線粒體損傷和凋亡在魚藤素致16HBE細(xì)胞毒性中的作用*

方瓊彤，呂滿霞，吳新榮

(1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院藥學(xué)部，珠海 519000；2.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010；3.中新國際聯(lián)合研究院，廣州 510700)

魚藤素(deguelin)作為熱休克蛋白90特異性抑制劑[1-2]，可對多種致癌途徑和炎性途徑產(chǎn)生影響，是治療不同惡性腫瘤的潛在活性物質(zhì)。研究表明，魚藤素主要通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B[phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) /protein kinase B (AKT) ，PI3K/AKT]信號通路介導(dǎo)凋亡、周期阻滯和抑制血管生成，對非小細(xì)胞肺癌、胃癌、乳腺癌、淋巴癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤具有顯著抑制活性[3]。CABONI等[4]發(fā)現(xiàn)高濃度魚藤素作用后，大鼠陽性神經(jīng)元酪氨酸羥化酶活性減弱，引發(fā)行為異常，產(chǎn)生類帕金森綜合征；LEE和KIM等[5-7]發(fā)現(xiàn)，魚藤素對神經(jīng)細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞有較明顯毒性。有學(xué)者對魚藤素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，選用神經(jīng)細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞株判斷其結(jié)構(gòu)改造后細(xì)胞毒性，但其中潛在的作用機(jī)制仍未闡明。筆者所在課題組前期對魚藤素神經(jīng)毒性研究較多[8-9]，對魚藤素肺毒性研究較少，因此筆者以人支氣管上皮樣細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，16HBE ) 為研究對象，觀察線粒體和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，測定相關(guān)酶活力、膜電位和凋亡率，初步探究魚藤素致16HBE細(xì)胞毒性的機(jī)制，以期為緩解該藥的毒副作用、將該藥改造為高效低毒的化合物提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 16HBE由中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科提供。

1.2試劑 魚藤素(美國Sigma公司，含量>98%，批號：D0817)、二甲亞砜(DMSO，美國Sigma公司，批號：RNBD6895)；Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：11965-118)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099-141)；羅丹明123(美國Sigma公司，批號：R8004)；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒 (日本同仁化學(xué)研究，批號：CK04)；磷脂酰絲氨酸蛋白V/碘化丙啶 (Annexin V-FITC/PI) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究，批號：C1065-2)；赫斯特33342染料(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：KGA212-1)；線粒體綠色熒光探針(批號：C1048)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)檢測試劑盒(批號：S0056)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(批號：S0101)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器 水套式二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號：3111 )，臺式離心機(jī)(KUBOTA公司，型號：G41054-F000，r=16 cm)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：IX7)，恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號：HWS28)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，型號：Multiscan-GO)，低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司，型號：RRESCO 17，r=3 cm)，流式細(xì)胞儀 (美國 BD 生物科技公司，型號：BD LSRFortessa)，透射電鏡(日本HITACHI公司，型號：H-7650)。

