基于腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)的中藥降尿酸活性成分篩選及評(píng)價(jià)

鄒麗娜 王雨 姜卓希 巨珊珊 張冰 林志健 楊婷

摘要 目的：基于腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，篩選及評(píng)價(jià)中藥降尿酸活性成分，為闡釋中藥降尿酸物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論和技術(shù)支撐。方法：以不同灌注壓力進(jìn)行大鼠離體腎臟灌流，通過腎小球?yàn)V過率、尿流率、葡萄糖重吸收率、鈉離子重吸收率、鉀離子重吸收率等評(píng)價(jià)腎功能，建立離體腎臟模型;設(shè)置尿酸組、菊苣酸組和丙磺舒組進(jìn)行離體腎臟灌流，觀察腎臟尿酸排泄情況，以菊苣酸示例應(yīng)用離體腎臟灌流模型;設(shè)置對(duì)照組、尿酸組、苯溴馬隆組、丙磺舒組及菊苣酸組，通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)高尿酸狀態(tài)下HKC細(xì)胞GLUT9蛋白表達(dá)變化，及高尿酸狀態(tài)下菊苣酸干預(yù)后的表達(dá)變化，結(jié)合離體腎臟灌流技術(shù)評(píng)價(jià)降尿酸活性成分。結(jié)果：在120 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）灌注壓力下離體腎功能良好;菊苣酸在20～40 min、40～60 min均能提高腎臟清除率，增加腎臟尿酸排泄分?jǐn)?shù);且菊苣酸能夠顯著抑制高尿酸狀態(tài)下HKC細(xì)胞的GLUT9蛋白表達(dá)。結(jié)論：該研究基于腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，應(yīng)用離體腎臟灌流技術(shù)結(jié)合體外HKC細(xì)胞篩選并評(píng)價(jià)中藥降尿酸活性成分，篩選出菊苣酸可能是菊苣通過促進(jìn)尿酸排泄發(fā)揮降尿酸作用的活性成分，為抗高尿酸血癥藥物的研發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以更好服務(wù)于臨床。

關(guān)鍵詞 降尿酸;活性成分;離體腎臟灌流;HKC;篩選及評(píng)價(jià)

Screening and Evaluation of Active Ingredients of Traditional Chinese Medicine For Lowering Uric Acid Based on Renal Uric Acid Transport：a Case Study of Cichoric Acid

ZOU Lina，WANG Yu，JIANG Zhuoxi，JU Shanshan，ZHANG Bing，LIN Zhijian，YANG Ting

（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China）

Abstract Objective：Based on the kidney uric acid transport link，to screen and evaluate the active ingredients of traditional Chinese medicine for lowering uric acid，providing theoretical and technical support for the interpretation of the material basis of traditional Chinese medicine（TCM）for lowering uric acid.Methods：The isolated rat kidneys was perfused with different perfusion pressures.The renal function was evaluated by glomerular filtration rate，urine flow rate，glucose reabsorption rate，sodium ion reabsorption rate，potassium ion reabsorption rate，etc.，and the isolated kidney model was established.The uric acid group，the cichoric acid group and the probenecid group for isolated kidney perfusion were set，the renal uric acid excretion was observed.Western blotting was used to detect the changes in the expression of GLUT9 protein in HKC cells under high uric acid conditions and the changes in the expression of cichoric acid intervention under high uric acid conditions，and to evaluate the uric acid-lowering active ingredients combined with isolated kidney perfusion technology.Results：The isolated kidney function was good under 120 mm Hg perfusion pressure; cichoric acid can improve renal clearance and increase renal uric acid excretion at 20-40 min and 40-60 min; cichoric acid can increase renal uric acid excretion fraction; and cichoric acid can significantly inhibit the expression of GLUT9 protein in the state of high uric acid.Conclusion：The study is based on the transport of uric acid in the kidney.By applying isolated kidney perfusion technology combined with in vitro HKC cells，the active ingredients of TCM for lowering uric acid are screened and evaluated.Cichoric acid screened out may be the active ingredient of chicory to lower uric acid by promoting uric acid excretion，laying an experimental foundation for the research and development of anti-hyperuricemia drugs，and providing experimental evidence for the development and clinical application of traditional Chinese medicine to better serve clinical practices.

