飛揚腸胃炎膠囊對實驗性胃潰瘍的保護作用及機制研究

周 丹，田 天，李 驊，舒 慶，趙小燕，余承莉，耿 鑫，王四旺

(1.西安市第九醫(yī)院藥劑科，西安 710054；2.空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室，西安 710032)

胃潰瘍(GU)是一種影響患者生活質量的常見胃腸道疾病，發(fā)病率高達10%，現(xiàn)已成為本世紀重要的公共衛(wèi)生負擔[1]。近年來研究表明，檢測核因子NF-E2相關因子(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)介導的抗氧化應激是胃黏膜保護作用的重要信號通路[2-3]。飛揚腸胃炎膠囊是由飛揚草、火炭母及救必應組成的方劑，具有瀉火解毒、除濕止痛之功效，主治細菌性痢疾和急、慢性腸胃炎，臨床應用廣泛，療效確切[4-6]。本研究擬對飛揚腸胃炎膠囊的胃保護作用及其作用機制進行研究，為其臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Eppendorf Certrifuge 5417R型臺式高速冷凍離心機(艾本德生命科技集團公司)；SCILOGEX型賽洛捷克混勻儀(美國賽洛捷克公司)；BioTek酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；OLYMPUS CKX 53型熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；ND 5000型超微量紫外可見分光光度計(無錫百泰克生物技術有限公司)；PB-10型數(shù)字測量儀(賽多利斯儀器系統(tǒng)集團公司)。

1.2試藥 飛揚腸胃炎膠囊(批號20151201)，陜西君碧莎制藥有限公司；蘭索拉唑片(批號19020121)，揚子江藥業(yè)集團股份有限公司；無水乙醇，霍尼韋爾國際集團公司；戊巴比妥鈉，Sigma公司；阿利新藍，北京索萊寶科技有限公司；氯化鎂，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；磷酸鹽緩沖液(PBS)，HyClone公司；4%多聚甲醛，上海尚寶生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒，博士德生物工程有限公司；前列腺素E2(PGE-2)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、硫代巴比妥酸反應物(TBARS)和一氧化氮(NO)試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；谷胱甘肽(GSH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；血紅素加氧酶1 (HO-1)抗體，Proteintech公司；核因子NF-E2相關因子(Nrf2)抗體，Elabscience公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠，碧云天生物技術有限公司。

1.3動物 清潔級雄性健康成年SD大鼠，體質量為180～230 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，生產合格證號：SCXK(軍)字第2012-007號。

2 方法

2.1實驗分組及給藥 將48只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、蘭索拉唑組以及飛揚腸胃炎膠囊低、中和高劑量組，每組8只。正常組和模型組均給予生理鹽水；蘭索拉唑組按照30 mg·kg-1的劑量給予蘭索拉唑；飛揚腸胃炎膠囊低、中和高劑量組分別按照200、400、600 mg·kg-1的劑量給藥；將蘭索拉唑、沒食子酸、飛揚腸胃炎膠囊分別溶于生理鹽水中，每組大鼠均按照10 mL·kg-1灌胃給藥。

2.2大鼠GU模型的建立 各組大鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。造模前，各組大鼠禁食24 h，可自由飲水，保持胃排空狀態(tài)。造模前1 h，正常組和模型組分別給予10 mL·kg-1的生理鹽水，其余各組分別給予相應的藥物。給藥1 h后，除正常組外，其余各組大鼠均給予無水乙醇(5 mL·kg-1)灌胃，建立大鼠GU模型[7]。

2.3樣本采集與處理 各組大鼠用無水乙醇灌胃4 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置1 h后，以4 000 r·min-1離心15 min，取血清，-80 ℃保存，待用。取血后，結扎賁門和幽門，摘下胃部，清洗表面后沿胃大彎剪開，小心收集胃內容物，待用，將胃部在冰上平展開，進行潰瘍指數(shù)(UI)評分。

2.4UI評分 UI評分由對實驗分組情況完全不了解的人員來判定，具體評價標準見表1。保護指數(shù)(PI)的百分比按照公式[8]計算：PI=(模型組UI-給藥組UI)÷模型組UI×100%。