1.4魚藤素的配制 100 mmol·L-1魚藤素母液的配制：將魚藤素50 mg溶于DMSO溶液1.27 mL，置于-20 ℃低溫避光保存。

1.5細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮罐取出16HBE細(xì)胞，37 ℃水浴復(fù)蘇，1 min內(nèi)完成，并在超凈工作臺將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基1 mL，1000 r·min-1離心5 min(r=16 cm) ，去掉上層舊液后加入新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.6細(xì)胞增殖毒性測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照8×108·L-1密度接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞液100 μL，將細(xì)胞分為8組，每組3個復(fù)孔，置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長。次日去除舊培養(yǎng)基，對照組加入不含藥液的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，其他實驗組加入1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μmol·L-1魚藤素各100 μL，作用24 h后加入培養(yǎng)基與細(xì)胞計數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑(9：1)混合液，每孔100 μL，培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定吸光度(A)值。細(xì)胞抑制率(%)=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%。平行3次，計算得細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.7線粒體綠色熒光探針和Hoechst 33342雙染色 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度1.2×108·L-1，每孔接種2 mL，均勻分布。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁。根據(jù)細(xì)胞毒性實驗IC50確定中劑量，并因此推斷出小、大劑量，每組3個復(fù)孔。實驗分為4組：A組為對照組，每個復(fù)孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基2 mL；B組為魚藤素小劑量組，每個復(fù)孔加入15 μmol·L-1魚藤素2 mL；C組為魚藤素中劑量組，每個復(fù)孔加入30 μmol·L-1魚藤素2 mL；D組為魚藤素大劑量組，每個復(fù)孔加入60 μmol·L-1魚藤素2 mL。孵育24 h后，PBS洗滌孔板內(nèi)細(xì)胞2次。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配制1 μmol·L-1線粒體綠色熒光探針染液與細(xì)胞共孵育30 min，常溫PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，吸干后加入PBS配制的1 μmol·L-1Hoechst 33342核染液，與細(xì)胞共孵育10 min，PBS緩沖液洗滌2次，倒置熒光顯微鏡觀察。

1.8線粒體和細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)觀察 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度3×108·L-1，按每皿8 mL接種，均勻分布。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁，設(shè)置A、B、C和D組等干預(yù)組，處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min(r=16 cm)，除去上清液，沿壁緩慢加入2.5%戊二醛，置于4 ℃冰箱固定2 h。用0.1 mol·L-1PBS漂洗20 min，3次，2%鋨酸固定液固定 1.5 h。按透射電鏡實驗要求制作樣品，包埋，聚合，用Leica 熱膨脹式超薄切片機(jī)切片，厚度60 nm。切完的超薄切片放到銅網(wǎng)(乙醇清洗，覆蓋1% Formar膜)上，經(jīng)枸櫞酸鉛雙染色后放入電鏡內(nèi)觀察，在10 000倍下觀察，隨機(jī)攝影記錄細(xì)胞線粒體和細(xì)胞核微觀結(jié)構(gòu)。

1.9GPx與SOD酶活力測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度1.2×108·L-1，每孔2 mL接種，均勻分布。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。實驗分組同“1.7”項，各組干預(yù)24 h后，PBS洗滌2次。取細(xì)胞裂解液100 μL吹打裂解細(xì)胞15～20 min，裂解完畢將裂解液收集于離心管(eppendorf，EP)，12 000 r·min-1離心10 min(r=3 cm)，取上清液，按照SOD與GPx試劑盒操作說明進(jìn)行檢測和計算。

1.10細(xì)胞MMP水平檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度1.2×108·L-1，每孔接種2 mL，均勻分布。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。實驗分組同“1.7”項，24 h后收集細(xì)胞，1000 r·min-1離心5 min(r=3 cm)，去除上清液。無血清培養(yǎng)基配制4 μmol·L-1羅丹明123染液，每個樣品用染液1 mL重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育，每隔5 min振蕩1次，共30 min。1000 r·min-1離心5 min(r=16 cm)后，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測各組樣品熒光強(qiáng)度。

1.11細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度1.2×108·L-1，每孔接種2 mL，均勻分布。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。實驗分組同“1.7”項，24 h后收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min(r=3 cm)，棄去上清液。PBS輕輕洗滌2次，加入4 ℃預(yù)冷的PBS 500 μL重懸細(xì)胞，將細(xì)胞吹勻后轉(zhuǎn)移至2 mL EP管。每組細(xì)胞加Annexin V-FITC溶液和PI溶液各5 μL，吹打混勻，避光孵育15～20 min，隨后轉(zhuǎn)移至流式管，測定細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.116HBE細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞存活率測定結(jié)果見圖1。隨著魚藤素濃度的增加，16HBE細(xì)胞存活率顯著下降。與對照組比較，魚藤素各濃度組細(xì)胞存活率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素作用16HBE細(xì)胞24，48和72 h的IC50分別為(32.95±2.39)，(21.07±2.21)和(15.46±0.93)μmol·L-1。實驗結(jié)果表明，魚藤素對16HBE細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。

