60Co γ 輻射對(duì)兩種梔子組織培養(yǎng)的影響

胡瑤 雷星宇 李宏告 張勇 周毅吉 李麗輝

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所 長(zhǎng)沙410125）

梔子花（Gardenia jasminoides Ellis）為茜草科梔子屬常綠灌木或小喬木，又名山梔子、黃梔子，產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江流域，喜溫暖濕潤(rùn)環(huán)境。梔子花芳香馥郁，色澤潔白，且花含揮發(fā)油，可提制浸膏，作調(diào)香劑，果實(shí)可作黃色染料，根、花、種子可入藥，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值［1］。

但國(guó)內(nèi)適合商品化生產(chǎn)的品種還很少，新品種選育顯得尤為迫切。輻照誘變育種和組織培養(yǎng)相結(jié)合的育種體系是近年來研究者普遍關(guān)心的育種方法，它可以提高植物在基因水平上的突變率，有利于打破性狀連鎖和促進(jìn)基因重組，擴(kuò)大植物的變異范圍，減小親本對(duì)變異類型的限制，縮短育種年限，最終促進(jìn)新種質(zhì)的產(chǎn)生［2-3］。

目前，輻射誘變技術(shù)在植物新品種培育及品種性狀改良等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，而組織培養(yǎng)在植物快速繁殖方面也普遍應(yīng)用。輻照誘變育種主要采用X射線、60Co γ 射線、電子束等對(duì)花卉進(jìn)行輻照。Ahloowalia 等［4］采用軟X 射線對(duì)50 個(gè)品種的杜鵑進(jìn)行輻照誘變育種，最終發(fā)現(xiàn)31%的植株都產(chǎn)生了嵌合體變異的情況；齊文全等［3］研究結(jié)果表明，60Co γ射線對(duì)不同庭院月季品種扦插苗的最適吸收劑量為45 Gy，該劑量范圍內(nèi)，月季扦插苗既能保持一定的生長(zhǎng)，又具有較高的變異頻率；王晶等［5］利用60Co γ射線對(duì)菊花組培苗進(jìn)行輻射處理，結(jié)果表明輻照后的變異花增加了不同深淺的紅色素，且突變植株均為同質(zhì)穩(wěn)定突變；林兵等［6］的研究表明，60Co γ輻射誘變可以作為荷蘭鳶尾新品種培育的有效途徑；朱宗文等［7］研究電子束對(duì)番茄種子的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著電子束劑量的增加，番茄種子的發(fā)芽率逐漸降低，當(dāng)劑量為600 Gy 時(shí)，黃盆栽和1479 種子發(fā)芽率分別為對(duì)照組（CK）的97.2%和77.2%；彭穎［8］采用60Co γ射線對(duì)梔子組織培養(yǎng)愈傷組織進(jìn)行不同吸收劑量的射線處理，結(jié)果表明梔子的半致死劑量為40 Gy左右，致死劑量為60 Gy左右，還發(fā)現(xiàn)其染色體發(fā)生了明顯變異，變異率以40 Gy處理最高。

綜上可知，60Co γ 射線用于植物輻照誘變育種效果較好，但關(guān)于梔子輻照誘變結(jié)合組織培養(yǎng)的報(bào)道尚為少見，如對(duì)于吸收劑量、輻射時(shí)間對(duì)梔子種子組培培養(yǎng)生長(zhǎng)和發(fā)育的影響以及輻射后植株的變異情況鮮見報(bào)道。本研究以“林海1 號(hào)”、武岡野生梔子果實(shí)為試材，進(jìn)行60Co γ射線輻射并結(jié)合組織培養(yǎng)系列試驗(yàn)，探討輻照對(duì)兩種梔子種子組織培養(yǎng)的影響，得出半致死劑量，為進(jìn)一步選育優(yōu)良梔子品種資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為汨羅基地栽培梔子“林海一號(hào)”和武岡野生梔子引種栽培第二年收獲的成熟果實(shí)，采收后自然曬干，陰涼處存放。

1.2 輻照處理

將兩種梔子果實(shí)分別采用自封袋分裝后，送往湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所生物輻照中心進(jìn)行輻射處理，劑量分別為0 Gy、20 Gy、40 Gy、60 Gy，每組8個(gè)樣品。

1.3 組織培養(yǎng)

將輻照后的果實(shí)浸泡24 h，取出種子接種到分化培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L）中培養(yǎng)，并誘導(dǎo)植株再生（生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 2.0 mg/L）。各劑量組培養(yǎng)5 瓶，每瓶5 粒種子。具體指標(biāo)測(cè)定方法見式（1）～（7）。

