天王補(bǔ)心丹對(duì)失眠模型鼠的療效及部分機(jī)制研究

劉珊 敬秀平 謝安衛(wèi) 尹詩(shī)

摘要 目的：觀察天王補(bǔ)心丹對(duì)失眠模型鼠行為學(xué)的影響，探析其對(duì)TLR4通路的影響。方法：利用氯苯丙氨酸腹腔注射制備失眠模型，將成模45只大鼠數(shù)字隨機(jī)分為模型組、天王補(bǔ)心丹低劑量組（7 g/kg）及天王補(bǔ)心丹高劑量組（28 g/kg），另設(shè)空白組15只。連續(xù)中藥干預(yù)7 d后比較各組大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)、睡眠時(shí)間、中縫背核Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化蛋白88（MyD88）以及外周血清核因子-κB、誘導(dǎo)干擾素β的TRIF變化。結(jié)果：天王補(bǔ)心丹可明顯減少失眠模型大鼠中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)，延長(zhǎng)睡眠時(shí)間縮短睡眠潛伏期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），外周血核因子-κB、TRIF、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1以及中縫背核TLR4、MyD88水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：天王補(bǔ)心丹可改善失眠，其作用機(jī)制可能與通過(guò)TLR4通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫有關(guān)。

關(guān)鍵詞 失眠;模型大鼠;天王補(bǔ)心丹;行為學(xué);中縫背核Toll樣受體4信號(hào)通路;關(guān)鍵因子;腫瘤壞死因子-α;白細(xì)胞介素-1

Study on the Therapeutic Effect and Partial Mechanism of Tianwang Buxin Pill on Insomnia Model Rats

LIU Shan，JING Xiuping，XIE Anwei，YIN Shi

（General Department，People′s Hospital of Guang′an City of Sichuan Province，Guang′an 638500，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Tianwang Buxin Pill on the behavior of insomnia model rats and to explore its effect on TLR4 pathway.Methods：The insomnia model was established by intraperitoneal injection of chlorophenylalanine.A total of 45 rats were randomly divided into a model group，a low dose Tianwang Buxin Pill group （7 g/kg） and a high dose Tianwang Buxin Pill group （28 g/kg）.Another 15 rats in the blank group were established.After continuous intervention with Chinese medicine for 7 days，the changes of open field behavior，sleep time，Toll-like receptor 4 （TLR4），myeloid differentiation protein 88 （MyD88） and peripheral serum nuclear factor-kappa B （NF-kappa B），TIR base domain linker molecule for inducing interferon β （TRIF） were compared in each group.Results：Tianwang Buxin Pill could significantly reduce the central lattice residence time and modification times of insomnia model rats，and prolong the sleep time and shorten the sleep latency （P<0.05）.The levels of NF-κ B，TRIF，TNF-α，IL-1 in peripheral blood and TLR4 and MyD88 in dorsal raphe nucleus decreased （P<0.05）.Conclusion：Tianwang Buxin Pill can improve insomnia，and its mechanism may be related to the regulation of immunity through TLR4 pathway.

Keywords Insomnia; Model rats; Tianwang Buxin Pill; Behavior; TLR4 signaling pathway; Key factors; TNF-α; IL-1

中圖分類號(hào)：R289.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.017

失眠是臨床常見(jiàn)的睡眠障礙性疾病，流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)普通人群中約45.4%存在失眠問(wèn)題[1]，主要表現(xiàn)在難以入眠、醒后復(fù)睡困難或醒后精力體力無(wú)法恢復(fù)，給人們的工作、生活帶來(lái)嚴(yán)重的困擾。目前治療失眠的西藥多以苯二氮艸卓類、抗抑郁藥為主，雖可在一定程度上改善癥狀，但反彈、成癮及戒斷等嚴(yán)重不良反應(yīng)影響了治療依從性。失眠屬于中醫(yī)學(xué)“不寐”的范疇，認(rèn)為陽(yáng)盛陰衰，陰陽(yáng)失交是其主要病機(jī)，天王補(bǔ)心丹源自《攝生秘剖》，近年來(lái)大量臨床資料[2-4]均證實(shí)天王補(bǔ)心丹可有效治療不寐，但其作用機(jī)制目前尚無(wú)定論。

