高效液相色譜法測定格列齊特平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)

唐秀秀，褚信信，王莉麗，謝子立*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 30038；.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，合肥3005）

格列齊特是第二代磺脲類口服降糖藥，用于治療2型糖尿病，它通過刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素發(fā)揮作用，耐受性好，很少引起低血糖，此外，它還有減緩糖尿病性視網(wǎng)膜病變的潛力，是長期治療非胰島素依賴型糖尿病的首選藥[1-3]，被列入WHO基本藥物清單中[4]。藥物的理化參數(shù)與其在生物體內(nèi)膜通透性有很大相關(guān)性，平衡溶解度及油水分配系數(shù)作為藥物理化參數(shù)兩個不可或缺的指標(biāo)，對于預(yù)測藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄有很大幫助[5]。格列齊特原料及制劑的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別收載在《中國藥典》2015年版二部以及局頒標(biāo)準(zhǔn)，其含量測定分別采用電位滴定法和HPLC法[6]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)涉及的HPLC法中流動相基本采用三氟乙酸，流動相的pH值較低約為2，長期使用易造成色譜柱的損壞。本文通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，建立了色譜條件溫和的HPLC法用于格列齊特的含量測定，通過方法學(xué)考察均符合要求，結(jié)果顯示本次建立的HPLC法適用于格列齊特的含量測定。在此基礎(chǔ)上，采用搖瓶法[9-11]測定格列齊特在水及不同pH的磷酸鹽緩沖溶液與pH 1.2的鹽酸溶液中的平衡溶解度和正辛醇-水/不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中表觀油水分配系數(shù)，為格列齊特制劑研究、處方設(shè)計(jì)、仿制藥一致性評價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AD系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；AG-135電子天平、SevenExcellence S400 pH計(jì)（Mettler Toledo公司）；HC-3018R 離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；SHY-2A 水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

格列齊特對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100269-201906，純度：99.9%）；格列齊特原料（批號：P011-2001015，山東科源制藥有限公司，純度大于99%）。乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；無水甲酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；醋酸銨、正辛醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

采用Unitary C8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02 mol·L－1醋酸銨溶液（甲酸調(diào)pH至3.5）（45∶55）為流動相，柱溫35℃，檢測波長235 nm，流速1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量20 μL。在此色譜條件下進(jìn)行分析，并記錄色譜圖。色譜圖見圖1，格列齊特保留時間為14 min，峰形良好，空白溶劑對測定無干擾。

圖1 格列齊特高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of gliclazide

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取格列齊特對照品15.65 mg，置50 mL量瓶，加乙腈22.5 mL超聲溶解，用水稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取上述儲備液5 mL置25 mL量瓶中，用乙腈-水（45∶55）稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 不同pH溶液的制備 按《中國藥典》2015年版四部緩沖液的配制方法[12]，分別配制pH為4.5，6.8，7.4的磷酸鹽緩沖溶液。另稱取氫氧化鈉2 g，加磷酸二氫鉀6.8 g置于1000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，配成pH為8.6的磷酸鹽緩沖溶液；稱取氯化鈉2.0 g，置于1000 mL量瓶中，加入濃鹽酸7 mL，加水溶解并稀釋至刻度，配成pH為1.2的鹽酸溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品儲備液2、3、4、5 mL分別置25 mL量瓶中，分別用乙腈-水（45∶55）稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①②③④。精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品儲備液4、6 mL分別置10 mL量瓶中，分別用乙腈-水（45∶55）稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液⑤⑥。精密量取上述①～⑥溶液各20 μL，注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，以格列齊特峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得格列齊特的回歸方程為A＝4.06×107C－1.29×105（r＝0.9996），結(jié)果表明格列齊特在0.025 01～0.187 61 mg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 檢測限與定量限 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品儲備液，用乙腈-水（45∶55）逐級稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以S/N＝3確定檢測限，以S/N＝10確定定量限。結(jié)果顯示格列齊特的檢測限和定量限分別為0.18 μg·mL－1和0.61 μg·mL－1。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取格列齊特對照品溶液 20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定 6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算峰面積RSD為0.18%（n＝6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 平行稱取格列齊特原料藥6份，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，格列齊特含量RSD為0.96%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 平行稱取格列齊特原料藥6份，精密稱定，分別加入水、“2.2.2”項(xiàng)下pH值分別為4.5、6.8、7.4、8.6的磷酸鹽緩沖溶液、pH 1.2的鹽酸溶液和乙腈-水（45∶55）溶液，配制質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL－1的供試品溶液。分別精密吸取上述溶液及“2.2.1”項(xiàng)下的對照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積計(jì)算得到RSD分別為1.7%、1.3%、0.55%、0.95%、0.38%、15.4%及0.35%。結(jié)果表明格列齊特在水、4種磷酸鹽緩沖溶液介質(zhì)及乙腈-水（45∶55）溶液中72 h內(nèi)較穩(wěn)定；在pH為1.2的鹽酸溶液中72 h不穩(wěn)定，在4 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD小于2.0%。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的格列齊特原料藥7.5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，共9份，平均分為3組，分別加入格列齊特對照品6.0、7.5、9.0 mg，精密稱定，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，格列齊特低、中、高水平回收率分別為99.9%、98.5%、98.2%，RSD分別為0.84%、1.0%、0.17%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 格列齊特平衡溶解度的測定

