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    利用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)羊肉制品中的鼠源性成分

    2021-07-08 03:52:18陳珍金蔡凱賢顏棟林謝耐珍陳小聰
    食品科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:源性靈敏度特異性

    陳珍金,張 璜,石 磊,葉 蕾,蔡凱賢,顏棟林,韋 濤,謝耐珍,陳小聰,*

    (1.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院,廣東 廣州 510632;2.廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司,廣東 廣州 510000;3.廣西東盟食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,廣西 南寧 530000)

    肉類摻假的歷史非常悠久,自古代起就有“掛羊頭賣狗肉”的說法[1]。時(shí)至今日,從歐洲馬肉事件到近期報(bào)道的鼠肉冒充羊肉串等羊肉制品以及假冒偽劣的牛肉等事件,“肉類摻假”不停地沖擊著食品安全體系,給社會(huì)帶來了巨大的負(fù)面影響[2-3]。其中最值得關(guān)注的是羊肉制品的鼠肉摻假事件,雖然我國(guó)的食品監(jiān)察管理部門針對(duì)鼠肉摻假等一系列問題進(jìn)行嚴(yán)格的篩查,但是我國(guó)在鑒別肉類摻假方面尚未有完善的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)察體系[1,4-5],尤其像鼠肉這種特殊的肉源性成分,且由于肉類產(chǎn)品具有產(chǎn)品流通量大和常溫下貯藏保質(zhì)期短等特點(diǎn)[6],在實(shí)驗(yàn)室條件下常用的定量和定性檢測(cè)方法很難滿足實(shí)時(shí)、快捷、大批量的產(chǎn)品檢測(cè)需求,因此亟需開發(fā)出快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確、便捷的肉源性成分快速檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品。

    目前,對(duì)肉類制品中的種屬鑒定主要包括高效液相色譜、等電聚焦電泳和酶聯(lián)免疫測(cè)定等客觀儀器分析技術(shù)檢測(cè)方法[7-12],但都因?yàn)槠錂z測(cè)方法靈敏度低、操作周期長(zhǎng)、操作要求高等劣勢(shì)而未被基層廣泛推廣使用。以DNA為目標(biāo)的動(dòng)物種屬鑒定是當(dāng)前普遍使用的肉類摻假分子生物學(xué)檢測(cè)方法,實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測(cè)方法憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),且由于其具有高時(shí)效性和高準(zhǔn)確性,已經(jīng)逐漸取代了常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù),成為肉類種屬鑒定的主要檢測(cè)方法[13-17]。但是real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR需使用昂貴的儀器設(shè)備作為實(shí)驗(yàn)支撐,檢測(cè)成本相對(duì)較高,且反應(yīng)過程需要升降溫,導(dǎo)致該檢測(cè)技術(shù)不能很好應(yīng)用于廣大基層單位[18-19]。因此,亟待研究開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、性價(jià)比高、恒溫且易于廣大基層單位操作的分子檢測(cè)方法,為廣大基層單位肉制品摻假診斷提供新的選擇。

    環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)作為近幾年來的新型核酸擴(kuò)增技術(shù),克服了傳統(tǒng)PCR、real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測(cè)方法反復(fù)升降溫且檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)的缺點(diǎn),利用BstDNA聚合酶和根據(jù)特定靶序列設(shè)計(jì)的3 對(duì)特殊的內(nèi)、外、環(huán)引物,特異性識(shí)別靶序列上的6 個(gè)獨(dú)立區(qū)域,啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng),可實(shí)現(xiàn)恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增。因其具有恒溫、特異性強(qiáng)、靈敏度高、性價(jià)比高和操作簡(jiǎn)易等特點(diǎn)[20-22],本研究將基于LAMP檢測(cè)技術(shù)首次開發(fā)出大鼠、小鼠鼠源性檢測(cè)試劑盒,實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確、易于操作的檢測(cè)目的,從而向廣大基層單位推廣使用,實(shí)現(xiàn)對(duì)摻假羊肉制品中大鼠、小鼠鼠源性成分的檢測(cè),以期為肉制品質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羊、豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的動(dòng)物組織均購(gòu)自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市。大鼠、小鼠組織由暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院提供。將羊和2 種生鮮鼠肉分別按不同質(zhì)量比例進(jìn)行混合制備模擬樣品,用于確定混合肉制品當(dāng)中鼠源性成分的檢出限。

    BstDNA聚合酶 美國(guó)NEB公司;Tris、NaCl、Na2EDTA、甜菜堿 美國(guó)Sigma公司;TaqDNA聚合酶、dNTPs 大連寶生物工程有限公司;動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司;引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Dhelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司;Synergy UV超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;-80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

