UPLC-MS/MS快速篩查豆芽中27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物

顏偉華，周 瑩，郭浩煒，王笑笑

（衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 衢州 324002）

豆芽，又稱芽苗菜，品種豐富，營養(yǎng)全面，是老百姓餐桌上的常見菜。近年來豆芽涉“毒”事件屢屢發(fā)生、問題豆芽事件愈演愈烈[1-2]，相關(guān)部門對豆芽食品安全的關(guān)注和監(jiān)管[3-4]也越來越大，有報(bào)道指出在豆芽生產(chǎn)中可能存在違法使用植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的現(xiàn)象[3-5]。植物生長調(diào)節(jié)劑如4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、赤霉素等，是一類用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的農(nóng)藥，可促進(jìn)植物生長、提高農(nóng)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量?？股仡愃幬锶缍髦Z沙星、諾氟沙星、甲硝唑、氯霉素等，其主要目的是用于殺菌消毒和防止根部腐爛。然而植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的濫用，可引起人畜急慢性中毒，易導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，嚴(yán)重危害了人們的健康[6-7]。

當(dāng)前豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的檢測方法文獻(xiàn)均有報(bào)道[8-23]，BJS 201703（2017年第24號公告發(fā)布）采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中11 種植物生長調(diào)節(jié)劑，浙江省市場監(jiān)督管理局制定的《關(guān)于加強(qiáng)生豬產(chǎn)品、豆芽等重點(diǎn)食品農(nóng)產(chǎn)品排查治理工作的緊急通知》附件2采用了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分別測定6 種喹諾酮化合物和甲硝唑。但檢測方法多為單個(gè)或幾個(gè)化合物一個(gè)方法，前處理方法繁瑣耗時(shí)長，不能滿足食品安全突發(fā)事件快速處置工作所要求的高效率、多組分等要求，因此選擇合適的提取方法和分析手段對解決多組分植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的同時(shí)測定尤為重要。

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[24-30]、日常監(jiān)管需求及大量的豆芽檢測經(jīng)驗(yàn)，選擇27 種生長激素和抗生素類藥物作為研究對象，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法，測定豆芽中可能添加的27 種生長激素和抗生素類藥物，并應(yīng)用該法對259 批豆芽進(jìn)行測定。本研究旨在拓展豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的檢測范圍和深度，提高日常檢測的工作效率，以期為社會食品安全共享服務(wù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測樣品來自衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院監(jiān)督抽驗(yàn)樣品、委托樣品、豆芽專項(xiàng)整治樣品，共259 批樣品。乙腈、甲醇、甲酸、正己烷均為色譜純，其他化學(xué)試劑為分析純，水為自制超純水。

2,4-二氯苯氧乙酸鈉（批號：C11946000）、氯吡脲（批號：C13907000）、赤霉素（批號：C14020000）、4-氯苯氧乙酸（批號：C11480000）、噻苯隆（批號：C17465000）、6-芐基腺嘌呤（批號：C10569600）、1-萘乙酸（批號：C15460000）、磺胺甲基嘧啶（批號：C16995100）、磺胺甲惡唑（批號：C16998100）、磺胺喹惡啉（批號：C16990000）、磺胺嘧啶（批號：C16990500）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（批號：C16990600）等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；磺胺二甲嘧啶（批號：100411-200501）、磺胺間甲氧嘧啶（批號：510093-201401）、磺胺鄰二甲嘧啶（批號：510095-201401）、甲硝唑（批號：100191-201507）、氯霉素（批號：130555-200602）、諾氟沙星（批號：130450-200705）、氧氟沙星（批號：130454-200202）、培氟沙星（批號：130459-201402）、洛美沙星（批號：130452-200001）、環(huán)丙沙星（批號：130451-200302）、恩諾沙星（批號：510117-201501）等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于98%） 中國食品藥品檢定研究院；多效唑（批號：A1708094，100%）、烯效唑（批號：A1708071，100%） 北京云墨質(zhì)檢科技有限公司；4-氟苯氧乙酸（批號：IST24058）、異戊烯腺嘌呤（批號：IST24059） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-8040三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）及Labsolutions軟件）日本島津公司；XS-205電子天平 瑞士梅特勒公司；SK5200HP超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀 法國Millipore公司；X1R冷凍離心機(jī) 美國賽默飛公司；QE-100粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A相為0.01%甲酸溶液，B相為甲醇。流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積1 μL[10]。流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1Gradient program of mobile phase