①與對照組比較，P<0.05。圖1 不同濃度魚藤素對16HBE細(xì)胞不同時間生長抑制率的影響①Compared with control group，P<0.05.Fig.1 Effects of deguelin at different concentrations on the inhibitory rate of 16HBE cells at different time

2.216HBE細(xì)胞線粒體與核形態(tài) 結(jié)果見圖2。對照組細(xì)胞密集，核外線粒體均勻分布，線粒體綠色熒光明顯；細(xì)胞核均呈淡藍(lán)色，無亮藍(lán)色熒光出現(xiàn)，細(xì)胞核無受損。在各劑量魚藤素組中，隨著魚藤素濃度增加亮藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)，綠色熒光逐漸減少。魚藤素大劑量組細(xì)胞線粒體綠色熒光標(biāo)記非常少，細(xì)胞核出現(xiàn)大部分亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞皺縮。提示在大劑量魚藤素作用下，16HBE細(xì)胞線粒體和細(xì)胞核受損嚴(yán)重。

圖2 4組16HBE細(xì)胞熒光染色圖Fig.2 Fluorescence staining on four groups of 16HBE cells

2.316HBE細(xì)胞線粒體與細(xì)胞核微觀結(jié)構(gòu) 結(jié)果見圖3。對照組細(xì)胞核核仁緊密，魚藤素中劑量組細(xì)胞核異染色體聚集向四周擴(kuò)散，核邊緣出現(xiàn)聚集的異染色體。對照組線粒體嵴完好明顯，呈短棒狀或長棒狀，魚藤素各劑量組細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，空泡化甚至嵴脫落。提示魚藤素對16HBE細(xì)胞的損傷與細(xì)胞核和線粒體形態(tài)改變有關(guān)。

2.416HBE細(xì)胞中MMP水平測定結(jié)果 結(jié)果見圖4。對照組熒光強(qiáng)度57 682±719.1；空白組熒光強(qiáng)度(81±5.70)；15，30，60 μmol·L-1魚藤素組熒光強(qiáng)度分別為(51 593±1 525.4)，(29 427±578.4)和(23 575±1 366.8)。與對照組比較，15，30，60 μmol·L-1魚藤素組細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著下降(P<0.05)，提示魚藤素對16HBE細(xì)胞的損傷可能與膜電位水平下降有關(guān)，且該損傷呈濃度依賴性。

圖 3 2組16HBE細(xì)胞電鏡形態(tài)圖Fig.3 Morphology of two groups of 16HBE cells detected by transmission electron microscope

圖4 5組16HBE細(xì)胞膜電位水平測定結(jié)果Fig 4 Results of MMP in five groups of 16HBE cells

2.516HBE細(xì)胞GPx與SOD酶活力 細(xì)胞中SOD與GPx活力測定結(jié)果見圖5。與對照組比較，魚藤素各劑量組16HBE細(xì)胞內(nèi)SOD和GPx活力下降，且隨著魚藤素濃度增加而下降(P<0.05)。表明魚藤素對16HBE細(xì)胞損傷伴隨著線粒體抗氧化酶系活力減弱。

2.616HBE細(xì)胞凋亡率 Annexin-V FITC/PI 雙染結(jié)果見圖6，細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果見表1。與對照組比較，魚藤素各劑量組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞以及總凋亡細(xì)胞顯著增多(P<0.05)，且隨著魚藤素濃度增加更加明顯。說明魚藤素能誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性。

表1 4組16HBE細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果Tab.1 Results of apoptosis rate in four groups of 16HBE cells

圖6 4組16HBE細(xì)胞Annexin-V FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡圖Fig 6 Apoptosis image of four groups of 16HBE cells detected by Annexin-V FITC/PI

