胞質(zhì)分裂阻滯微核自動(dòng)化分析技術(shù)的研究進(jìn)展

申相 陳英 溫占波 鄭勁林 周正干

1（北京航空航天大學(xué)機(jī)械工程及自動(dòng)化學(xué)院 北京100083）

2（軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京100850）

3（北京慧榮和科技有限公司 北京101102）

當(dāng)涉及大量人員受照的輻射事故發(fā)生時(shí)，救治方案需要及時(shí)確定他們的受照劑量［1］，以便了解暴露人員接受治療的優(yōu)先次序，并減輕其對(duì)自身受照情況的擔(dān)心。由于事故的突發(fā)性，雖然職業(yè)人員能夠使用自身攜帶的物理劑量計(jì)進(jìn)行劑量監(jiān)測(cè)，但更多情況是沒(méi)有佩戴或即使佩戴了也無(wú)法準(zhǔn)確獲得物理劑量的，這就需要使用生物劑量方法來(lái)估算暴露人員的受照劑量。除此之外，微核檢測(cè)作為放射職業(yè)人員體檢中的一個(gè)必須項(xiàng)目，已經(jīng)列入國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)。胞質(zhì)分裂阻滯微核（Cytokinesis-block micronucleus，CBMN）分析是目前除染色體畸變金標(biāo)準(zhǔn)之外最有效的劑量估算方法，其通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入細(xì)胞松弛素B，將人外周血淋巴細(xì)胞中雙核細(xì)胞（Binucleated cell，BC）的微核（Micronuclei，MN）率與受照劑量相關(guān)聯(lián)，常用于放射生物劑量學(xué)中的未知?jiǎng)┝抗浪悖?-5］。MN 來(lái)自于電離輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的分裂滯后的整條染色體或染色體片段。當(dāng)細(xì)胞受到輻照時(shí)，MN在細(xì)胞核分裂后期處于滯后狀態(tài)，因此不被包含在細(xì)胞的主核中，而是成為小的圓形實(shí)體保留在細(xì)胞質(zhì)中［6］。相較于雙著絲粒染色體分析，CBMN 分析更加簡(jiǎn)單且制片速度更快，因此更加適用于大批人群的快速生物劑量測(cè)定。

人工視覺(jué)分析的主觀(guān)性及其較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間［7-8］，無(wú)法滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需求。為解決這些問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者及公司嘗試多種自動(dòng)化分析方法以求快速準(zhǔn)確地鑒定BC 以及MN。目前只有德國(guó)蔡司等公司采用熒光染色的方法檢測(cè)BC 和MN，且該方法對(duì)于常規(guī)吉姆薩（Giemsa）染色的標(biāo)本檢出率較低［9-11］。國(guó)內(nèi)尚無(wú)CBMN自動(dòng)化分析軟件。CBMN 自動(dòng)化分析系統(tǒng)一般由硬件設(shè)施與軟件程序組成，硬件設(shè)施由上位機(jī)控制，目的是自動(dòng)獲取高清細(xì)胞圖像。分析軟件則以高清細(xì)胞圖像作為輸入，通過(guò)分析算法進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)與分析，最終輸出劑量估算需要的數(shù)據(jù)，包括MN率、微核細(xì)胞率等。國(guó)外從20世紀(jì)90年代初開(kāi)始了CBMN 自動(dòng)化分析研究，目前國(guó)際上較知名的系統(tǒng)為 Metasystems （Metafer， 德國(guó)） 和PathFinder （IMSTAR， 法國(guó)）。 無(wú)論是德國(guó)Metasystems 系統(tǒng)還是法國(guó)的PathFinder 系統(tǒng)，它們都采用傳統(tǒng)的門(mén)控識(shí)別策略［12-13］。本文主要對(duì)細(xì)胞圖像的自動(dòng)化獲取方式及自動(dòng)化圖像分析算法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，總結(jié)并展望CBMN 自動(dòng)分析的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