1.3.2 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓：3.5 kV；電離模式：ESI+和ESI－；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；脫溶劑氣溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；干燥氣流速：15 L/min；霧化氣流速：3 L/min。分別對27 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定性離子和定量離子進(jìn)行質(zhì)譜掃描[10-11]。

掃描方式：噻苯隆、2,4二氯苯氧乙酸鈉、氯吡脲、赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、1-萘乙酸、氯霉素采用負(fù)離子模式掃描；甲硝唑、多效唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間二甲嘧啶、磺胺鄰二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、烯效唑采用正離子模式掃描。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取27 種標(biāo)準(zhǔn)品各約20 mg，分別置于10 mL量瓶中，100%甲醇超聲處理15 min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液。精密量取以上標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量置同一量瓶中，用甲醇稀釋，配制成10～200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并用初始流動(dòng)相逐步稀釋至質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、200 ng/mL（其中赤霉素、1-萘乙酸質(zhì)量濃度均為100、250、500、1 000、2 000 ng/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.4 供試品溶液的制備

將豆芽切碎后用組織粉碎機(jī)充分粉碎混勻，準(zhǔn)確稱取5.0 g試樣，置于50 mL具塞離心管中，加入10 g無水硫酸鈉，立即渦旋混合1 min，加入20 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，稱量，超聲15 min，用乙酸乙酯補(bǔ)足質(zhì)量后，12 000 r/min離心5 min，精密移取上清液10.0 mL于45 ℃水浴中氮吹至干，用甲醇定容至1 mL，渦旋混勻1 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后，取續(xù)濾液供UPLC-MS/MS測定，并視情況進(jìn)一步稀釋。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Labsolutions軟件（島津公司）進(jìn)行UPLC-MS/MS圖譜分析，Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)處理，SPSS 21.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

考慮到27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的快速篩查需要通用、快速、回收率優(yōu)化的前處理方法，本方法選取27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物中比較典型或回收率較差的4-氯苯氧乙酸、赤霉素、甲硝唑、諾氟沙星、磺胺間甲氧嘧啶5 種化合物作為依據(jù)，樣品在相同加標(biāo)量20 μg/kg的情況下，分別考察乙腈、1%酸化乙腈、乙酸乙酯不同提取液的回收率，結(jié)果如圖1所示。使用乙酸乙酯作為提取溶液時(shí)，4-氯苯氧乙酸、赤霉素、甲硝唑、諾氟沙星、磺胺間甲氧嘧啶回收率穩(wěn)定，均為80%以上。

圖1 不同提取溶劑的回收率Fig.1 Recoveries of analytes with different extraction solvents

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

樣品在使用相同提取試劑和相同加標(biāo)量20 μg/kg的情況下，選取27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物中比較典型或回收率較差的5 種化合物作為依據(jù)，分別考察正混合型陽離子交換柱凈化、QuEChERS離心管（300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18）凈化、不凈化3 種方式對5 種化合物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 凈化方式對回收率的影響Fig.2 Recoveries of analytes with different clean-up methods

綜上所述，由于豆芽基質(zhì)較干凈，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑，不經(jīng)凈化，目標(biāo)化合物的回收率均在80%以上，不僅操作方便快速，而且提高了目標(biāo)化合物的回收率，更加適合日常檢驗(yàn)中豆芽27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物快速篩查。