2.4.1 轉(zhuǎn)速與振搖時間考察 將恒溫水浴的轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為50、100和200 r·min－1，選擇pH為4.5和8.6兩種磷酸鹽緩沖溶液在（37±0.5）℃條件下振搖72 h，0.45 μm濾膜濾過，吸取續(xù)濾液（或稀釋后），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見表1。由表1可知，在pH為4.5的磷酸鹽緩沖溶液中，轉(zhuǎn)速的改變對格列齊特的溶解度沒有明顯的影響；在pH為8.6的磷酸鹽緩沖溶液中，恒溫水浴轉(zhuǎn)速為50和100 r·min－1時，格列齊特溶解度24 h才達(dá)平衡，恒溫水浴轉(zhuǎn)速為200 r·min－1時，格列齊特溶解度在2 h達(dá)到平衡。因此，為了使樣品能夠充分溶解確保測得的平衡溶解度準(zhǔn)確、有效，本研究最終確定格列齊特的平衡溶解度測定轉(zhuǎn)速及振搖時間分別為200 r·min－1、24 h。

表1 平衡溶解度轉(zhuǎn)速和振搖時間的考察(n＝3，mg·mL－1)Tab 1 Equilibrium solubility speed and shaking time(n＝3，mg·mL－1)

2.4.2 平衡溶解度的測定 量取水及“2.2.2”項(xiàng)下配制的不同pH緩沖溶液各50 mL，分別置于100 mL碘量瓶中，加入過量的格列齊特原料藥粉末至溶液中出現(xiàn)大量不溶性沉淀，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖 24 h，0.45 μm濾膜濾過。吸取續(xù)濾液（或稀釋后），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算格列齊特在水及不同介質(zhì)中的平衡溶解度，結(jié)果見表2。

表2 格列齊特的平衡溶解度計(jì)算結(jié)果(n＝3)Tab 2 Equilibrium solubility of gliclazide (n＝3)

2.5 格列齊特表觀油水分配系數(shù)的測定

吸取正辛醇溶液適量，分別與同體積水及pH為4.5、6.8、7.4、8.6的磷酸鹽緩沖溶液混合，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖24 h，分取上層和下層，即得水及不同pH磷酸鹽緩沖溶液飽和的正辛醇、正辛醇飽和的水及不同pH的磷酸鹽緩沖溶液。

分別吸取水及不同pH磷酸鹽緩沖溶液飽和的正辛醇20 mL，置50 mL的離心管中，加入過量的格列齊特原料藥粉末至溶液中出現(xiàn)大量不溶性白色沉淀，置恒溫水浴振蕩器中，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖 24 h，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為相應(yīng)的儲備溶液；分別精密量取上述溶液適量，用甲醇準(zhǔn)確稀釋50 倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算格列齊特初始濃度C0。

分別精密量取上述儲備溶液各10 mL，置50 mL的離心管中，分別加入10 mL正辛醇飽和的水及pH為4.5、6.8、7.4、8.6的磷酸鹽緩沖溶液，將離心管置于水浴恒溫振蕩器中，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖 24 h，離心（12 000 r·min－1，10 min），用注射器吸取水層，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，吸取續(xù)濾液（或稀釋后），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算格列齊特質(zhì)量濃度CW。根據(jù)公式P＝（C0－CW）/CW計(jì)算表觀油水分配系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 格列齊特表觀油水分配系數(shù)計(jì)算結(jié)果(n＝3)Tab 3 Apparent oil-water partition coefficient of gliclazide (n＝3)