1 CBMN圖像的自動(dòng)化獲取

目前國(guó)際上主流的細(xì)胞圖像獲取方式有自動(dòng)顯微鏡成像以及成像流式細(xì)胞儀（Imaging flow cytometry，IFC）成像。起初，為了增加圖像自動(dòng)化分析的通量和計(jì)數(shù)的可重復(fù)性，CBMN 分析的成像方式是使用顯微鏡和電荷耦合器件（CCD）相機(jī)成像。近幾年，一些研究者和公司將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到了CBMN 分析上，并結(jié)合熒光顯微鏡的可成像特點(diǎn)與常規(guī)流式細(xì)胞儀的高通量特點(diǎn)，研發(fā)了IFC［14-15］。因?yàn)樽詣?dòng)顯微鏡成像使用的是細(xì)胞涂片，所以可以使用Giemsa 或者熒光染料進(jìn)行染色，前者可以長(zhǎng)期保存。IFC使用的是細(xì)胞懸浮液，并使用激光器進(jìn)行熒光誘發(fā)，因此只能使用熒光染料染色，用過(guò)無(wú)法保存且不具有可重復(fù)性。

1.1 自動(dòng)顯微鏡成像

自動(dòng)顯微鏡成像系統(tǒng)（圖1）一般由三個(gè)部分組成：（1）彩色/熒光顯微鏡，帶有10×、20×、40×、60×和100×物鏡的光學(xué)顯微鏡；（2）電荷耦合器件相機(jī)，使用彩色或者黑白的相機(jī)，該相機(jī)通過(guò)接口連接到計(jì)算機(jī)，實(shí)時(shí)顯示和拍照；（3）運(yùn)動(dòng)控制臺(tái)和存儲(chǔ)系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)通過(guò)發(fā)送指令，使運(yùn)動(dòng)控制臺(tái)按照規(guī)劃的路徑移動(dòng)，同時(shí)顯微鏡上下移動(dòng)調(diào)焦，然后拍攝捕獲細(xì)胞圖像并將其存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。在自動(dòng)顯微鏡成像產(chǎn)品領(lǐng)域，德國(guó)的Metasystems 以及法國(guó)的PathFinder 是國(guó)際上知名的產(chǎn)品。其中，Metasystems 已被研究人員廣泛用于各種研究，例如臨床病理、癌癥研究、細(xì)胞及分子遺傳學(xué)檢測(cè)等［16］。Verma 等［17］介紹了他們使用Metasystems 的操作過(guò)程。首先，他們將熒光染色的載玻片裝載到Metasystems 系統(tǒng)的移動(dòng)載玻片掃描平臺(tái)上，然后對(duì)當(dāng)前載玻片中心進(jìn)行手動(dòng)聚焦，隨后系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行載玻片掃描，自動(dòng)聚焦和掃描整個(gè)載玻片大約需要8 min。系統(tǒng)使用10×物鏡捕獲細(xì)胞核和MN 的圖像，并將單元格和MN圖像重新顯示在軟件界面上（單元格形成畫(huà)廊視圖中顯示的坐標(biāo)），同時(shí)通過(guò)高分辨率的相機(jī)捕獲圖像以進(jìn)行保存。如果需要連續(xù)掃描多張載玻片，則需要在開(kāi)始時(shí)為所有的載玻片手動(dòng)進(jìn)行中心點(diǎn)聚焦。

經(jīng)過(guò)研究人員驗(yàn)證，PathFinder 中用于MN 測(cè)定的自動(dòng)化圖像分析系統(tǒng)可用于毒理學(xué)領(lǐng)域，監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)細(xì)胞對(duì)誘變劑的暴露情況，其中包括電離輻射［13］。Decordier 等［12］描述了PathFinder 系統(tǒng)的自動(dòng)獲取圖像的步驟，其中硬件設(shè)施的操作與Metasystems基本相同，但他們只使用Giemsa染色的樣片。整個(gè)檢測(cè)和計(jì)數(shù)過(guò)程分為兩個(gè)步驟：第一步，檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，找出BC；第二步，在檢測(cè)到的BC 中搜索MN。由于PathFinder的MN 分析使用了400×的放大倍數(shù)，而放大倍數(shù)越大，掃描以及算法分析的時(shí)間越長(zhǎng)，且該系統(tǒng)仍然需要人工視覺(jué)驗(yàn)證，因此每天僅能掃描12 張載玻片。