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

比較甲醇與乙腈兩種有機(jī)相對27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物分離效果的影響，結(jié)果表明：使用乙腈為有機(jī)相時(shí)，大多數(shù)化合物分離效果略優(yōu)于甲醇，但甲硝唑、磺胺嘧啶等部分化合物出鋒時(shí)間過早且易出現(xiàn)分叉峰，故采用甲醇為有機(jī)相。比較6 種水相（水、0.01%甲酸溶液、0.1%甲酸、0.02%甲酸溶液、0.15 mmol/L乙酸銨溶液、0.01%甲酸-0.15 mmol/L乙酸銨溶液）對27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物分離效果的影響，結(jié)果表明：使用純水溶液為水相時(shí)，大部分化合物出現(xiàn)分叉拖尾現(xiàn)象；0.01%甲酸溶液能夠顯著改善氧氟沙星等喹諾酮類化合物，隨著甲酸含量的增大，雖然能進(jìn)一步改善喹諾酮類化合物的峰形，但明顯降低了1-萘乙酸的峰響應(yīng)值；0.15 mmol/L乙酸銨溶液可顯著改善甲硝唑、多效唑的峰形，卻使得氧氟沙星等喹諾酮類化合物峰形變差，峰面積大大降低，同時(shí)也降低了赤霉素等部分負(fù)離子模式下的化合物的峰響應(yīng)值；0.01%甲酸-0.15 mmol/L乙酸銨作為水相，赤霉素、2,4-二氯苯氧乙酸鈉的響應(yīng)較低。在不同流動(dòng)相下，部分化合物的峰面積見表2。結(jié)合27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物的整體響應(yīng)，優(yōu)先考慮受甲酸、乙酸銨流動(dòng)相影響較大的1-萘乙酸、赤霉素、氧氟沙星、2,4-二氯苯氧乙酸鈉的原則下，最終選擇0.01%甲酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜分離圖見圖3。

表2 水相對化合物峰面積的影響Table 2Effect of aqueous phase composition on peak areas of analytes

圖3 27 種化合物的總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatograms of 27 reference compounds

2.1.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在1.3.1節(jié)條件下，優(yōu)化脫溶劑溫度、碰撞能量、噴針位置等參數(shù)，最終確定17 種化合物采用正離子模式可獲得較好的靈敏度和穩(wěn)定性，10 種化合物采用負(fù)離子模式可獲得較好的靈敏度和穩(wěn)定性。在相應(yīng)模式下做選擇提取離子掃描，選擇靈敏度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的提取離子作為定量離子，次之的作為定性離子。27 種化合物的電離方式、定量離子、定性離子、碰撞能量及保留時(shí)間見表3。

表3 27 種化合物定量離子、定性離子、碰撞能量及保留時(shí)間Table 3Mass spectral parameters and retention times for 27 compounds

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 專屬性

將1.3.3節(jié)質(zhì)量濃度為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.1、1.3.2和1.3.4節(jié)色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，得到標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖，見圖3。取不含27 種化合物的豆芽按1.3.4節(jié)方法處理并測定，陰性樣品色譜圖上均無干擾。

2.2.2 檢出限和定量限

取不含27 種化合物的豆芽加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣，以信噪比為3和信噪比為10時(shí)分別計(jì)算各成分的檢出限和定量限。檢出限為0.5～50 μg/kg，定量限為1.5～150 μg/kg，見表4。結(jié)果顯示該方法具有較高的靈敏度，能夠滿足豆芽中27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物快速篩查的檢測要求。

表4 27 種化合物線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率、重復(fù)性及精密度Table 4Linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs,recoveries, repeatability and precision for 27 compounds

2.2.3 線性范圍

將1.3.3節(jié)系列質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200 ng/mL（其中赤霉素、1-萘乙酸質(zhì)量濃度均為100、250、500、1 000、2 000 ng/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.1、1.3.2和1.3.4節(jié)色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以27 種化合物的定量監(jiān)測離子對色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），見表4。結(jié)果表明27 種化合物R2≥0.998 5，在對應(yīng)線性范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將1.3.3節(jié)質(zhì)量濃度為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.1、1.3.2和1.3.4節(jié)色譜條件和質(zhì)譜條件平行測定6 次，各成分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.5%（n＝6），見表4。結(jié)果顯示該方法精密度良好。