1.4 輻照后組培苗葉片氣孔結(jié)構(gòu)分析

當(dāng)組培苗葉片長(zhǎng)至6片葉時(shí)，分別從不同輻照處理葉片中隨機(jī)采集三個(gè)2 mm×2 mm 樣品，將樣品固定于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛（0.1 mol/L 磷酸緩沖液，pH為7.0），置于4 ℃下冷藏保存3 d，用磷酸緩沖液沖洗6 次，用體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定3 h，用相同磷酸緩沖液沖洗干凈。將組織在分級(jí)乙醇中進(jìn)行脫水，臨界點(diǎn)干燥，再在觀察臺(tái)上固定，利用高壓涂膜裝置進(jìn)行噴金處理。對(duì)單個(gè)氣孔在Quanta 200 掃描電子顯微鏡（FEI Corp，USA）下觀察和拍照［9］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 進(jìn)行方差分析，以Duncan's進(jìn)行多重比較，以Excel 2019繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照對(duì)兩種梔子種子啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

表1中均為培養(yǎng)45 d后的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

表1 不同劑量60Co γ輻射對(duì)兩種梔子種子啟動(dòng)培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of different absorbed doses on the start training of two kinds of gardenia

由表1 可以看出，60Co γ 射線輻照對(duì)兩種梔子種子啟動(dòng)培養(yǎng)均產(chǎn)生了不同程度的影響?！傲趾Ｒ惶?hào)”梔子種子4個(gè)處理均未出現(xiàn)污染的情況，而經(jīng)輻照后的種子組培出愈率逐漸降低，其中60 Gy處理的褐化率最高，出愈率最低，20 Gy輻照處理的“林海一號(hào)”種子出愈率最高。武岡野生梔子在40 Gy輻照處理下出愈率達(dá)到72%，較CK高出28%。60 Gy處理的“林海1號(hào)”梔子種子比武岡野生梔子種子總體出愈率高。

2.2 輻照對(duì)兩種梔子不定芽分化的影響

將顏色翠綠、長(zhǎng)勢(shì)良好的梔子愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基中，再進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)。每組10 瓶，每瓶接入5 塊愈傷組織，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。經(jīng)過輻照處理的兩種梔子出苗率均比對(duì)照低。但武岡野生梔子40 Gy 處理較20 Gy 處理出苗率又顯著上升?！傲趾? 號(hào)”和武岡野生梔子均為60 Gy 處理出苗率最低，比對(duì)照組分別下降了65.19%和58.38%，呈顯著性差異。武岡野生梔子出苗率除20 Gy 處理略低于“林海1 號(hào)”梔子外，其余各處理出苗率均高于“林海一號(hào)”梔子。

圖1 不同劑量60Co γ輻射對(duì)兩種梔子不定芽分化的影響Fig.1 Effects of different absorbed doses on adventitious bud differentiation of two kinds of gardenia

2.3 輻照對(duì)兩種梔子不定根分化的影響

從增殖培養(yǎng)中選擇梔子不定芽生長(zhǎng)健壯且高度大于2 cm 的組培苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)。接種30 d 后的調(diào)查結(jié)果見表2 和圖2。由表2 和圖2 可知，“林海1號(hào)”梔子生根率隨著劑量的增大而降低，劑量達(dá)到60 Gy時(shí)，生根率明顯低于其他處理組和對(duì)照組。40 Gy 處理的“林海1 號(hào)”梔子組培苗平均苗高最高，較對(duì)照和60 Gy處理組呈顯著差異，其根系較發(fā)達(dá)。而劑量達(dá)到60 Gy 時(shí)，“林海1 號(hào)”梔子平均苗高最矮，根系短，數(shù)量少，長(zhǎng)勢(shì)也一般。武岡野生梔子生根率CK 最高，60 Gy 處理最低，各處理間差異顯著。40 Gy 處理的組培苗長(zhǎng)勢(shì)好，且平均苗高最高，根系較發(fā)達(dá)，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)，與對(duì)照存在顯著差異。但整體長(zhǎng)勢(shì)較“林海1 號(hào)”差。兩種梔子在60 Gy輻照處理下發(fā)生了株高明顯矮化現(xiàn)象，較對(duì)照差異顯著。

2.4 輻射對(duì)兩種梔子葉片氣孔開度的影響

取兩種經(jīng)不同吸收劑量處理的梔子組培苗幼嫩葉片作電鏡制片，比較輻照后的葉片與對(duì)照葉片的氣孔形態(tài)及大小，其結(jié)果見圖3。從已張開的氣孔形態(tài)來看，經(jīng)輻照處理的“林海1號(hào)”梔子葉片氣孔張開程度較對(duì)照大，且均出現(xiàn)不同程度的皺縮，60 Gy處理的最為明顯。武岡野生梔子經(jīng)輻照處理的葉片氣孔也呈現(xiàn)不同程度的變化。20 Gy處理的氣孔變小，保衛(wèi)細(xì)胞和副衛(wèi)細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；40 Gy處理的氣孔張開程度變化不大，但保衛(wèi)細(xì)胞皺縮程度最大；60 Gy處理的氣孔內(nèi)壁變薄，外壁變化不大，副衛(wèi)細(xì)胞皺縮明顯。從表3 可以看出，“林海1 號(hào)”梔子輻射后葉片的氣孔都有不同程度的增大，保衛(wèi)細(xì)胞寬度變寬，氣孔打開程度以60 Gy處理為最大，與對(duì)照呈顯著差異。武岡野生梔子輻射后葉片氣孔變化與“林海1 號(hào)”不同，其中40 Gy 處理的氣孔長(zhǎng)寬及氣孔開度均比對(duì)照大，20 Gy和60 Gy 處理的氣孔長(zhǎng)寬及氣孔開度則均比對(duì)照小，處理后的葉片氣孔保細(xì)胞寬度均比對(duì)照寬，但差異不顯著。