有文獻(xiàn)顯示長(zhǎng)期失眠機(jī)體免疫功能受損，有研究人員通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)失眠大鼠TLR4信號(hào)通路被過(guò)度激活[5]，TLR4表達(dá)適量時(shí)可調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，如果過(guò)度表達(dá)時(shí)可激活下游核因子-κB信號(hào)通路，最終引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而干擾機(jī)體免疫系統(tǒng)。由此我們?cè)O(shè)想：天王補(bǔ)心丹有效治療失眠的作用機(jī)制是否通過(guò)TLR4信號(hào)通路進(jìn)行介導(dǎo)。基于此進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，旨在進(jìn)一步研究天王補(bǔ)心丹治療失眠的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

70只SPF級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20）g，所有大鼠均購(gòu)自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司[醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0009）]。所有大鼠均接受同批次飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均在每日上午8：00-11：30時(shí)間段進(jìn)行，保持環(huán)境安靜、通風(fēng)，溫度（26±1.5）℃，濕度（45±2）%。各組大鼠在體質(zhì)量、性別等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具有可比性。

1.1.2 藥物

天王補(bǔ)心丹（華潤(rùn)三九（臨清）藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z3772003）成分：生地黃120 g、五味子、當(dāng)歸身、天冬、麥冬、柏子仁、酸棗仁各30 g、人參、玄參、丹參、白茯苓、遠(yuǎn)志、桔梗各15 g。

1.1.3 試劑與儀器

核因子-κB ELISA試劑盒（江蘇江萊生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：27382），TRIF ELISA試劑盒（江蘇江萊生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：281723），TLR4一抗抗體（購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab13556），MyD88一抗抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab2064），β-actin一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0061r），PCPA（購(gòu)自TargetMol，貨號(hào)：T1447）。

渦旋振蕩儀（上海珂淮儀器有限公司，型號(hào)：WS-50D）;轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（購(gòu)于Bio-Rad公司，型號(hào)：Trans-Blot SD）;臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf，型號(hào)：5418）。

1.2 干預(yù)方法

1.2.1 分組與模型制備

分組：70只大鼠隨機(jī)分為空白組和造模組，空白組15只，造模組60只，將60只造模組進(jìn)行失眠模型制備，最終45只成模，將成模的大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組及高劑量組，每組15只。

模型制備[5]：將所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行模型制備，每日8：00開(kāi)始造模，對(duì)造模組大鼠腹腔注射PCPA混懸液（0.4 g/kg），連續(xù)注射2 d。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天夜晚均活動(dòng)不停時(shí)提示失眠模型制備成功。

1.2.2 給藥方法

根據(jù)人/鼠公斤體質(zhì)量的等效劑量計(jì)算方法，本研究的天王補(bǔ)心丹懸濁液藥量為7.5 g/kg，去藥渣合并藥液后對(duì)藥汁進(jìn)行濃縮，利用婆梅氏比重計(jì)對(duì)濃縮后藥汁的濃度進(jìn)行測(cè)量，使最終藥液濃度為1.06 g/mL。隨后對(duì)中藥組大鼠進(jìn)行低（7 g/kg）、高劑量（28 g/kg），空白組及模型組大鼠接受1 mL生理鹽水干預(yù)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 行為學(xué)

于最后1 d干預(yù)結(jié)束30 min后將各組大鼠置于自制木箱內(nèi)，記錄大鼠3 min內(nèi)站立次數(shù)、停留中央網(wǎng)格的時(shí)間（t）、修飾次數(shù)以及排便顆粒。

1.2.3.2 翻正反射試驗(yàn)（睡眠狀況）

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]所述，翻正反射消失提示進(jìn)入睡眠。本實(shí)驗(yàn)于最后一日干預(yù)結(jié)束后每組隨機(jī)抓取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg），記錄大鼠睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間。

1.2.3.3 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)法測(cè)定各組外周血核因子-κB、TRIF水平變化