    1.3 方法

    1.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

    選用大鼠和小鼠的線粒體基因作為特異性基因,針對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的大鼠和小鼠的線粒體基因序列,采用BLAST對(duì)相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析,確定大鼠環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)基因(KP244683.1)和小鼠的16S rRNA基因序列(KY018919.1)為保守序列,使用軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計(jì)了LAMP引物。LAMP引物包括2 條外引物F3、B3,2 條內(nèi)引物FIB(F1c+F2)、BIP(B1c+B2)和2 條環(huán)引物FLP、BLP,分別如圖1所示,引物序列詳見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物純化方式為高效液相色譜。

    表1 用于檢測(cè)鼠源性成分的LAMP引物Table 1LAMP primers used for detecting murine-derived ingredients

    圖1 小鼠源性成分(A)和大鼠源性成分(B)LAMP引物設(shè)計(jì)Fig.1 Primer design for LAMP of mouse-derived (A) and rat-derived (B) ingredients

    1.3.2 DNA提取

    樣品DNA的提取參考廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作,取適量組織樣本剪碎后置于含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行消化,后續(xù)通過對(duì)總DNA的吸附、洗滌和洗脫,最終得到純化的樣品基因組DNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度,經(jīng)測(cè)定DNA的質(zhì)量濃度分布在200~300 ng/μL,采用TE溶液將DNA模板稀釋到100 ng/μL,于-80 ℃保存。

    1.3.3 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道初步確定25 μL LAMP預(yù)反應(yīng)體系,其組成包括:1 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO4、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8 μmol/L FLP、0.8 μmol/L BLP、1.6 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、0.4 μmol/L SYTO-9、8UBstDNA聚合酶及2 μL模板。以雙蒸水為陰性對(duì)照,分別以大鼠、小鼠DNA模板為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行引物篩選。使用DHelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀進(jìn)行,程序設(shè)置為63 ℃、45 min。對(duì)MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶用量進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)體系。

    1.3.4 鼠源性LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

    按照1.3.3節(jié)建立的最佳LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),以大鼠和小鼠的DNA為陽(yáng)性對(duì)照,以超純水作為陰性對(duì)照,以豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的DNA為特異性實(shí)驗(yàn)?zāi)0?,以確定該恒溫檢測(cè)方法的特異性。

    1.3.5 鼠源性LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)

    以羊肉為基底肉,分別制備大鼠、小鼠不同質(zhì)量比例制備的混合模擬樣品(50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%),提取各濃度模擬樣品的DNA,按照1.3.3節(jié)所述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,以確定該恒溫檢測(cè)方法對(duì)大鼠、小鼠的檢測(cè)靈敏度。

    1.3.6 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    以大鼠、小鼠的檢出限濃度進(jìn)行10 個(gè)平行實(shí)驗(yàn),按照1.3.3節(jié)所述的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP檢測(cè),以確定該恒溫檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。

    1.3.7 實(shí)際羊肉樣品鼠源性檢測(cè)

    利用本研究建立的LAMP方法與real-time PCR檢測(cè)方法針對(duì)市售的羊肉制品進(jìn)行鼠源性成分檢測(cè),對(duì)比分析檢測(cè)結(jié)果,評(píng)價(jià)并比較其實(shí)際應(yīng)用性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    本研究主要對(duì)MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶含量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表2所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終確定25 μL LAMP體系成分如下:8 mmol/L MgSO4,0.8 mol/L甜菜堿,內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L,外引物F3和B3各0.2 μmol/L,環(huán)引物FLP和BLP各0.8 μmol/L,2.5 μL 10×Thermo pol Buffer,1.4 mmol/L dNTPs,10 UBstDNA聚合酶,最佳的LAMP體系反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。

    表2 LAMP體系優(yōu)化篩選Table 2Optimized LAMP system

    圖2 鼠源性體系優(yōu)化擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves for murine-derived ingredients under optimized conditions

    2.2 鼠源性LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行大鼠和小鼠的特異性實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示陰性對(duì)照和豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢等樣品DNA均未發(fā)生擴(kuò)增,僅對(duì)大鼠、小鼠樣品DNA出現(xiàn)了S型擴(kuò)增曲線,表明該恒溫檢測(cè)方法的特異性良好。

    圖3 鼠源性特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specificity analysis of LAMP for murine-derived ingredients

    2.3 鼠源性LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    為確定本方法的靈敏度,以羊肉為基底肉制備大鼠、小鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%的混合肉樣品,進(jìn)行DNA提取后進(jìn)行LAMP檢測(cè)。結(jié)果表明,大鼠源性成分的檢測(cè)靈敏度為0.1%;小鼠源性成分的檢測(cè)靈敏度為0.5%,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 大鼠(A)和小鼠(B)源性成分的檢測(cè)靈敏度Fig.4 Sensitivity analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

