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    飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的保護(hù)作用及機(jī)制研究

    2021-07-05 08:24:28趙小燕余承莉王四旺
    西北藥學(xué)雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:蘭索拉唑氧化應(yīng)激劑量

    周 丹,田 天,李 驊,舒 慶,趙小燕,余承莉,耿 鑫,王四旺

    (1.西安市第九醫(yī)院藥劑科,西安 710054;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室,西安 710032)

    胃潰瘍(GU)是一種影響患者生活質(zhì)量的常見(jiàn)胃腸道疾病,發(fā)病率高達(dá)10%,現(xiàn)已成為本世紀(jì)重要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[1]。近年來(lái)研究表明,檢測(cè)核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激是胃黏膜保護(hù)作用的重要信號(hào)通路[2-3]。飛揚(yáng)腸胃炎膠囊是由飛揚(yáng)草、火炭母及救必應(yīng)組成的方劑,具有瀉火解毒、除濕止痛之功效,主治細(xì)菌性痢疾和急、慢性腸胃炎,臨床應(yīng)用廣泛,療效確切[4-6]。本研究擬對(duì)飛揚(yáng)腸胃炎膠囊的胃保護(hù)作用及其作用機(jī)制進(jìn)行研究,為其臨床應(yīng)用提供參考。

    1 儀器與材料

    1.1儀器 Eppendorf Certrifuge 5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(艾本德生命科技集團(tuán)公司);SCILOGEX型賽洛捷克混勻儀(美國(guó)賽洛捷克公司);BioTek酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司);OLYMPUS CKX 53型熒光顯微鏡(奧林巴斯公司);ND 5000型超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司);PB-10型數(shù)字測(cè)量?jī)x(賽多利斯儀器系統(tǒng)集團(tuán)公司)。

    1.2試藥 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊(批號(hào)20151201),陜西君碧莎制藥有限公司;蘭索拉唑片(批號(hào)19020121),揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;無(wú)水乙醇,霍尼韋爾國(guó)際集團(tuán)公司;戊巴比妥鈉,Sigma公司;阿利新藍(lán),北京索萊寶科技有限公司;氯化鎂,天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;磷酸鹽緩沖液(PBS),HyClone公司;4%多聚甲醛,上海尚寶生物科技有限公司;SABC免疫組化試劑盒,博士德生物工程有限公司;前列腺素E2(PGE-2)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)和一氧化氮(NO)試劑盒,均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;谷胱甘肽(GSH)試劑盒,南京建成生物工程研究所;血紅素加氧酶1 (HO-1)抗體,Proteintech公司;核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)抗體,Elabscience公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠,碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.3動(dòng)物 清潔級(jí)雄性健康成年SD大鼠,體質(zhì)量為180~230 g,購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(軍)字第2012-007號(hào)。

    2 方法

    2.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、蘭索拉唑組以及飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中和高劑量組,每組8只。正常組和模型組均給予生理鹽水;蘭索拉唑組按照30 mg·kg-1的劑量給予蘭索拉唑;飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中和高劑量組分別按照200、400、600 mg·kg-1的劑量給藥;將蘭索拉唑、沒(méi)食子酸、飛揚(yáng)腸胃炎膠囊分別溶于生理鹽水中,每組大鼠均按照10 mL·kg-1灌胃給藥。

    2.2大鼠GU模型的建立 各組大鼠每日灌胃給藥1次,連續(xù)7 d。造模前,各組大鼠禁食24 h,可自由飲水,保持胃排空狀態(tài)。造模前1 h,正常組和模型組分別給予10 mL·kg-1的生理鹽水,其余各組分別給予相應(yīng)的藥物。給藥1 h后,除正常組外,其余各組大鼠均給予無(wú)水乙醇(5 mL·kg-1)灌胃,建立大鼠GU模型[7]。

    2.3樣本采集與處理 各組大鼠用無(wú)水乙醇灌胃4 h后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動(dòng)脈取血,靜置1 h后,以4 000 r·min-1離心15 min,取血清,-80 ℃保存,待用。取血后,結(jié)扎賁門和幽門,摘下胃部,清洗表面后沿胃大彎剪開(kāi),小心收集胃內(nèi)容物,待用,將胃部在冰上平展開(kāi),進(jìn)行潰瘍指數(shù)(UI)評(píng)分。

    2.4UI評(píng)分 UI評(píng)分由對(duì)實(shí)驗(yàn)分組情況完全不了解的人員來(lái)判定,具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。保護(hù)指數(shù)(PI)的百分比按照公式[8]計(jì)算:PI=(模型組UI-給藥組UI)÷模型組UI×100%。