3 討論

大量研究表明，魚藤素具有潛在抗腫瘤活性，但由于其較大的神經(jīng)毒性、肺毒性和眼毒性[5]，阻礙了其成為抗腫瘤藥物。魚藤素對癌前和惡化的支氣管上皮細(xì)胞有著突出的抑制活性，但對正常支氣管上皮細(xì)胞有毒性作用[7]。筆者所見魚藤素所致肺毒性研究較少，其中潛在機(jī)制亦未闡明。筆者選用支氣管上皮細(xì)胞16HBE作為研究對象，通過CCK-8法測定其IC50值從而確定后續(xù)實驗的中劑量組，進(jìn)而設(shè)置不同劑量梯度的魚藤素作用組和對照組作進(jìn)一步研究。

線粒體作為為真核細(xì)胞供能的關(guān)鍵細(xì)胞器，通過參與能量代謝、活性氧(reactive oxygen species，ROS) 產(chǎn)生、鈣穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)和程序性細(xì)胞死亡決定細(xì)胞存活或死亡[10-11]。許多實驗和臨床研究證明，在致病性條件下，心臟、骨骼肌和大腦等組織中線粒體的形態(tài)和數(shù)量發(fā)生明顯變化[12-13]。同時，線粒體損傷還與線粒體的生物合成、基因調(diào)控、膜電位以及相關(guān)抗氧化酶系的活力變化有關(guān)[14-16]。通過對相關(guān)的指標(biāo)測定，可以初步探究細(xì)胞毒性與線粒體損傷的關(guān)系。MMP是最常見反映線粒體通透性的指標(biāo)之一，MMP喪失是細(xì)胞凋亡發(fā)生的必然途徑。筆者在本實驗通過透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體和細(xì)胞核超微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)30 μmol·L-1魚藤素處理后，細(xì)胞線粒體明顯腫脹，嵴丟失和空泡化，細(xì)胞核異染色質(zhì)聚集。線粒體綠色熒光探針和Hoechst 33342雙染色中，隨著魚藤素濃度增高，16HBE細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)亮藍(lán)色程度變大，說明其凋亡更加明顯，線粒體綠色熒光逐漸下降，預(yù)示著活細(xì)胞線粒體減少。筆者還發(fā)現(xiàn)，隨著魚藤素濃度增加，細(xì)胞MMP逐漸下降，凋亡率顯著上升。研究表明，線粒體損傷和細(xì)胞凋亡可能在魚藤素致16HBE細(xì)胞毒性中起重要作用。

線粒體損傷會對機(jī)體氧化應(yīng)激水平作出正向反饋，使得機(jī)體氧化應(yīng)激水平劇增[17]。筆者在本研究測定氧化應(yīng)激相關(guān)酶SOD和GPx。SOD和GPx能夠清除活細(xì)胞內(nèi)過氧化物，測定細(xì)胞中抗氧化酶活力可以了解細(xì)胞損傷情況。研究發(fā)現(xiàn)，魚藤素干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平下降，且隨著魚藤素濃度增加下降更明顯，提示魚藤素使16HBE細(xì)胞抵御外界損傷能力減弱。

線粒體損傷被認(rèn)為是機(jī)體各種病理狀態(tài)發(fā)生的重要因素，細(xì)胞線粒體膜上有豐富的Caspase家族因子、Bax家族因子，以及細(xì)胞色素C等相關(guān)因子，能對外界損傷作出反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-18]。后續(xù)需要在基因和蛋白表達(dá)層面深入探索魚藤素導(dǎo)致16HBE細(xì)胞線粒體損傷的主要介導(dǎo)通路，并嘗試通過基因敲除或者應(yīng)用抑制劑，減輕魚藤素的毒副作用。

綜上所述，魚藤素致16HBE支氣管上皮細(xì)胞毒性機(jī)制可能通過損傷線粒體，使線粒體和細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)異常，降低MMP，降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD和GPx的活力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實驗通過研究線粒體損傷與細(xì)胞毒性相關(guān)性，可為降低魚藤素毒性提供參考。

志謝：本實驗在中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科完成，特別感謝醫(yī)學(xué)實驗科各實驗室老師的指導(dǎo)和幫助！