圖1 自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)組成Fig.1 Composition of automatic microscope system

得益于載玻片可重復(fù)掃描的特點(diǎn)，使用自動(dòng)顯微鏡成像方法時(shí)，可以存儲(chǔ)圖像并在需要時(shí)重新掃描樣片，也可以在掃描的同時(shí)鑒定和記錄單核、多核細(xì)胞的圖像。但掃描得到的圖像效果受限于標(biāo)本的制作質(zhì)量，而標(biāo)本的質(zhì)量可能因?qū)嶒?yàn)室條件和操作者技術(shù)水平而異。在掃描時(shí)間方面，對(duì)于同樣大小的樣片來(lái)說(shuō)，放大倍數(shù)越大，需要尋找拍攝的圖像就越多，自動(dòng)化掃描以及算法分析消耗的時(shí)間也越長(zhǎng)。而較低的放大倍數(shù)則可能導(dǎo)致圖片不夠清晰以及像素點(diǎn)信息不夠，影響后續(xù)自動(dòng)分析的識(shí)別效果。

1.2 IFC成像

IFC是一種新的細(xì)胞成像技術(shù)，具有常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）的高通量特點(diǎn)與熒光顯微鏡的可成像特點(diǎn)。IFC 與傳統(tǒng)的FCM 相似，都是用熒光染料標(biāo)記細(xì)胞，并將熒光染色后的待測(cè)細(xì)胞制作成細(xì)胞懸液［18-19］。然后用一定的壓力將懸液壓入流動(dòng)室，通過(guò)用高壓將緩沖液從鞘液管?chē)姵?，并保持鞘液管出口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這就使得緩沖液能夠包繞細(xì)胞懸液高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束。最后，細(xì)胞懸液在圓形流束的包圍下，單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。在發(fā)光源方面，流式細(xì)胞儀以激光作為發(fā)光源，用垂直照射的方式照射在細(xì)胞流上。被熒光染料染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，從而被二極管和光電倍增管接收并識(shí)別計(jì)數(shù)。FCM 因?yàn)槿狈?xì)胞成像與顯示，所以無(wú)法直接檢測(cè)雙核細(xì)胞［20-23］。而IFC可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，在得到不包含細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核、MN熒光圖像的基礎(chǔ)上進(jìn)行BC 以及MN 的識(shí)別，因此可以用于CBMN的自動(dòng)化分析。

美國(guó)的MilliporeSigma 公司研發(fā)了一款名為ImageStreamX（ISX）的IFC［24］。ISX 同樣是將被熒光染色后的細(xì)胞懸液聚焦到檢測(cè)區(qū)域，通過(guò)發(fā)光二極管和至少一個(gè)激光發(fā)射源對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射。激光照射被熒光染色的細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生透射光和散射光，這些光由物鏡收集。最后，通過(guò)光譜分解元件對(duì)這些光進(jìn)行分解，并聚焦到電荷耦合器件相機(jī)上進(jìn)行成像。在ISX中，光譜分解元件可以將波長(zhǎng)為400～800 nm 的光分成特定的范圍，并投射到電荷耦合器件相機(jī)的不同感應(yīng)位置上，這使得ISX可以對(duì)多種熒光染色的細(xì)胞進(jìn)行不同顏色的熒光成像且互不影響。

哥倫比亞高通量微創(chuàng)放射生物劑量學(xué)中心則將IFC與高通量機(jī)器人技術(shù)集成，開(kāi)發(fā)了基于定制機(jī)器人平臺(tái)的快速自動(dòng)生物劑量測(cè)定技術(shù)（Rapid automated biodosimetry tool，RABiT-II）［15］。機(jī)器人系統(tǒng)可以自動(dòng)執(zhí)行包括血液樣品培養(yǎng)、離心、染色在內(nèi)的所有樣品處理步驟，并將樣品接入到IFC中進(jìn)行分析和成像。通過(guò)使用自動(dòng)化機(jī)器人系統(tǒng)，RABiT 系統(tǒng)具備每天處理6 000 個(gè)血液樣品（每份樣品至少為0.03 mL）的能力，并且可以做到無(wú)偏差的樣品處理和圖像數(shù)據(jù)采集。