    表1 UI評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

    2.5胃內(nèi)容物酸度(pH)值測(cè)定 將大鼠胃內(nèi)容物收集在離心管中,以3 000 r·min-1離心10 min,用pH數(shù)字測(cè)量?jī)x測(cè)定上清液的胃內(nèi)容物pH值[9]。

    2.6胃黏液量(GWM)的測(cè)定 GWM按照Corne S J等[10]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定:取大鼠胃腺體部分,在阿利新藍(lán)溶液中浸泡2 h,用0.25 mol·L-1蔗糖沖洗多余的染料,用0.5 mol·L-1氯化鎂溶液提取30 min,提取液中加入二乙醚,振蕩2 min,在580 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組大鼠的吸光度值。

    2.7蛋白含量的測(cè)定 取150 mg胃組織浸泡在150 mL PBS中,勻漿,以3 000 r·min-1低溫離心10 min,收集上清液,測(cè)定酶活力。勻漿后的組織裂解參照說(shuō)明書操作,最后用核酸蛋白分析儀測(cè)定胃組織勻漿中的蛋白質(zhì)含量。

    2.8氧化酶的活性以及前列腺素E2 (PGE-2)的水平 取2.7項(xiàng)下的組織勻漿上清液,按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)量NO、PGE-2、TBARS、SOD、CAT和GSH的水平。

    2.9大鼠胃組織病理學(xué)評(píng)價(jià)和免疫組化分析 取大鼠胃組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm薄片。切片用HE染色后觀察大鼠胃組織病理學(xué)形態(tài)。取上述石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè),過(guò)氧化氫室溫孵育10 min后用PBS沖洗,BCA封閉30 min,用稀釋的一抗Nrf2(1∶100)和HO-1(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜,室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗30 min,SABC顯色。切片使用光學(xué)顯微鏡觀察。

    2.10數(shù)據(jù)處理及分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism軟件5.01版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。GWM、胃內(nèi)容物pH值、PGE-2、NO、GSH、SOD、TBARS、CAT、Nrf2及HO-1均通過(guò)單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)組間的差異進(jìn)行比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UI采用非參數(shù)秩和Kruskal-Wallis方差分析法分析以及Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)乙醇誘發(fā)的GU的保護(hù)作用 見(jiàn)表2。由表2可知,與模型組相比,蘭索拉唑組和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量組均可明顯降低UI評(píng)分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);蘭索拉唑組以及飛揚(yáng)腸胃炎低、中和高劑量組的GU抑制率分別為59.13%、23.94%、58.05%、59.72%。

    表2 各組UI及GU抑制率的比較

    3.2飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)胃內(nèi)容物pH值及GWM的影響 見(jiàn)表3。由表3可知,與正常組比較,模型組大鼠胃內(nèi)容物pH值明顯降低(P<0.001);蘭索拉唑組和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組均能顯著升高大鼠胃內(nèi)容物pH值(P<0.001),蘭索拉唑組與飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較,蘭索拉唑和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著增加GWM水平(P<0.001),蘭索拉唑組與飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),與飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表3 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)胃內(nèi)容物pH值及GWM的影響

    3.3飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)PGE-2和NO水平的影響 見(jiàn)表4。由表4可知,與正常組比較,模型組大鼠胃組織中PGE-2和NO水平顯著降低(P<0.001);蘭索拉唑和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著增加大鼠胃組織中PGE-2和NO的水平(P<0.001)。在改善PEG-2和NO水平方面,飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低劑量組與蘭索拉唑組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量組與蘭索拉唑組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表4 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)PGE-2和NO的影響

    3.4飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)氧化應(yīng)激的影響 見(jiàn)表5。由表5可知,脂質(zhì)過(guò)氧化物的水平通過(guò)檢測(cè)TBARS和GSH的水平來(lái)表達(dá),抗氧化應(yīng)激能力通過(guò)檢測(cè)SOD和CAT的水平來(lái)評(píng)判。與正常組比較,模型組大鼠胃組織中TBARS的水平明顯升高(P<0.001),GSH、SOD和CAT水平顯著降低(P<0.001);蘭索拉唑組和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著升高胃組織中CAT、SOD和GSH的水平(P<0.05或P<0.001),降低胃組織中TBARS水平(P<0.05或P<0.001)。且在改善各氧化指標(biāo)方面,蘭索拉唑組與飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表5 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)氧化應(yīng)激的影響