Keywords Lowering uric acid; Active ingredient; Isolated kidney perfusion; HKC; Screening and evaluation

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.005

臨床研究結(jié)果顯示，90%左右的原發(fā)性高尿酸血癥屬于尿酸排泄不良型[1]。尿酸是機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝的產(chǎn)物，其中2/3以尿液的形式經(jīng)腎臟排出體外，1/3以糞便的形式經(jīng)腸道排泄。腎臟作為對(duì)尿酸排泄貢獻(xiàn)較大的器官，受到人們的廣泛研究，目前，研究藥物降尿酸的作用機(jī)制多以腎臟作為靶器官。

離體腎臟灌流（Isolated Perfused Kidney，IPK）技術(shù)是將動(dòng)物腎臟從活體中分離出來，通過體外灌注灌流液，在不受體液、激素或神經(jīng)系統(tǒng)的情況下，特異性地對(duì)腎臟的生理活性和生化功能進(jìn)行研究的一種方法。多年來，該技術(shù)已被用于闡明藥物對(duì)腎臟的影響[2-5]、腎毒性[6]及藥物作用特點(diǎn)及機(jī)制[8-11]等方面。

我國(guó)使用中藥治療高尿酸血癥歷史悠久，中藥治療高尿酸血癥具有獨(dú)特的臨床優(yōu)勢(shì)，但中藥治療高尿酸血癥的活性成分有待明確，如何從中藥或中藥復(fù)方中篩選降尿酸活性成分？目前，降尿酸活性成分篩選多以XOD為靶點(diǎn)，腎臟作為對(duì)尿酸排泄貢獻(xiàn)最大的器官，以腎臟為靶器官的降尿酸活性成分篩選模式尚沒有建立，故該研究將依據(jù)高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制，應(yīng)用離體灌流技術(shù)結(jié)合HKC細(xì)胞初步篩選和評(píng)價(jià)中藥降尿酸活性成分，為闡釋中藥降尿酸物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（450±10）g，購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)條件：室溫（23±1）℃，濕度（45±5）%，12 h光照/12 h黑暗節(jié)律飼養(yǎng)。動(dòng)物倫理號(hào)：BUCM-4-2019090301-3032。

HKC細(xì)胞株購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)用20-30代。培養(yǎng)基組成：含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素工作液的DMEM/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：在37 ℃，5%CO2，95%濕度條件下培養(yǎng)于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.1.2 藥物

菊苣酸（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：N0517AS）;丙磺舒（源葉生物，批號(hào)：R09O8X45213）;苯溴馬?。ㄔ慈~生物，批號(hào)：S20O6X4571）

1.1.3 試劑與儀器

試劑：Krebs-Henseleleit Buffer Modified（Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：SLCC3728）;菊粉（Bioruler，批號(hào)：r6001）;尿酸（Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：BCBR0860V）牛血清白蛋白V（北京百瑞極生物科技有限公司，批號(hào)：20201008）;肝素鈉（北京百瑞極生物科技有限公司，批號(hào)：20200601）;甘露醇（索萊寶有限公司，批號(hào)：717X036）;生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：2008012003）;蒽酮（Solarbio，批號(hào)：107R021）;葡萄糖試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A154-1-1）;鈉離子試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C002-1-1）;鉀離子試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C001-2-1）;尿酸試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：190691）;甘氨酸（北京百瑞極生物科技有限公司，批號(hào)：20200721）;Tris（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20C1956715）;SDS（Bioruler，批號(hào)：r471903）;甲醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20200801）;超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore，美國(guó)，批號(hào)：1925901）;1M Tris-HCl緩沖液（索萊寶有限公司，批號(hào)：20200908）;1.5M Tris-HCl緩沖液（索萊寶有限公司，批號(hào)：20200925）;20×TBST（索萊寶有限公司，批號(hào)：20200910）;GAPDH Mouse Monoclonal antibody（Proteintech，美國(guó)，批號(hào)：60004-1-lg）;SLC2A9（Proteintech，美國(guó)，批號(hào)：26486-1-AP）;HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（Proteintech，美國(guó)，批號(hào)：SA00001-1）;HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Proteintech，美國(guó)，批號(hào)：SA00001-2）;青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Corning公司，美國(guó)，批號(hào)：30002341）;0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：2186976）;PBS（Corning公司，美國(guó)，批號(hào)：05720003）;CCK-8試劑盒（北京百瑞極生物科技有限公司，批號(hào)：DCM7126）;DMSO（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200405）