于最后1 d干預(yù)結(jié)束后每組隨機(jī)抓取3只大鼠，取其腹主動(dòng)脈血5 mL，高速離心后取出上清液，用相應(yīng)的ELISA試劑盒對(duì)各組細(xì)胞的核因子-κB、TRIF、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL-1）水平進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：將樣本加入ELISA反應(yīng)孔板中，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，加入PBS洗滌2次，3 min/次，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，再加入的酶標(biāo)抗體，室溫下孵育1 h后加入PBS洗滌2次，3 min/次。反應(yīng)結(jié)束后先后于空中加入0.1 mL的TMB及0.05 mL的2 mol/L硫酸，最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光值（A值）。操作過(guò)程完全按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3.4 用Western Bloting測(cè)定各組中縫背核TLR4、MyD88水平變化

于最后1 d干預(yù)結(jié)束后每組隨機(jī)抓取3只大鼠，充分麻醉后處死，取中縫背核組織200 mg加1 mL裂解緩沖液，4 ℃，15 000 r/min，離心，冰浴中超聲，20 s/次，間隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL測(cè)蛋白含量。BCA法測(cè)蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調(diào)為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結(jié)束后將凝膠取出，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，按照膠在負(fù)極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時(shí)間依據(jù)各指標(biāo)分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，用麗春紅對(duì)固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)染，看電泳帶是否清晰，證實(shí)蛋白質(zhì)確實(shí)轉(zhuǎn)移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min，分別加入抗TLR4、MyD88、β-actin一抗抗體孵育，4 ℃過(guò)夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記與一抗相抗的二抗IgG（1∶2 000）室溫50 min，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液中反應(yīng)1 min，計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國(guó)）分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，4組數(shù)據(jù)同時(shí)符合正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析，若其中一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用多組秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組睡眠狀況比較

在翻正反射實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)造模大鼠睡眠時(shí)間短，睡眠潛伏期明顯延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)天王補(bǔ)心丹干預(yù)后大鼠睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，睡眠潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組行為學(xué)差異

研究發(fā)現(xiàn)失眠模型制備大鼠在中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)以及排便量明顯增多，經(jīng)過(guò)天王補(bǔ)心丹干預(yù)后大鼠中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)、排便顆粒明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平比較

經(jīng)過(guò)ELISA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平明顯升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)過(guò)天王補(bǔ)心丹干預(yù)后外周血核因子-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組中縫背核TLR4、MyD88水平變化

模型組大鼠中縫背TLR4、MyD88表達(dá)明顯升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)過(guò)天王補(bǔ)心丹干預(yù)后中縫背TLR4、MyD88表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討論