由于IFC可以成像，因此IFC兼具熒光顯微鏡的可成像特點(diǎn)與常規(guī)流式細(xì)胞儀的高通量特點(diǎn)，并可以對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行視覺(jué)驗(yàn)證、分析算法門(mén)控參數(shù)和閾值的優(yōu)化和驗(yàn)證。

2 CBMN圖像的自動(dòng)化分析

CBMN自動(dòng)化分析對(duì)于MN的判定標(biāo)準(zhǔn)與人工判定標(biāo)準(zhǔn)基本保持一致［25-26］，即MN的直徑為主核平均直徑的1/16～1/3，不具有折光性，可以與主核接觸，但二者不重疊不連接，染色深淺與主核相同或略淺（偶爾可能染色更深）。傳統(tǒng)的CB 微核測(cè)定法是通過(guò)顯微鏡下人工判定微核圖像來(lái)確定，但人工的方式不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且判定的結(jié)果容易受到檢測(cè)者的主觀(guān)經(jīng)驗(yàn)影響。由于不同的檢測(cè)者對(duì)于判定標(biāo)準(zhǔn)的解讀可能存在不同，尤其是對(duì)于微核與主核“重疊、接觸”的圖像。在目前只能獲取二維圖形的情況下，受限于染色程度、拍攝角度以及個(gè)人經(jīng)驗(yàn)等條件，對(duì)于一些形狀復(fù)雜的細(xì)胞圖像，不同檢測(cè)人員之間可能會(huì)產(chǎn)生不一致的判定結(jié)果。與傳統(tǒng)的人工計(jì)數(shù)方式相比，CBMN 自動(dòng)化分析提供了高通量、高穩(wěn)定性的結(jié)果，在統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)的前提下，將檢測(cè)者的判定方式和經(jīng)驗(yàn)造成的主觀(guān)影響降至最低。

2.1 不關(guān)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)的自動(dòng)化分析算法

目前國(guó)際上存在多種自動(dòng)化分析方法用于鑒定BC 及其中的MN。無(wú)論圖像的自動(dòng)化獲取方式如何，不同自動(dòng)化分析算法的主要區(qū)別之一在于分析的對(duì)象是否包括細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)只有細(xì)胞核信息而沒(méi)有相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)信息時(shí)，表示分析的對(duì)象只有細(xì)胞核。而這類(lèi)算法不僅要定位細(xì)胞邊界并估計(jì)每個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核數(shù)目，還需要對(duì)細(xì)胞核相對(duì)于彼此的位置及其相對(duì)大小進(jìn)行分析。當(dāng)這類(lèi)算法使用的細(xì)胞圖像來(lái)自于自動(dòng)顯微鏡成像方法時(shí)，通常要求操作者在制作樣片時(shí)盡可能降低細(xì)胞的密度，因?yàn)榧?xì)胞密度較大時(shí)，有可能出現(xiàn)不同細(xì)胞的細(xì)胞核被錯(cuò)誤地分配給同一個(gè)細(xì)胞的情況。

