 国产片特级美女逼逼视频| 国产一级毛片在线| av黄色大香蕉| 日韩电影二区| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 色婷婷av一区二区三区视频| 精品一区二区免费观看| 日韩伦理黄色片| 99热网站在线观看| 少妇的逼好多水| 免费观看性生交大片5| av卡一久久| 成年人午夜在线观看视频| 99热全是精品| 午夜精品国产一区二区电影| 国产色爽女视频免费观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲,欧美,日韩| 黄色一级大片看看| 制服丝袜香蕉在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲综合精品二区| 午夜激情福利司机影院| 99久久人妻综合| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产爽快片一区二区三区| 久久久久久久久久久丰满| 久久久欧美国产精品| 色94色欧美一区二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | av播播在线观看一区| 青春草亚洲视频在线观看| 五月天丁香电影| 国产成人精品一,二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| tube8黄色片| 免费看光身美女| 交换朋友夫妻互换小说| 色哟哟·www| 国产精品一区www在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 成人影院久久| 如何舔出高潮| av有码第一页| 亚洲美女视频黄频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产乱人偷精品视频| 麻豆成人av视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 伦理电影大哥的女人| 国产精品人妻久久久影院| 2021少妇久久久久久久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲精品日本国产第一区| 少妇熟女欧美另类| 久久午夜福利片| 亚洲国产精品成人久久小说| 婷婷成人精品国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 大香蕉久久网| 高清黄色对白视频在线免费看| 伊人亚洲综合成人网| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产欧美在线一区| 国产成人av激情在线播放 | 欧美成人午夜免费资源| 夜夜爽夜夜爽视频| 欧美+日韩+精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 黄片无遮挡物在线观看| 少妇的逼好多水| 热re99久久国产66热| 青春草国产在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 久久av网站| 22中文网久久字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久精品94久久精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 少妇熟女欧美另类| 国产日韩欧美亚洲二区| 99国产精品免费福利视频| 在线天堂最新版资源| av在线观看视频网站免费| 日韩大片免费观看网站| 久久久精品94久久精品| 午夜福利影视在线免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 伊人久久国产一区二区| 欧美人与善性xxx| 满18在线观看网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 一本色道久久久久久精品综合| 色哟哟·www| 久久国内精品自在自线图片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 九草在线视频观看| 国产极品天堂在线| 日韩中字成人| 亚洲情色 制服丝袜| av不卡在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 成人手机av| 亚洲av男天堂| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 毛片一级片免费看久久久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 中文字幕久久专区| 国产成人精品在线电影| 美女主播在线视频| 成人漫画全彩无遮挡| 一本大道久久a久久精品| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久午夜欧美精品| 七月丁香在线播放| 久久久久久久精品精品| 久久久国产一区二区| 亚洲四区av| 日本91视频免费播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| 在线观看国产h片| 91精品国产国语对白视频| 免费看av在线观看网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 尾随美女入室| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久精品国产自在天天线| 黄片播放在线免费| 国产精品久久久久成人av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本免费在线观看一区| 亚洲欧洲日产国产| 久久 成人 亚洲| 另类精品久久| 97超碰精品成人国产| 国产成人精品福利久久| 欧美日韩在线观看h| 青春草国产在线视频| 亚洲国产最新在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 成人国语在线视频| 欧美日韩av久久| 成人免费观看视频高清| 国国产精品蜜臀av免费| av线在线观看网站| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产午夜精品一二区理论片| 美女国产视频在线观看| 久久久精品区二区三区| av有码第一页| 多毛熟女@视频| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品 国内视频| 好男人视频免费观看在线| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品乱久久久久久| 婷婷色av中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 在线观看免费视频网站a站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| a 毛片基地| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品三级大全| 亚洲少妇的诱惑av| av播播在线观看一区| 国产在视频线精品| 看免费成人av毛片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜精品国产一区二区电影| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 99re6热这里在线精品视频| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品一区蜜桃| 中文欧美无线码| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 十八禁高潮呻吟视频| 一区在线观看完整版| 人妻少妇偷人精品九色| 插逼视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av成人精品一区久久| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 精品一区二区三卡| 欧美日韩精品成人综合77777| av不卡在线播放| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲欧洲日产国产| 97在线人人人人妻| 大香蕉久久成人网| 成年人午夜在线观看视频| 女人久久www免费人成看片| 在线观看国产h片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费观看a级毛片全部| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 全区人妻精品视频| 国精品久久久久久国模美| 国产又色又爽无遮挡免| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 尾随美女入室| 欧美国产精品一级二级三级| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲av不卡在线观看| 日本黄大片高清| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99国产精品免费福利视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 日本91视频免费播放| 国产国语露脸激情在线看| 性色av一级| 久久久午夜欧美精品| 美女国产高潮福利片在线看| 大陆偷拍与自拍| 国产免费视频播放在线视频| 国产又色又爽无遮挡免| 一级片'在线观看视频| av在线app专区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚州av有码| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩中字成人| 国产精品一二三区在线看| 日韩一本色道免费dvd| av不卡在线播放| 精品国产露脸久久av麻豆| 男男h啪啪无遮挡| 精品酒店卫生间| 国产高清有码在线观看视频| 97超碰精品成人国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品国产三级国产专区5o| 男女边摸边吃奶| a级毛片黄视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 全区人妻精品视频| 嫩草影院入口| 岛国毛片在线播放| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲三级黄色毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费黄频网站在线观看国产| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 99久久精品国产国产毛片| 色94色欧美一区二区| 大片免费播放器 马上看| 少妇高潮的动态图| 黄色毛片三级朝国网站| 看免费成人av毛片| 综合色丁香网| 十八禁网站网址无遮挡| xxxhd国产人妻xxx| 91精品三级在线观看| 色视频在线一区二区三区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 18禁在线播放成人免费| 国产午夜精品一二区理论片| √禁漫天堂资源中文www| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 777米奇影视久久| 亚洲三级黄色毛片| 777米奇影视久久| 欧美97在线视频| 高清av免费在线| 免费人成在线观看视频色| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品蜜桃在线观看| 91国产中文字幕| 超碰97精品在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久久影院123| 日韩电影二区| 高清av免费在线| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲欧洲日产国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久国产一区二区| 成人综合一区亚洲| 十分钟在线观看高清视频www| 新久久久久国产一级毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本与韩国留学比较| 国产亚洲一区二区精品| 街头女战士在线观看网站| 丝袜在线中文字幕| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av免费在线看不卡| 午夜影院在线不卡| 啦啦啦在线观看免费高清www| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 久久久久国产网址| 好男人视频免费观看在线| 久久人妻熟女aⅴ| 成年人午夜在线观看视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产乱来视频区| 五月伊人婷婷丁香| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩制服骚丝袜av| 少妇精品久久久久久久| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲欧美成人精品一区二区| 色视频在线一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一本久久精品| 中文天堂在线官网| 韩国高清视频一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 一个人免费看片子| 免费av中文字幕在线| 十八禁网站网址无遮挡| 在线观看免费高清a一片| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品久久久久久精品电影小说| 超色免费av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 色吧在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 免费大片18禁| 久久久久国产网址| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品夜色国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 一级片'在线观看视频| 尾随美女入室| 嫩草影院入口| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品成人av观看孕妇|