2.2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以不含任何化合物的豆芽為基質(zhì)，采用3 個(gè)水平（10、20、100 ng/mL）或（100、200、1 000 ng/mL）添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.4節(jié)方法處理并且進(jìn)行測定，回收率范圍為80.5%～114.9%，回收率良好，見表4。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取2.2.5節(jié)第1個(gè)水平（10 ng/mL或100 ng/mL）的供試品溶液，在配制后分別放置0、4、8、12、24 h，1.3.1、1.3.2和1.3.4節(jié)色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，各成分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～4.6%。結(jié)果顯示供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 與現(xiàn)有推薦方法比較

日常監(jiān)管中，豆芽植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物含量檢測方法主要有3 種。第1種是BJS 201703（2017年第24號公告發(fā)布）推薦的豆芽中11 種植物生長調(diào)節(jié)劑的測定方法，試樣經(jīng)含1%甲酸-乙腈溶液勻漿提取，固相萃取凈化，UPLC-MS/MS上機(jī)；第2種是浙江省市場監(jiān)督管理局制定的《關(guān)于加強(qiáng)生豬產(chǎn)品、豆芽等重點(diǎn)食品農(nóng)產(chǎn)品排查治理工作的緊急通知》附件2中推薦的豆芽中6 種喹諾酮類藥物的測定方法，試樣經(jīng)酸化乙腈提取并濃縮，經(jīng)正己烷液-液萃取凈化后，UPLC-MS/MS上機(jī)；第3種與第2種出自同一文件，為豆芽中甲硝唑的測定方法，試樣勻漿后用乙酸乙酯提取，用混合型陽離子交換柱凈化后，UPLC-MS/MS上機(jī)。

上述3 種方法檢測的化合物共計(jì)18 種，且需進(jìn)行3 次不同的前處理。本方法的試樣直接用乙酸乙酯提取凈化，無需過凈化柱，不僅前處理步驟簡單，并且一次完成對27 種目標(biāo)化合物提取檢測，有效提高了日常檢測的工作效率。

2.4 樣品測定結(jié)果

利用建立的UPLC-MS/MS快速篩查豆芽中27 種植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物法對衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院2018—2019年度的監(jiān)督抽驗(yàn)樣品、委托樣品、豆芽專項(xiàng)整治樣品，共259 批樣品進(jìn)行測定。檢出情況如下：4-氯苯氧乙酸67 批，6-芐基腺嘌呤29 批，赤霉素2 批，恩諾沙星18 批，氧氟沙星1 批，噻苯隆7 批，1-萘乙酸8 批，甲硝唑14 批。其中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、赤霉素與現(xiàn)有的豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定（BJS 201703）方法進(jìn)行比較，恩諾沙星、氧氟沙星、甲硝唑與浙江省市場監(jiān)督管理局制定的《關(guān)于加強(qiáng)生豬產(chǎn)品、豆芽等重點(diǎn)食品農(nóng)產(chǎn)品排查治理工作的緊急通知》附件2進(jìn)行比較，結(jié)果表明，本方法前處理更加簡單，陽性檢出率為100%，漏檢率為0%。實(shí)際樣品測定的結(jié)果見表5。

表5 實(shí)際樣品的檢驗(yàn)結(jié)果Table 5Results of detection of actual samples

3 結(jié) 論

經(jīng)過對大量豆芽進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)豆芽中添加的植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素類藥物比較復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)從相關(guān)文獻(xiàn)[24-30]及實(shí)踐工作經(jīng)驗(yàn)中重新確定并擴(kuò)大了目標(biāo)化合物范圍。除檢出已有推薦標(biāo)準(zhǔn)中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、赤霉素、恩諾沙星、氧氟沙星和甲硝唑等化合物，在259 批豆芽中還檢出了噻苯隆和1-萘乙酸。該方法在15 min內(nèi)完成對27 種目標(biāo)化合物的定性定量，與現(xiàn)有推薦方法相比，本方法更快捷，容量更大，適用范圍更廣，更適合用于豆芽食品中安全風(fēng)險(xiǎn)突發(fā)事件的快速應(yīng)急處置工作。