失眠屬于中醫(yī)學(xué)“不得眠”“不得寐”“目不瞑”等范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)期即已對(duì)此病的病因病機(jī)進(jìn)行探析。正如《靈樞·口問(wèn)》描述：“陽(yáng)氣盡，陰氣盛，則目瞑;陰氣盡而陽(yáng)氣盛，則寤矣。”認(rèn)為睡眠-覺(jué)醒周期取決于機(jī)體的陰陽(yáng)消長(zhǎng)平衡。至宋代醫(yī)家認(rèn)為：“臥則魂歸于肝，神靜而得寐，今肝有邪，魂不得歸，是以臥則魂揚(yáng)若離體也。”提出肝藏魂功能與睡眠正常與否息息相關(guān)。隨著對(duì)失眠病因病機(jī)的進(jìn)一步認(rèn)知，清代醫(yī)家描述：“蓋日不能寐者，乃腎不交于心;夜不能寐者，乃心不交于腎也。”“陽(yáng)氣自動(dòng)而之靜，則寐;陰氣自靜而之動(dòng)，則寤;不寐者，病在陽(yáng)不交陰也?！闭J(rèn)為心腎不交、陰陽(yáng)失調(diào)是導(dǎo)致失眠的重要原因[7-10]。雖然歷代醫(yī)家對(duì)失眠的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)各有側(cè)重，但歸根結(jié)底“臟腑失衡，陽(yáng)不入陰、營(yíng)衛(wèi)失和”貫穿于疾病始終。天王補(bǔ)心丹首載于《攝生總要》，歷代醫(yī)家將其廣泛應(yīng)用于失眠的治療，并取得了理想療效。該方含有生地黃、五味子、當(dāng)歸身、天冬、麥冬、柏子仁、酸棗仁、人參、玄參、丹參、茯苓、遠(yuǎn)志、桔梗。方中重用生地黃，聯(lián)合玄參共為君藥，共行使滋陰養(yǎng)血之功，以滋補(bǔ)肝腎之陰血為主，水盛則火得以抑制，血不燥則津自潤(rùn)[11]。天冬、麥冬加強(qiáng)君藥滋陰之功，柏子仁、酸棗仁、當(dāng)歸有養(yǎng)血養(yǎng)心安神的作用，諸藥共為臣藥，助君藥滋陰潤(rùn)燥養(yǎng)心。配以人參加強(qiáng)益氣的作用，氣為血帥，氣充則陰血自生，此外，人參亦有養(yǎng)心安神的作用[12]。五味子有益氣滋腎，生津斂陰之功，攜人參共奏補(bǔ)氣生陰之功。茯苓、遠(yuǎn)志有健脾養(yǎng)血安神益智的作用，又可交通心腎。丹參清熱活血養(yǎng)心，使諸藥補(bǔ)而不滯[13]。朱砂可清熱鎮(zhèn)心，安神，兼治其標(biāo)。桔梗質(zhì)輕浮，性上行，為使藥可能引諸藥上行，發(fā)揮“舟楫”之用[14]。諸藥合用，共奏補(bǔ)益心腎、滋陰養(yǎng)血、調(diào)和陰陽(yáng)的功效，與失眠中醫(yī)病機(jī)一一對(duì)應(yīng)，故可針對(duì)性治療失眠。

本研究利用PCPA腹腔注射制備失眠動(dòng)物模型，在成模大鼠中，通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及翻正反射實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠的確出現(xiàn)了在中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)以及排便量明顯增多，睡眠時(shí)間短，睡眠潛伏期明顯延長(zhǎng)的睡眠障礙征象。在經(jīng)過(guò)天王補(bǔ)心丹干預(yù)后大鼠中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)和糞便顆粒數(shù)均明顯減少，睡眠指標(biāo)亦明顯改善，這提示天王補(bǔ)心丹明顯改善了失眠模型大鼠的行為學(xué)及睡眠質(zhì)量，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外臨床研究或動(dòng)物研究一致[5，15-17]。有研究表明處于失眠狀態(tài)的機(jī)體淋巴細(xì)胞的表達(dá)及功能均產(chǎn)生變化，有數(shù)據(jù)顯示大鼠在接受睡眠剝奪后NK細(xì)胞數(shù)目明顯減少，在滿足大鼠的睡眠需求后NK細(xì)胞表達(dá)回歸至正常水平。也有臨床研究顯示失眠患者血漿IL-1和核因子-κB水平升高，當(dāng)患者睡眠時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)此類現(xiàn)象被抑制。因此越來(lái)越多學(xué)者將研究失眠發(fā)生機(jī)制的視角集中于機(jī)體固有免疫應(yīng)答方面[18-19]。有資料顯示失眠模型大鼠TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平上升，TLR4信號(hào)通路是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的重要生物信號(hào)[5，20]。本研究亦證實(shí)接受失眠模型制備的大鼠外周血及腦組織的TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵因子出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，且TNF-α、IL-1水平同時(shí)升高，認(rèn)為失眠激活了TLR4信號(hào)通路，同時(shí)激活了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)的表達(dá)。

因此，本研究證實(shí)天王補(bǔ)心丹可改善失眠，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制TLR4通路關(guān)鍵因子過(guò)表達(dá)，抑制了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，調(diào)整機(jī)體的免疫功能而實(shí)現(xiàn)的。

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（2019-10-12收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273851）

作者簡(jiǎn)介：劉珊（1988.08—），女，碩士，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)，E-mail：sknq80@163.com