表1 UI評價標準

2.5胃內容物酸度(pH)值測定 將大鼠胃內容物收集在離心管中，以3 000 r·min-1離心10 min，用pH數(shù)字測量儀測定上清液的胃內容物pH值[9]。

2.6胃黏液量(GWM)的測定 GWM按照Corne S J等[10]實驗方法進行測定：取大鼠胃腺體部分，在阿利新藍溶液中浸泡2 h，用0.25 mol·L-1蔗糖沖洗多余的染料，用0.5 mol·L-1氯化鎂溶液提取30 min，提取液中加入二乙醚，振蕩2 min，在580 nm波長處測定各組大鼠的吸光度值。

2.7蛋白含量的測定 取150 mg胃組織浸泡在150 mL PBS中，勻漿，以3 000 r·min-1低溫離心10 min，收集上清液，測定酶活力。勻漿后的組織裂解參照說明書操作，最后用核酸蛋白分析儀測定胃組織勻漿中的蛋白質含量。

2.8氧化酶的活性以及前列腺素E2 (PGE-2)的水平 取2.7項下的組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書測量NO、PGE-2、TBARS、SOD、CAT和GSH的水平。

2.9大鼠胃組織病理學評價和免疫組化分析 取大鼠胃組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm薄片。切片用HE染色后觀察大鼠胃組織病理學形態(tài)。取上述石蠟切片進行免疫組化檢測，過氧化氫室溫孵育10 min后用PBS沖洗，BCA封閉30 min，用稀釋的一抗Nrf2(1∶100)和HO-1(1∶100)4 ℃孵育過夜，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗30 min，SABC顯色。切片使用光學顯微鏡觀察。

2.10數(shù)據(jù)處理及分析 實驗數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism軟件5.01版進行統(tǒng)計分析。GWM、胃內容物pH值、PGE-2、NO、GSH、SOD、TBARS、CAT、Nrf2及HO-1均通過單因素方差分析(One-way ANOVA)對組間的差異進行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。UI采用非參數(shù)秩和Kruskal-Wallis方差分析法分析以及Mann-Whitney U檢驗進行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1飛揚腸胃炎膠囊對乙醇誘發(fā)的GU的保護作用 見表2。由表2可知，與模型組相比，蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組均可明顯降低UI評分,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；蘭索拉唑組以及飛揚腸胃炎低、中和高劑量組的GU抑制率分別為59.13%、23.94%、58.05%、59.72%。

表2 各組UI及GU抑制率的比較

3.2飛揚腸胃炎膠囊對胃內容物pH值及GWM的影響 見表3。由表3可知，與正常組比較，模型組大鼠胃內容物pH值明顯降低(P<0.001)；蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組均能顯著升高大鼠胃內容物pH值(P<0.001)，蘭索拉唑組與飛揚腸胃炎膠囊低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義，而與飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，蘭索拉唑和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預處理均可顯著增加GWM水平(P<0.001)，蘭索拉唑組與飛揚腸胃炎膠囊低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，與飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表3 飛揚腸胃炎膠囊對胃內容物pH值及GWM的影響

3.3飛揚腸胃炎膠囊對PGE-2和NO水平的影響 見表4。由表4可知，與正常組比較，模型組大鼠胃組織中PGE-2和NO水平顯著降低(P<0.001)；蘭索拉唑和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預處理均可顯著增加大鼠胃組織中PGE-2和NO的水平(P<0.001)。在改善PEG-2和NO水平方面，飛揚腸胃炎膠囊低劑量組與蘭索拉唑組之間差異有統(tǒng)計學意義，而飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組與蘭索拉唑組之間差異無統(tǒng)計學意義。

表4 飛揚腸胃炎膠囊對PGE-2和NO的影響

3.4飛揚腸胃炎膠囊對氧化應激的影響 見表5。由表5可知，脂質過氧化物的水平通過檢測TBARS和GSH的水平來表達，抗氧化應激能力通過檢測SOD和CAT的水平來評判。與正常組比較，模型組大鼠胃組織中TBARS的水平明顯升高(P<0.001)，GSH、SOD和CAT水平顯著降低(P<0.001)；蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預處理均可顯著升高胃組織中CAT、SOD和GSH的水平(P<0.05或P<0.001)，降低胃組織中TBARS水平(P<0.05或P<0.001)。且在改善各氧化指標方面，蘭索拉唑組與飛揚腸胃炎膠囊低劑量組之間差異有統(tǒng)計學意義，與飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義。