3 討論

用輻射方法結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)使得育種效率明顯增高，是植物新種質(zhì)選育快速有效的方法之一，劑量是60Co γ射線誘變育種應(yīng)用過程中的一個(gè)重要因素，在一定范圍內(nèi)，增大吸收劑量可提高突變頻率，擴(kuò)大變異譜，但過高的劑量會(huì)使致死率提高，不良畸變率增大［10-11］。本文采用60Co γ 射線對(duì)“林海1號(hào)”梔子、武岡野生梔子果實(shí)進(jìn)行輻招處理，并進(jìn)行組織培養(yǎng)。結(jié)果表明：隨著60Co γ吸收劑量的增加，“林海1 號(hào)”出愈率降低、而武岡野生梔子40 Gy處理的出愈率升高，說明一定劑量的輻照處理對(duì)武岡野生種子的萌發(fā)具有促進(jìn)和刺激作用。這與周亞倩和Stotzky 等［12-13］的研究結(jié)果一致：低劑量輻照可促進(jìn)樹蘭、香蕉種子的萌發(fā)，縮短萌發(fā)時(shí)間、提高萌發(fā)率。耿興敏等［14］在研究60Co γ射線對(duì)桂花種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響中也發(fā)現(xiàn)，較低劑量的輻照可以提高潢川金桂、籽銀桂和短柄籽銀桂種子的發(fā)芽率。在杉木、紫薇、鳶尾［15-17］等種子輻射育種研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。

大量研究表明：60Co γ 射線輻照會(huì)引起植物形態(tài)損傷或死亡，在誘變育種中，劑量過低達(dá)不到誘變效果，隨著吸收劑量的增加，植株突變率也會(huì)相應(yīng)提高，但劑量過高，植株正常的代謝會(huì)受到干擾，畸變率及死亡率都會(huì)增加，通常將半致死劑量作為吸收劑量選擇的重要參考依據(jù)［18-19］。如Luz 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，150 Gy 和250 Gy 均能引起藜麥發(fā)生突變，并且突變率隨劑量而增大，350 Gy則導(dǎo)致藜麥品種Pasankalla 全部死亡。陳睿等［21］以兩種杜鵑為材料研究輻射效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在25～65 Gy內(nèi)隨著吸收劑量增大，花的變異率增加，花色和花瓣形態(tài)出現(xiàn)多樣性。本研究中兩種梔子輻照后不定芽分化率、生根率均呈下降趨勢(shì)，“林海1號(hào)”半致死劑量為40～60 Gy；武岡野生梔子半致死劑量為40 Gy左右，說明不同植物品種或類型由于存在遺傳差異而對(duì)輻照的敏感性不同，即使是同種植物的不同生長(zhǎng)狀態(tài)也對(duì)輻照的敏感性不同。

本研究還對(duì)輻射后的梔子組織培養(yǎng)出來的葉片進(jìn)行氣孔結(jié)構(gòu)觀察，“林海1號(hào)”梔子經(jīng)60Co γ射線輻照后，組培苗氣孔打開程度均比對(duì)照組大，這可能是輻照對(duì)植株造成的傷害需要加大呼吸作用，則張大氣孔進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，加強(qiáng)代謝以修復(fù)射線對(duì)植株的損傷，這與李黎等［22］研究結(jié)果一致。武岡野生梔子則是40 Gy處理后，氣孔開度增大顯著，這可能是武岡野生梔子耐受劑量的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的梔子輻射組培苗矮化、氣孔形態(tài)皺縮等變異情況，是否為基因組的突變，需要下一步進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

60Co γ射線輻射處理對(duì)“林海1號(hào)”、武岡野生梔子種子組織培養(yǎng)、組培苗葉片氣孔結(jié)構(gòu)的影響差異較大。其中，“林海1 號(hào)”半致死劑量為40～60 Gy，武岡野生梔子半致死劑量約為40 Gy。因此，梔子育種可利用60Co γ射線結(jié)合組織培養(yǎng)方法進(jìn)行輻射誘變，為今后為梔子輻射誘變育種提供一定的理論依據(jù)。