    2.4 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    為確定該方法的檢測(cè)穩(wěn)定性,對(duì)大鼠的檢出限0.1%,小鼠的檢出限0.5%各設(shè)置10 個(gè)平行,進(jìn)行LAMP檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明,該檢測(cè)方法具有良好的穩(wěn)定性。

    圖5 鼠源性檢測(cè)方法0.1%大鼠(A)和0.5%小鼠(B)重復(fù)性Fig.5 Repeatability analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

    2.5 實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果

    用建立的LAMP檢測(cè)方法和real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)49 份市售羊肉制品進(jìn)行檢測(cè),如表3所示。本研究的LAMP檢測(cè)方法與real-time PCR方法特異性為100.00%,靈敏度為100.00%,總符合率為100.00%。由于目前檢測(cè)陽(yáng)性樣本數(shù)較少,需后續(xù)增加樣本數(shù)判斷2 種方法的一致性。

    表3 鼠源性成分的LAMP和real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果Table 3Results of LAMP and real-time PCR for murine-derived ingredients adulterated in real samples

    3 討 論

    在利益的驅(qū)動(dòng)下,市面上肉制品摻假行為時(shí)有發(fā)生,自從“歐洲馬肉”事件曝光以來,肉制品摻假逐漸成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題[23-25]。隨著時(shí)間的推移和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,肉制品鑒偽領(lǐng)域的檢驗(yàn)技術(shù)日益完善。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸成為食品檢驗(yàn)領(lǐng)域監(jiān)管的有效手段,基于PCR和real-time PCR的羊、牛、豬、鴨等動(dòng)物源性快速檢測(cè)技術(shù)已日趨成熟,并逐步進(jìn)入國(guó)內(nèi)外檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。然而,使用鼠肉假冒羊肉違法行為被揭露的時(shí)間較短,而且,如今LAMP技術(shù)在肉制品摻假領(lǐng)域還沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)可供應(yīng)用。因此,國(guó)內(nèi)外使用LAMP技術(shù)進(jìn)行鼠源性成分定性和定量檢測(cè)鮮有報(bào)道。目前,李欣南[1]使用PCR、電泳檢測(cè)、LAMP等方法對(duì)小白鼠鼠源性成分進(jìn)行檢測(cè);Suryawan等[28]基于PCR對(duì)牛肉丸子的大鼠肉摻假進(jìn)行檢測(cè)。而基于快速、靈敏、準(zhǔn)確的LAMP技術(shù)建立的食品中大鼠和小鼠源性成分定性、定量檢測(cè)方法鮮見有報(bào)道。

    本研究設(shè)計(jì)了用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分鑒定的LAMP引物,擬建立鼠源性成分的定性檢測(cè)方法,基于鼠線粒體基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物,與核DNA相比,線粒體DNA因?yàn)槠洫?dú)特的遺傳方式和多拷貝而具有靈敏度高的特點(diǎn),因此,線粒體DNA被廣泛用于國(guó)內(nèi)外飼料、生鮮及肉制品的來源追蹤和食品中動(dòng)物源性成分的鑒別以及摻假肉類的定性、定量檢測(cè)[29-34]。本研究以大鼠COX基因(KP244683.1)和小鼠的16S rRNA基因(KY018919.1)作為目的基因設(shè)計(jì)LAMP引物,開發(fā)出鼠源性成分LAMP檢測(cè)體系。結(jié)果表明,本研究建立的LAMP方法具有較好的特異性,大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.1%和0.5%,對(duì)市售羊肉制品的恒溫檢測(cè)和real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性,總符合率為100.00%。

    與李欣南[1]使用PCR、電泳檢測(cè)和LAMP等對(duì)鼠源性成分進(jìn)行檢測(cè)方法相比,本研究建立的LAMP方法分別對(duì)大鼠和小鼠2 種鼠源性成分進(jìn)行研究,而李欣南[1]僅針對(duì)小白鼠展開鼠源性檢測(cè),在實(shí)驗(yàn)對(duì)象方面本實(shí)驗(yàn)建立的鼠源性檢測(cè)方法覆蓋面更廣。與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,本實(shí)驗(yàn)在確保檢測(cè)方法特異性的前提下,將鼠源性檢測(cè)的靈敏度提高了1 個(gè)數(shù)量級(jí);同時(shí),通過10 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,本研究建立的鼠源性成分檢測(cè)方法具有更高的穩(wěn)定性。因此,本研究建立的鼠源性LAMP檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性良好、操作簡(jiǎn)單、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)。補(bǔ)充和完善了鼠源性檢測(cè)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法,適用于基層檢測(cè)單位或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),實(shí)用性強(qiáng),具有良好的研究、推廣價(jià)值和應(yīng)用前景。

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