儀器：蠕動(dòng)泵（蘭格恒流泵有限公司，型號(hào)：DG-4-A型）;恒溫水浴箱（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，型號(hào)：LKTC-B1-T型）;Sunrise酶標(biāo)儀（瑞士Teacan公司，瑞士，型號(hào)：SUNRISE型）;低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司，德國(guó)，型號(hào)：3K15型）;全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號(hào)：MiniChemi500型）;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：3111型）

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

離體腎臟灌流模型制備：選擇Krebs-Henseleit液為基礎(chǔ)液，其組成（mmol/L）為：NaCl 118.0、KCl 4.7、CaCl21.28、MgSO4 2.34、KH2PO4 1.2、NaHCO3 25、葡萄糖5.55 g。另外加入0.2%牛血清白蛋白V和0.153%復(fù)方氨基酸注射液（18AA，臨用前加入），充分溶解。加入0.2 g/L菊粉，用以測(cè)定腎小球?yàn)V過率。用0.45 μm孔徑濾膜過濾，調(diào)pH至7.2～7.4之間，置于37 ℃恒溫浴槽內(nèi)。選擇（450±10）g體質(zhì)量范圍的SD大鼠，腹腔注射水合氯醛（10%）麻醉，麻醉誘導(dǎo)后，在膀胱上方作中線切口，延伸至胸骨。確定主要的解剖點(diǎn)：包括右腎、右輸尿管、腸系膜上動(dòng)脈和腎動(dòng)脈。先后分離出右側(cè)輸尿管，暴露主動(dòng)脈腎段，分離腸系膜上動(dòng)脈，最后分離腎動(dòng)脈、腎靜脈。右下肢靜脈注射肝素（500 U/kg）使全身肝素化。10 min后，腎動(dòng)脈插管后結(jié)扎固定，立即泵入37 ℃預(yù)溫的灌流液，緊接著腎靜脈插管后結(jié)扎固定，腎臟、動(dòng)脈插入管、靜脈插入管和灌流泵儀器形成一個(gè)循環(huán)系統(tǒng)。借輸尿管充盈插管及結(jié)扎固定，管的另一末端收集尿液。最后，整個(gè)左側(cè)腎臟、左腎動(dòng)脈、左腎靜脈及左側(cè)輸尿管從腹腔內(nèi)一同摘離，修剪掉腎臟周圍組織，并用預(yù)溫至37 ℃的生理鹽水沖洗腹腔流體放入盛有37 ℃灌流液的恒溫浴槽內(nèi)，繼續(xù)灌流。

分組：分別以80、100、120 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）壓力對(duì)離體腎臟進(jìn)行灌注，灌流液沖洗腎臟10 min，平衡10 min后隔20 min收集1次尿液，每次尿液采集間隔的中點(diǎn)采集灌流液樣本，灌注實(shí)驗(yàn)完成后，應(yīng)將腎臟吸干、稱重。

1.2.2 給藥方法

菊苣酸對(duì)離體腎臟尿酸排泄的影響：制備離體腎臟灌流模型，設(shè)置尿酸組（300 μmol/L）、丙磺舒組（1 mmol/L）、菊苣酸組（3 mmol/L），灌流液沖洗腎臟10 min，平衡10 min后隔20 min收集1次尿液，每次尿液采集間隔的中點(diǎn)采集灌流液樣本，灌注實(shí)驗(yàn)完成后，應(yīng)將腎臟吸干、稱重。

菊苣酸對(duì)HKC細(xì)胞GLUT9表達(dá)影響：設(shè)置對(duì)照組（0.1%DMSO）、尿酸組（400 μmol/L）、苯溴馬隆組（50 μmol/L）、丙磺舒組（50 μmol/L）及菊苣酸組（400 μmol/L），每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