MetaSystems 使用的是自動(dòng)顯微鏡的圖像獲取方式，其自動(dòng)化分析算法的分析對(duì)象為細(xì)胞核和MN［9］。該算法首先尋找細(xì)胞核，再將兩個(gè)被染色的相鄰核判定為BC，然后通過(guò)在BC 的兩個(gè)核周?chē)x一個(gè)圓形區(qū)域作為該細(xì)胞的領(lǐng)域，最后在該區(qū)域內(nèi)尋找MN。因此，這種方法可以自動(dòng)檢測(cè)BC和MN并為其計(jì)數(shù)。MetaSystems自動(dòng)檢測(cè)算法采用的是傳統(tǒng)門(mén)控策略，通過(guò)設(shè)定一系列參數(shù)作為門(mén)控策略的“門(mén)”，符合“門(mén)”標(biāo)準(zhǔn)的就被判定為BC或者M(jìn)N，用于BC和MN的參數(shù)基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，例如面積值、長(zhǎng)寬比、凹度等。Varga等［10］描述了他們使用MetaSystems的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)人工視覺(jué)計(jì)數(shù)和自動(dòng)計(jì)數(shù)之間具有較高的相關(guān)性，但自動(dòng)化MN計(jì)數(shù)的數(shù)量?jī)H為人工計(jì)數(shù)的35%左右。而不同的染色方式和染色深淺也會(huì)對(duì)MetaSystems的自動(dòng)化識(shí)別結(jié)果產(chǎn)生影響。Tamizh等［11］介紹了他們?cè)贛etaSystems 系統(tǒng)（3.9 版本）上分析碘化丙啶（PI）熒光染色和Giemsa 染色樣片時(shí)的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)人工分析Giemsa 染色和熒光染色的玻片時(shí)，兩者的分析結(jié)果沒(méi)有顯著差異，而在自動(dòng)分析的結(jié)果中兩者具有非常顯著的差異。自動(dòng)化分析時(shí)，Giemsa染色的相關(guān)系數(shù)為0.875，而PI染色的相關(guān)系數(shù)為0.962。因此可以證明，使用MetaSystems自動(dòng)分析熒光染色樣片得到的結(jié)果與人工視覺(jué)計(jì)數(shù)的結(jié)果相關(guān)系數(shù)更高，其假陽(yáng)性率也更低。即對(duì)于MetaSystems的自動(dòng)化MN分析，使用PI染色要優(yōu)于Giemsa 染色。 在分析時(shí)間方面，MetaSystems使用的是10×物鏡和單色黑白相機(jī)［9］，這使得其能夠很快地完成一張載玻片的掃描與分析（5～10 min），但也有可能會(huì)將一些載玻片或者相機(jī)鏡頭上的雜質(zhì)誤判為MN（該黑點(diǎn)剛好出現(xiàn)在BC內(nèi)）。還有Verhaegen［27］研究了一種算法，首先對(duì)自動(dòng)顯微鏡成像得到的細(xì)胞圖像進(jìn)行單閾值分割，然后計(jì)算包括各目標(biāo)區(qū)域的面積在內(nèi)的7個(gè)特征參數(shù)并進(jìn)行判定。然而，這種分析算法與MetaSystems 的算法具有同樣的缺點(diǎn)，即容易造成誤識(shí)別，將分離在外的兩個(gè)不同細(xì)胞的細(xì)胞核識(shí)別成一個(gè)BC。

2.2 關(guān)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)的自動(dòng)化分析算法

關(guān)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)的自動(dòng)化分析算法是一種將整個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)檢測(cè)單位的算法，一般使用不同的閾值來(lái)實(shí)現(xiàn)圖片背景、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核/MN 的分離。在染色方面，染料不僅要標(biāo)記細(xì)胞核/MN，也要標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞，這樣，不僅細(xì)胞核是可見(jiàn)的，整個(gè)細(xì)胞（包含細(xì)胞質(zhì)）也都是可見(jiàn)的?？梢暬募?xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)能夠?qū)⒓?xì)胞核/MN 與相應(yīng)的細(xì)胞相匹配，從而可以更精確地識(shí)別BC和MN。