3 討論

3.1 流動相的選擇

《中國藥典》2015年版二部收載的格列齊特、格列齊特片（Ⅱ）含量測定方法分別為電位滴定法和HPLC法，后者流動相中的三氟乙酸對色譜柱損傷較大，耐用性較差且不適用于后期質(zhì)譜方法研究。本研究考察了0.01、0.02、0.05 mol·L－1醋酸銨溶液對格列齊特峰形的影響，醋酸銨溶液濃度在0.01 mol·L－1時，格列齊特峰對稱性及拖尾因子均達(dá)不到要求，0.02、0.05 mol·L－1醋酸銨溶液雖都能達(dá)到要求，但0.05 mol·L－1醋酸銨溶液調(diào)至pH 3.5所需酸量較多，因此最終將醋酸銨溶液濃度定為0.02 mol·L－1?？疾炝鲃酉嗟呐浔葘Τ龇鍟r間、分離度的影響，乙腈量減少，保留時間延長，45%的乙腈配比時分離度能達(dá)到要求且格列齊特峰保留時間較為合適。另考察冰醋酸和甲酸調(diào)節(jié)醋酸銨溶液以及不同pH值對出峰的影響，由于在調(diào)節(jié)pH時冰醋酸用量較大，采用甲酸調(diào)節(jié)較為合適且在pH 3.5時格列齊特峰的分離度、理論塔板數(shù)、對稱性均能達(dá)到要求。比較了《中國藥典》與本研究建立的HPLC法的靈敏度，發(fā)現(xiàn)本次研究所建立的色譜方法靈敏度約為《中國藥典》色譜方法的5.5倍，所建立的色譜方法既能滿足測定要求，又有其獨(dú)特的優(yōu)勢，為今后該類色譜條件的選擇、優(yōu)化提供了思路。

3.2 平衡溶解度

溶解度是影響生物利用度最重要的性質(zhì)之一，也是確立生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)之一[13]。藥物的平衡溶解度是指在一定溫度（氣體在一定壓力）下，在一定量溶劑中達(dá)飽和時溶解的最大藥量，是反映藥物溶解性的重要指標(biāo)[14]。本研究采用經(jīng)典的搖瓶法對格列齊特在水及不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中的平衡溶解度進(jìn)行測定，結(jié)果表明格列齊特在水及不同pH緩沖溶液中溶解度按照《中國藥典》表示方法分別為不溶、極微溶解和微溶且平衡溶解度隨著介質(zhì)pH值的增大而增加。由穩(wěn)定性試驗(yàn)可知，格列齊特在pH 1.2鹽酸溶液中不穩(wěn)定，因此在制劑開發(fā)過程應(yīng)避免酸性輔料或因相互作用產(chǎn)生酸性物質(zhì)的輔料的加入。

3.3 表觀油水分配系數(shù)

體外測定油水分配系數(shù)是為了模擬生物體內(nèi)藥物在水相和生物相之間的分配情況，從而預(yù)測其在腸道中的吸收情況[15]。生物膜整體的溶解度參數(shù)＆＝（21.07±0.82）（J·cm－3）1/2，與正辛醇的溶解度參數(shù)接近，因此通過測定正辛醇與水的分配系數(shù)來預(yù)測藥物的吸收[16]。lgP對于藥物在胃腸道吸收速度和程度有很大影響，P值過低（lgP＜－2），化合物不能穿過脂質(zhì)膜；P值過高（lgP＞3），化合物因脂溶性強(qiáng)而難以進(jìn)入血管或淋巴管。藥物的最佳 lgP值為：－1.0＜lgP＜2.0，在該lgP值范圍內(nèi)的化合物脂溶性和水溶性適中，具有較好生物膜滲透性，易透過細(xì)胞膜吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。由本試驗(yàn)所測得數(shù)據(jù)可知不同pH介質(zhì)對格列齊特表觀油水分配系數(shù)有一定的影響，格列齊特在水及不同pH值磷酸鹽緩沖溶液的lgP值均在0.06～2.00，多個pH介質(zhì)測定結(jié)果表明格列齊特具有好的滲透性，提示其在胃腸道具有很好的分布與吸收。通過對格列齊特表觀油水分配系數(shù)的研究為其制備工藝和處方設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。