腎功能參數(shù)檢測(cè)指標(biāo)：以蒽酮比色法測(cè)定菊粉含量以計(jì)算腎小球?yàn)V過率，用鈉測(cè)試盒檢測(cè)鈉離子含量，用鉀測(cè)試盒檢測(cè)鉀離子含量，葡萄糖測(cè)試盒檢測(cè)葡萄糖含量。（腎小球?yàn)V過率=尿液中菊粉濃度/灌流液中菊粉濃度×尿量;葡萄糖重吸收率=1-尿液中葡萄糖/灌流液中葡萄糖×尿流率/腎小球?yàn)V過率;鈉離子重吸收率=1-尿液中鈉離子濃度/灌流液中鈉離子濃度×尿流率/腎小球?yàn)V過率;鉀離子重吸收率=1-尿液中鉀離子濃度/灌流液中鉀離子濃度×尿流率/腎小球?yàn)V過率）

尿酸排泄檢測(cè)指標(biāo)：尿酸試劑盒檢測(cè)尿酸含量，計(jì)算尿酸清除率和尿酸排泄分?jǐn)?shù)。（尿酸清除率=尿液中尿酸含量/灌流液中尿酸含量×尿流率;尿酸排泄分?jǐn)?shù)=（尿液中尿酸濃度/灌流液中尿酸濃度）/（尿液中菊粉濃度/灌流液中菊粉濃度）×100%）

提取細(xì)胞總蛋白，Western-blot法檢測(cè)GLUT9/OAT1蛋白的表達(dá)水平。1）SDS-PAGE膠制備：制備10%分離膠和5%濃縮膠待分離膠聚合完全后，傾倒去上層水，濾紙吸干，將上述濃縮膠組分迅速混勻，沿玻璃板壁加入分離膠至短玻璃板頂端，插入梳子，室溫靜置至分離膠聚合。2）SDS-PAGE電泳：組裝電泳裝置，加入電泳液，內(nèi)槽液面高于外槽，拔出梳子，順次加入等質(zhì)量蛋白樣品與預(yù)染Maker。電泳：恒壓80 V 30 min，120 V 1 h，至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部停止電泳。3）轉(zhuǎn)膜電泳完成后根據(jù)預(yù)染Marker指示，準(zhǔn)備與SDS-PAGE膠大小一致的PVDF膜、海綿墊和6層濾紙，甲醇活化PVDF膜30 s，均置于電轉(zhuǎn)液平衡10 min。從電轉(zhuǎn)夾負(fù)極面（黑色）依次放置海綿、濾紙、SDS-PAGE膠、PVDF膜、濾紙、海綿，排除氣泡，夾緊電轉(zhuǎn)夾。將電轉(zhuǎn)夾正極面（透明）對(duì)電轉(zhuǎn)槽紅色面，放入電轉(zhuǎn)槽，加滿電轉(zhuǎn)液，置冰盆中，恒流300 mA 1.5 h通電轉(zhuǎn)膜。4）封閉及雜交：電轉(zhuǎn)完成后，置入封閉液，搖床室溫封閉1 h。一抗雜交：加入5%脫脂奶稀釋的一抗（GLUT9：1∶50 000;GAPDH：1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次。二抗雜交：加入5%脫脂奶稀釋的二抗（山羊抗鼠二抗1∶5 000，山羊抗兔二抗1∶5 000），室溫孵育1.5 h。TBST洗膜5 min×3次。5）ECL顯影：配制化學(xué)發(fā)光液，避光均勻?yàn)⒂赑VDF膜上，曝光機(jī)自動(dòng)曝光。6）圖像分析Image J軟件檢測(cè)各蛋白條帶灰度值，總蛋白以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算GLUT9的蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism7.00統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，含多時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)的2組樣本間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，2組獨(dú)立樣本間比較根據(jù)正態(tài)或方差齊性檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同灌注壓下離體腎臟功能參數(shù)

在100 mm Hg灌注壓下，腎小球?yàn)V過率在0～20 min、20～40 min、40～60 min有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在120 mm Hg灌注壓下，腎小球?yàn)V過率在0～20 min、20～40 min、40～60 min有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與在100 mm Hg灌注壓下的腎小球?yàn)V過率比較，在120 mm Hg灌注壓下的腎小球?yàn)V過率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1，圖1。