    3.5飛揚(yáng)腸胃炎膠囊保護(hù)大鼠胃組織病理?yè)p傷 見(jiàn)圖1。由圖1可知,正常組大鼠胃組織病理學(xué)檢查顯示胃黏膜結(jié)構(gòu)完整,上皮和胃腺排列整齊,形狀規(guī)則。與正常組相比,模型組大鼠胃黏膜幾乎所有部位均出現(xiàn)不同程度的變性、壞死和出血,如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜下水腫、胃小凹脫落等。蘭索拉唑組和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著減輕胃黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜下水腫,減輕胃黏膜病變,保護(hù)胃黏膜。蘭索拉唑組和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量均能明顯改善胃黏膜的病理改變,使胃黏膜結(jié)構(gòu)接近正常,且改善程度相當(dāng)。

    圖1 胃組織HE染色

    3.6飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖2。由圖2可知,蘭索拉唑組和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組均明顯上調(diào)了Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)。且飛揚(yáng)腸胃炎膠囊中、高劑量組與蘭索拉唑組改善Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的作用相當(dāng)。

    圖2 Nrf2和HO-1蛋白的免疫組化表達(dá) (200×)

    4 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),飛揚(yáng)腸胃炎膠囊具有明顯的抗GU作用,包括減少GU面積,升高胃內(nèi)容物pH值,減輕黏膜下水腫和白細(xì)胞浸潤(rùn)。乙醇干擾胃腺的分泌活動(dòng),改變細(xì)胞的通透性,消耗胃黏液[11]。胃酸分泌是胃黏膜損傷的主要侵襲性因素[12]。飛揚(yáng)腸胃炎膠囊預(yù)處理能夠顯著升高模型組大鼠胃內(nèi)容物pH值并抑制GWM的減少,提示沒(méi)食子酸和飛揚(yáng)腸胃炎膠囊的胃保護(hù)作用可通過(guò)調(diào)節(jié)胃內(nèi)容物pH值和GWM來(lái)發(fā)揮。

    NO和 PGE-2是保護(hù)胃黏膜的關(guān)鍵介質(zhì),NO可保護(hù)胃黏膜免受各種有害物質(zhì)的損傷[13-15],PGE-2可防止乙醇引起的黏膜壞死和出血[16],有利于GU愈合[17-18]。在目前的研究中,飛揚(yáng)腸胃炎膠囊低、中、高劑量組大鼠胃黏膜中NO和PGE-2水平增加,表明NO和PGE-2可能參與了飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性GU的保護(hù)作用。

    氧化應(yīng)激的發(fā)生通常與活性氧(ROS)的產(chǎn)生相關(guān)。正常情況下,這些ROS被GSH、CAT和SOD等重要的內(nèi)源性抗氧化劑所中和。然而,當(dāng)氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生時(shí),ROS的產(chǎn)生和積累超過(guò)了細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)或防御系統(tǒng),不能很好地中和這些氧化物[19]。研究表明,氧化應(yīng)激和內(nèi)源性抗氧化分子的減少與乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷發(fā)病機(jī)制有關(guān)[14]。丙二醛(MDA)是氧化應(yīng)激的標(biāo)志性產(chǎn)物,是不飽和脂肪酸通過(guò)ROS激活的脂質(zhì)過(guò)氧化作用產(chǎn)生[20]。因此,MDA被認(rèn)為是脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標(biāo)志物,被用于量化和鑒定氧化應(yīng)激[9]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),飛揚(yáng)腸胃炎膠囊可以提高GSH、CAT和SOD的水平,并抑制TBARS的產(chǎn)生,表明飛揚(yáng)腸胃炎膠囊主要通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)對(duì)抗乙醇誘導(dǎo)的胃損傷。

    Nrf2信號(hào)通路可激活內(nèi)源性抗氧化酶,在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21-22]。在生理?xiàng)l件下,Nrf2與負(fù)調(diào)控因子Keap1結(jié)合,并被定向固定在細(xì)胞質(zhì)中。然而,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2與Keap1分離,然后易位到細(xì)胞核,誘導(dǎo)HO-1的蛋白表達(dá)[23]。HO-1又稱熱休克蛋白32(HSP32),可直接或通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用。而Nrf2/HO-1信號(hào)通路亦被證實(shí)與胃黏膜損傷的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。在本研究中,飛揚(yáng)腸胃炎膠囊可顯著增加Nrf2的蛋白表達(dá)并上調(diào)HO-1,提示飛揚(yáng)腸胃炎膠囊可通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮胃保護(hù)作用。

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