PathFinder 使用的算法就是一種關(guān)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)的傳統(tǒng)門(mén)控策略識(shí)別算法。該算法將整個(gè)染色的細(xì)胞作為檢測(cè)的起點(diǎn)。不僅能夠識(shí)別BC，也能夠識(shí)別出單核以及多核細(xì)胞。PathFinder使用Giemsa染色的載玻片進(jìn)行圖像分析，系統(tǒng)首先識(shí)別細(xì)胞的胞質(zhì)以判斷是否為一個(gè)完整的細(xì)胞；然后，檢測(cè)細(xì)胞中的核數(shù)目，從而鑒定是否為BC；最后在第三步中對(duì)MN 的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。Decordier 等［12］發(fā)表了他們?cè)赑athFinder系統(tǒng)上的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)使用了改進(jìn)的載玻片制備技術(shù)來(lái)降低細(xì)胞密度并提升細(xì)胞分散度。經(jīng)過(guò)測(cè)試，PathFinder的CBMN分析顯示出了與人工計(jì)數(shù)具有良好的相關(guān)性，其CBMN自動(dòng)化計(jì)數(shù)為人工計(jì)數(shù)結(jié)果的68.5%。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，PathFinder平臺(tái)的新型CBMN自動(dòng)化圖像分析系統(tǒng)可用于監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)細(xì)胞對(duì)誘變劑的暴露情況，包括電離輻射［13］。由于IMSTAR 使用了400×的放大倍數(shù)，而放大倍數(shù)越大，掃描以及算法分析的時(shí)間越高，如果再加上人工驗(yàn)證（排除假陽(yáng)性）的時(shí)間，PathFinder每天僅能掃描12張載玻片。

除了PathFinder，還有其他一些學(xué)者研究的關(guān)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)的傳統(tǒng)門(mén)控策略識(shí)別算法。Lyulko 等［28］介紹的RABiT 系統(tǒng)通過(guò)使用雙重染色（細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分別熒光染色）來(lái)降低MN假陽(yáng)性結(jié)果。在RABiT 系統(tǒng)使用的雙重染色的載玻片中，分別利用Cell mask orange 染色劑以及4'，6-二脒基-2-苯基 吲 哚 （4'， 6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI）染料對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色，然后通過(guò)熒光顯微鏡以及多臺(tái)攝像機(jī)分別成像，從而保證分析系統(tǒng)的高通量。其圖像分析算法以細(xì)胞質(zhì)為分析起點(diǎn)，分別對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的圖像進(jìn)行單獨(dú)分析。圖像分析算法采用Matrox imaging library（MIL）閾值化方法來(lái)分離細(xì)胞核/MN，同樣采用門(mén)控策略來(lái)對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞核、MN進(jìn)行判斷，使用的判定參數(shù)包括細(xì)胞和細(xì)胞核的圓（橢圓）形度、面積、緊密度、粗糙度和費(fèi)雷特伸長(zhǎng)率等。

Szirmai等［29］提出一種可對(duì)MN 圖像進(jìn)行自動(dòng)分析的系統(tǒng)，同樣使用自動(dòng)顯微鏡成像的照片。該軟件基于細(xì)胞、細(xì)胞核和MN 的輪廓線(xiàn)來(lái)識(shí)別BC 和MN。使用Giemsa 染色劑對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色，但要求樣片染色效果好（染色淺且均勻）。當(dāng)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)在背景強(qiáng)度上有顯著差異時(shí)，才能通過(guò)閾值法得到較好的檢測(cè)效果。Bahreyni等［30］描述了他們?cè)谑褂?0×目鏡以及40×物鏡下捕獲的圖像進(jìn)行自動(dòng)化分析時(shí)，對(duì)BC 以及MN 計(jì)數(shù)的結(jié)果。他們?cè)O(shè)計(jì)的軟件能夠在各種細(xì)胞質(zhì)顏色強(qiáng)度和外周血涂片中含糊的MN 情況下，檢測(cè)到BC，并進(jìn)行了200 張圖像的實(shí)驗(yàn)測(cè)試。B?cker等［31-32］研制的淋巴細(xì)胞微核圖像分析系統(tǒng)包括兩步：首先，在低倍鏡（10×物鏡）下尋找BC 并記錄其位置；然后，再轉(zhuǎn)到高倍鏡（63×物鏡）下識(shí)別其中的MN。其測(cè)試結(jié)果為：BC 的識(shí)別能力約為人工的65%，MN識(shí)別的準(zhǔn)確率約為71%。同時(shí)該研究也指出MN 的識(shí)別準(zhǔn)確率較低的主要原因有：Giemsa染色導(dǎo)致出現(xiàn)MN偽像；一些MN體積極??；MN 與胞漿對(duì)比度差；MN 粘連（尤其是對(duì)于高劑量射線(xiàn)照射后的樣本）。由于采用了先低倍鏡查找再高倍鏡分析的步驟，獲取圖像需要的時(shí)間大大增加。