表5 飛揚腸胃炎膠囊對氧化應激的影響

3.5飛揚腸胃炎膠囊保護大鼠胃組織病理損傷 見圖1。由圖1可知，正常組大鼠胃組織病理學檢查顯示胃黏膜結構完整，上皮和胃腺排列整齊，形狀規(guī)則。與正常組相比，模型組大鼠胃黏膜幾乎所有部位均出現(xiàn)不同程度的變性、壞死和出血，如炎性細胞浸潤、黏膜下水腫、胃小凹脫落等。蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預處理均可顯著減輕胃黏膜炎癥細胞浸潤和黏膜下水腫，減輕胃黏膜病變，保護胃黏膜。蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量均能明顯改善胃黏膜的病理改變，使胃黏膜結構接近正常，且改善程度相當。

圖1 胃組織HE染色

3.6飛揚腸胃炎膠囊對Nrf2和HO-1蛋白表達的影響 見圖2。由圖2可知，蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組均明顯上調了Nrf2和HO-1的蛋白表達。且飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組與蘭索拉唑組改善Nrf2和HO-1蛋白表達的作用相當。

圖2 Nrf2和HO-1蛋白的免疫組化表達 (200×)

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，飛揚腸胃炎膠囊具有明顯的抗GU作用，包括減少GU面積，升高胃內容物pH值，減輕黏膜下水腫和白細胞浸潤。乙醇干擾胃腺的分泌活動，改變細胞的通透性，消耗胃黏液[11]。胃酸分泌是胃黏膜損傷的主要侵襲性因素[12]。飛揚腸胃炎膠囊預處理能夠顯著升高模型組大鼠胃內容物pH值并抑制GWM的減少，提示沒食子酸和飛揚腸胃炎膠囊的胃保護作用可通過調節(jié)胃內容物pH值和GWM來發(fā)揮。

NO和 PGE-2是保護胃黏膜的關鍵介質，NO可保護胃黏膜免受各種有害物質的損傷[13-15]，PGE-2可防止乙醇引起的黏膜壞死和出血[16]，有利于GU愈合[17-18]。在目前的研究中，飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組大鼠胃黏膜中NO和PGE-2水平增加，表明NO和PGE-2可能參與了飛揚腸胃炎膠囊對實驗性GU的保護作用。

氧化應激的發(fā)生通常與活性氧(ROS)的產生相關。正常情況下，這些ROS被GSH、CAT和SOD等重要的內源性抗氧化劑所中和。然而，當氧化應激狀態(tài)發(fā)生時，ROS的產生和積累超過了細胞抗氧化系統(tǒng)或防御系統(tǒng),不能很好地中和這些氧化物[19]。研究表明，氧化應激和內源性抗氧化分子的減少與乙醇誘導的胃黏膜損傷發(fā)病機制有關[14]。丙二醛(MDA)是氧化應激的標志性產物，是不飽和脂肪酸通過ROS激活的脂質過氧化作用產生[20]。因此，MDA被認為是脂質過氧化的生物標志物，被用于量化和鑒定氧化應激[9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，飛揚腸胃炎膠囊可以提高GSH、CAT和SOD的水平，并抑制TBARS的產生，表明飛揚腸胃炎膠囊主要通過抑制氧化應激來對抗乙醇誘導的胃損傷。

Nrf2信號通路可激活內源性抗氧化酶，在保護細胞免受氧化損傷中發(fā)揮關鍵作用[21-22]。在生理條件下，Nrf2與負調控因子Keap1結合，并被定向固定在細胞質中。然而，在氧化應激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1分離，然后易位到細胞核，誘導HO-1的蛋白表達[23]。HO-1又稱熱休克蛋白32(HSP32)，可直接或通過抑制ROS的產生而發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用。而Nrf2/HO-1信號通路亦被證實與胃黏膜損傷的發(fā)生密切相關[2-3]。在本研究中，飛揚腸胃炎膠囊可顯著增加Nrf2的蛋白表達并上調HO-1，提示飛揚腸胃炎膠囊可通過調控Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮胃保護作用。