在100 mm Hg灌注壓下，尿流率在0～20 min、20～40 min、40～60 min有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在120 mm Hg灌注壓下，尿流率在0～20 min、20～40 min、40～60 min有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與在100 mm Hg灌注壓下的腎小球?yàn)V過率比較，在120 mm Hg灌注壓下的尿流率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2，圖2。

在100 mm Hg及120 mm Hg灌注壓下，葡萄糖重吸收率在0～20 min、20～40 min、40～60 min均有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），腎臟重吸收功能仍滿足模型要求。見表3，圖3。

在100 mm Hg灌注壓下，鈉離子重吸收率在0～20 min、20～40 min、40～60 min有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在120 mm Hg灌注壓下，鈉離子重吸收率在0～20 min、20～40 min、40～60 min有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在2個(gè)不同灌注壓下的不同時(shí)間段，鈉離子重吸收率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且腎臟重吸收功能滿足模型要求。見表4，圖4。

在100 mm Hg及120 mm Hg灌注壓下，鉀離子重吸收率在0～20 min、20～40 min、40～60 min差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且腎臟重吸收功能滿足模型要求。見表5，圖5。

2.2 菊苣酸對(duì)離體腎臟尿酸排泄水平影響

動(dòng)態(tài)觀察各組腎臟尿酸排泄情況，結(jié)果顯示：與尿酸組比較，在0～20 min，菊苣酸組腎臟尿酸清除率、腎臟尿酸排泄分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在20～40 min、40～60 min，菊苣酸組腎臟尿酸清除率、腎臟尿酸排泄分?jǐn)?shù)均顯著升高（P<0.05），其中，尿酸清除率分別提高75.7%，尿酸排泄分?jǐn)?shù)分別提高148.68%、130.76%;與尿酸組比較，在0～20 min、20～40 min、40～60 min，丙磺舒組腎臟尿酸清除率、腎臟尿酸排泄分?jǐn)?shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見表6～7，圖6～7。

2.3 菊苣酸對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（HKC）GLUT9表達(dá)影響

與對(duì)照組比較，尿酸組HKC細(xì)胞GLUT9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05）;與尿酸組比較，菊苣酸組、苯溴馬隆組、丙磺舒組HKC細(xì)胞GLUT9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表8，圖8～9。

3 討論

3.1 離體腎臟灌流模型的條件選擇

適當(dāng)?shù)墓嗔髁渴潜ＷC離體腎臟功能的基本要求。目前，離體腎臟灌流有恒壓灌流與恒流灌流2種灌流方式。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用恒流灌注過程中，灌注壓力隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，超出腎臟的生理灌注壓力，導(dǎo)致腎功能下降，故該研究采用恒壓灌注方式。

統(tǒng)計(jì)離體腎臟灌流技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，離體腎臟灌流的灌注壓力在50～160 mm Hg區(qū)間內(nèi)，其中90%以上研究者選擇以80～120 mm Hg區(qū)間的壓力進(jìn)行灌注，故該研究分別在80 mm Hg、100 mm Hg、120 mm Hg灌注壓力下，觀察不同灌注壓力對(duì)離體腎臟功能的影響。通過觀察離體腎臟功能參數(shù)，包括腎小球?yàn)V過率、尿流率、葡萄糖重吸收率、鈉離子重吸收率、鉀離子重吸收率等評(píng)價(jià)離體腎臟功能選擇最佳灌注壓力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在80 mm Hg灌注壓力下，尿流率小于0.005 mL/min，可能由于灌注壓力較小達(dá)不到一定灌流量造成，尿量過少，無法檢測(cè)腎功能參數(shù)指標(biāo)，在相關(guān)圖表中均未顯示該組結(jié)果。在100 mm Hg、120 mm Hg灌注壓力下，腎小球?yàn)V過率、尿流率、葡萄糖重吸收率、鈉離子重吸收率各參數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2組的腎功能相似，但與100 mm Hg比較，在120 mm Hg灌注壓力下，腎小球?yàn)V過率、尿流率較高，腎功能較好，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇120 mm Hg灌注壓力。