國(guó)內(nèi)也有一些學(xué)者進(jìn)行了CBMN 圖像識(shí)別算法的研究。閆學(xué)昆［33］發(fā)表了一種自動(dòng)化圖像分析算法，該算法使用MetaSystems 平臺(tái)在63×物鏡放大倍數(shù)下拍攝得到的細(xì)胞圖像，載玻片上細(xì)胞使用Giemsa 染色。算法將整個(gè)圖像處理流程劃分為圖像的預(yù)處理、自動(dòng)分割、淋巴細(xì)胞區(qū)域的分類(lèi)、雙核淋巴細(xì)胞的自動(dòng)識(shí)別、粘連細(xì)胞的判別與分離、MN的自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù)這6個(gè)步驟。雙核淋巴細(xì)胞以及MN的自動(dòng)識(shí)別采用傳統(tǒng)門(mén)控策略，使用的判定參數(shù)包括面積、缺陷率和長(zhǎng)寬比等。

曾理等［34］將時(shí)頻分析方法（即小波分析算法）應(yīng)用到CBMN 圖像的邊緣提取算法中，通過(guò)時(shí)頻分析方法將圖像的灰度值集中到細(xì)胞邊緣附近，從而得到噪聲影響小、邊緣連續(xù)且清晰的細(xì)胞核（含MN）圖像，且同時(shí)保證了MN 的清晰度，使得MN能與主核有明顯的區(qū)別。與傳統(tǒng)的邊緣提取法相比，該算法具有噪聲低、邊緣清晰的特點(diǎn)。

易東等［35］建立了一種消除細(xì)胞圖像的斑點(diǎn)縫隙噪聲的方法。該方法采用灰度倒數(shù)加權(quán)法來(lái)消除縫隙噪聲，對(duì)二值圖像使用收縮再擴(kuò)張的方法來(lái)消除斑點(diǎn)噪聲，并使細(xì)胞邊緣光滑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灰度倒數(shù)加權(quán)法能使得圖像邊緣上絲狀和黑色區(qū)域里的小洞被有效地去除；而二值圖像收縮再擴(kuò)張的算法可以把一些小的塊狀雜質(zhì)去掉。該方法也可用于其他圖像噪聲消除的處理。

2.3 IFC的分析算法

IFC 算法的分析對(duì)象是不包含細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核/微核的熒光圖像，雖然IFC 理論上具有很高的通量，但是實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)IFC的MN檢出率并不高，只有使用顯微鏡測(cè)量MN數(shù)量的20%～30%。

Rodrigues 等［14］介紹了他們使用ISX 的經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)使用ISX系統(tǒng)，他們可以在無(wú)需制作載玻片的情況下捕獲懸浮細(xì)胞中的圖像。ISX使用門(mén)控策略來(lái)分析每個(gè)BC 的MN 數(shù)量，使用的判定參數(shù)包括細(xì)胞核/MN 面積、圓形度、長(zhǎng)寬比和像素梯度下降值等。ISX可以在約5 min內(nèi)以40×或60×物鏡的放大率收集包含數(shù)千個(gè)細(xì)胞圖像的數(shù)據(jù)文件，并可以得到單/多核細(xì)胞的百分比，劑量反應(yīng)曲線(xiàn)的詳細(xì)數(shù)據(jù)以及包含核質(zhì)橋和核芽的高分辨率細(xì)胞圖像。Verma 等［17］對(duì)ISX 進(jìn)行了測(cè)試，證明ISX獲得的MN數(shù)量為放射生物劑量法中使用顯微鏡測(cè)量MN數(shù)量的30%左右，因?yàn)閷?duì)于一些較小的MN或非?？拷骱说腗N，系統(tǒng)可能會(huì)出現(xiàn)遺漏。

Wang 等［15］將成像流式細(xì)胞術(shù)集成到了RABiT-II 中。首先在樣本的處理方面，通過(guò)調(diào)整血液與培養(yǎng)基的比率、在細(xì)胞固定之前添加低滲液等措施優(yōu)化核熒光（DRAQ5）染色的效果，從而使BC的產(chǎn)量提高81%；然后，在成像處理算法方面，對(duì)處理算法進(jìn)行修改，從而減少了圖像分析的時(shí)間，其使用的判定參數(shù)包括細(xì)胞核/MN 圓形度、面積值、寬高比、兩個(gè)核的重疊度、各個(gè)核之間的距離等。在RABiT-II 系統(tǒng)中，所有的樣品處理步驟均由RABiT-II cell explorer 機(jī)器人系統(tǒng)自動(dòng)執(zhí)行；最后，他們對(duì)使用4 Gy 照射的血液樣本進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)自動(dòng)化分析獲得的MN數(shù)量約為放射生物劑量法中使用顯微鏡測(cè)量MN 數(shù)量的20%。

雖然IFC具有高通量的特點(diǎn)，但是MN檢測(cè)率并不高，加之IFC只能使用熒光染料染色（樣本保存時(shí)間短）和較高的硬件設(shè)施成本，因此目前IFC在CBMN自動(dòng)化分析領(lǐng)域尚未廣泛應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

無(wú)論是自動(dòng)顯微鏡成像還是IFC，其目的都是為了獲取高清的細(xì)胞二維圖像。由于二維圖像只能顯示某個(gè)角度的細(xì)胞形態(tài)，一些藏在細(xì)胞核背面的MN以及核質(zhì)橋往往會(huì)被遺漏或者在圖像中顯示不完整。在自動(dòng)化分析算法方面，絕大部分的算法都是使用傳統(tǒng)門(mén)控識(shí)別策略，由于這種策略的識(shí)別率低，在自動(dòng)化分析時(shí)就需要更多的血液樣本來(lái)獲取足夠的BC。

隨著硬件設(shè)施的精度和穩(wěn)定性的不斷提升，人們已經(jīng)能夠在更短的時(shí)間內(nèi)獲取更多更全面的細(xì)胞圖像信息。因此，如何在更多細(xì)胞圖像信息下進(jìn)行更全面更符合需求的CBMN 自動(dòng)化分析將成為這個(gè)領(lǐng)域未來(lái)的重點(diǎn)研究方向。

（1）基于三維圖像的CBMN 自動(dòng)化分析。本質(zhì)上，細(xì)胞是一個(gè)三維實(shí)體，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，從多個(gè)不同角度獲得單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)圖像會(huì)成為可能，從而可以重構(gòu)出三維的細(xì)胞實(shí)體，這將有助于捕獲所有CBMN 中的生物標(biāo)志物（如核質(zhì)橋、極小的MN、藏在細(xì)胞核背面的MN 等），從而進(jìn)一步提高M(jìn)N的檢出率，并提升劑量估算的準(zhǔn)確性。完整核質(zhì)橋數(shù)據(jù)也能為將來(lái)發(fā)展以核質(zhì)橋?yàn)榛A(chǔ)的生物劑量估算研究提供基礎(chǔ)。

（2）使用機(jī)器學(xué)習(xí)或深度學(xué)習(xí)的自動(dòng)化分析算法。隨著硬件系統(tǒng)性能和存儲(chǔ)設(shè)備容量的提升，研究人員已經(jīng)可以采集并存儲(chǔ)到越來(lái)越多的細(xì)胞圖像，非常適合對(duì)這些海量數(shù)據(jù)使用機(jī)器學(xué)習(xí)或深度學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行訓(xùn)練。

（3）自動(dòng)化程度、檢出率更高的CBMN 自動(dòng)化分析。使用自動(dòng)化制片，可以制作出標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的樣片。再通過(guò)提高制片技術(shù)，制作染色均勻且染色程度淺、細(xì)胞密度低的載玻片，能夠進(jìn)一步提升MN的檢出率。在現(xiàn)有國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平不足以支持全面使用熒光染料檢測(cè)的情況下，通過(guò)彩色圖像識(shí)別，以方便區(qū)分雜質(zhì)，能夠降低誤識(shí)別率，提升檢測(cè)結(jié)果的精確度。