3.2 菊苣酸示例應(yīng)用離體腎臟灌流模型

研究顯示，菊苣具有良好的降尿酸的作用[12-13]，菊苣提取物能降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，增加腎臟的清除率，調(diào)節(jié)腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9和OAT1表達(dá)，從而促進(jìn)尿酸排泄。朱春勝等[14]研究發(fā)現(xiàn)菊苣酸能夠降低高尿酸血癥鵪鶉的血清尿酸水平，且能夠抑制鵪鶉血清中黃嘌呤氧化酶（XOD）和腺苷脫氨酶（ADA）活性，從而得出其發(fā)揮藥效的機(jī)制可能與抑制XOD、ADA活性從而減少尿酸生成有關(guān)。那么，菊苣酸是否能通過促進(jìn)尿酸排泄發(fā)揮降尿酸作用呢？腎臟作為對(duì)尿酸排泄貢獻(xiàn)最大的器官，菊苣酸是否能夠促進(jìn)腎臟尿酸的排泄？故該研究應(yīng)用離體腎臟灌流技術(shù)，排除體液、神經(jīng)循環(huán)等因素的影響，觀察菊苣酸對(duì)腎臟中尿酸排泄的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菊苣酸在20～40 min、40～60 min均能提高腎臟清除率，增加腎臟尿酸排泄分?jǐn)?shù)，提示菊苣酸發(fā)揮降尿酸作用可能與促進(jìn)腎臟尿酸排泄有關(guān)，應(yīng)用離體腎臟灌流技術(shù)初步篩選出菊苣酸可能是菊苣通過促進(jìn)尿酸排泄發(fā)揮降尿酸作用的活性成分。

3.3 HKC細(xì)胞聯(lián)合離體腎臟灌流模型評(píng)價(jià)菊苣酸降尿酸活性

腎臟尿酸排泄需多種位于腎小管上皮細(xì)胞的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同協(xié)調(diào)完成，是腎臟調(diào)節(jié)體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，也是新型降尿酸藥物的研究靶點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)多種腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可分為尿酸重吸收蛋白和尿酸分泌蛋白2大類。GLUT9在腎臟的分布主要在近端小管上皮細(xì)胞基底膜外側(cè)，是唯一表達(dá)在小管上皮細(xì)胞基底膜側(cè)的尿酸重吸收蛋白，因此對(duì)尿酸重吸收最后環(huán)節(jié)具有決定性的作用[15-17]。細(xì)胞研究顯示，當(dāng)GLUT9突變時(shí)，尿酸重吸收幾乎完全停止[18]。Dinour等[19]發(fā)現(xiàn)，SLC2A9基因突變可引起尿酸吸收障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重的低尿酸血癥，并可能誘發(fā)腎結(jié)石和急性腎功能衰竭，由此認(rèn)為GLUT9在尿酸鹽的重吸收及維持體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)方面具有重要的調(diào)控作用。故該研究選擇尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9為靶點(diǎn)，從體外細(xì)胞水平觀察菊苣酸對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，從而評(píng)價(jià)離體腎臟灌流技術(shù)篩選降尿酸活性成分的可行性。

HKC細(xì)胞為人腎小管上皮細(xì)胞系細(xì)胞，多用于研究外源性毒物，不良刺激等因素對(duì)HKC損傷的機(jī)制研究等。研究顯示尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9在HKC中有表達(dá)[20]，故該研究通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)高尿酸狀態(tài)下HKC細(xì)胞GLUT9蛋白表達(dá)變化，及高尿酸狀態(tài)下菊苣酸干預(yù)后的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菊苣酸能夠顯著抑制高尿酸狀態(tài)下GLUT9蛋白表達(dá)，提示菊苣酸可能通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9的表達(dá)促進(jìn)腎臟尿酸排泄。

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（2020-12-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81673618）;國(guó)家中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才支持計(jì)劃“岐黃學(xué)者”項(xiàng)目（1040063320004）;國(guó)家高層次人才特殊支持計(jì)劃（萬人計(jì)劃）教學(xué)名師項(xiàng)目（2020063320001）

作者簡(jiǎn)介：鄒麗娜（1996.03—），女，碩士研究生，研究方向：中藥防治代謝性疾病研究，E-mail：zoulina1996@163.com

通信作者：張冰（1959.08—），女，博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥防治代謝性疾病研究，E-mail：zhangbing6@263.net