新型蛋白結(jié)合類毒素血液灌流吸附劑的制備及吸附性能

劉云鴻，彭新艷

（泉州師范學(xué)院化工與材料學(xué)院,泉州 362000）

尿毒癥毒素是指因腎臟功能下降而滯留于患者體內(nèi)并且造成尿毒癥癥狀的物質(zhì)，通?？赏ㄟ^血液凈化方法從患者血液中除去［1，2］.科學(xué)家們?cè)诮嗄曛邪l(fā)現(xiàn)，有一類重要的尿毒癥毒素，主要有對(duì)硫酸吲哚酚（IS）、對(duì)甲酚硫酸鹽（PCS）和吲哚乙酸（IAA）等，雖然其本身的相對(duì)分子量低于500，但因其可與血清白蛋白結(jié)合，被稱為蛋白結(jié)合類毒素（PBUT）［3，4］.大多數(shù)血液凈化模式對(duì)PBUT的清除效果均較差，每周的清除效率不及腎臟的1/10［2，5］.PBUT 在腎臟疾病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［6］，研究用于清除PBUT的安全、高效血液凈化新材料和新技術(shù)，減少患者的并發(fā)癥，提高長期存活率和生活質(zhì)量，降低醫(yī)療成本，已成為迫切的民生需求.

血液凈化是清除尿毒癥毒素以維持患者生命的重要手段，其方法主要有透析（HD）、濾過（HF）和血液灌流（HP）等.現(xiàn)有研究表明，普通透析和高通量透析對(duì)IS和PCS這類高蛋白結(jié)合率毒素的清除率均小于35%［7，8］，去除效果不佳.血液透析濾過（HDF）結(jié)合了HD 和HF 的特點(diǎn)，但仍存在營養(yǎng)物質(zhì)丟失、PBUT無法有效清除的問題［9］.在血液灌流應(yīng)用領(lǐng)域，超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂可作為吸附劑，如健帆HA樹脂，可通過吸附方式清除血液中的內(nèi)源性或外源性致病因子，在治療肝、腎功能衰竭和急性藥物中毒等疾病領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.與透析法相比，基于多孔材料吸附模式的血液灌流具有更好的PBUT清除效果［10，11］.

但血液灌流超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂在生產(chǎn)和臨床使用中仍存在一定問題，主要包括：（1）現(xiàn)有血液灌流超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂主要通過大孔型低交聯(lián)聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物的氯甲基化及Friedel-Crafts后交聯(lián)制得，氯甲基化和后交聯(lián)工藝分開進(jìn)行，制備過程繁瑣復(fù)雜，且需使用有毒、致癌的氯甲醚等化學(xué)物質(zhì)，可能會(huì)對(duì)人和環(huán)境造成一定的危害，有待進(jìn)一步地技術(shù)優(yōu)化和改進(jìn)；所制備的超高交聯(lián)吸附樹脂結(jié)構(gòu)中還含有一定殘余量的氯甲基，在血液灌流器儲(chǔ)存和使用過程中，樹脂骨架中的氯甲基會(huì)發(fā)生水解等副反應(yīng)，釋放出氯化氫分子，導(dǎo)致血液灌流器中保存液pH值降低［12，13］；（2）血液灌流超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂主要依靠物理吸附作用（包括分子篩作用、表面吸附等）清除目標(biāo)物質(zhì)，對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的清除效率仍達(dá)不到透析對(duì)小分子毒素（尿素氮/肌酐等）的清除率［10，11，14］，導(dǎo)致臨床血液凈化治療效果不理想.

研究發(fā)現(xiàn)［15～17］，在人體血液中，PBUT和血清白蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合，如IS和PCS的白蛋白結(jié)合率分別為97%和95%，主要?dú)w因于帶負(fù)電的PBUT可與白蛋白結(jié)合位點(diǎn)上帶正電的堿性氨基酸形成強(qiáng)的靜電相互作用.受此啟發(fā)，本文仿生模擬PBUT 與白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，在吸附材料上構(gòu)筑仿生堿性功能配基，以達(dá)到對(duì)帶電的PBUT毒素進(jìn)行有效競爭親和吸附的目的.針對(duì)現(xiàn)有血液灌流超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂制備過程繁瑣、不環(huán)保及對(duì)PBUT毒素吸附不佳的問題，本文提出以咪唑基團(tuán)作為仿生功能配基，采用小分子外交聯(lián)劑進(jìn)行傅克烷基化后交聯(lián)反應(yīng)，制備含咪唑基團(tuán)的仿生功能化新型超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂吸附劑，研究其對(duì)尿毒癥蛋白結(jié)合類毒素的吸附性能及血液相容性等.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

苯乙烯（St，99%）、1-乙烯基咪唑（VMZ，99%）、過氧化苯甲酰（BPO，分析純）、二甲氧基甲烷（FDA，98%）、明膠（99%）、甲基異丁基甲醇（MIBC，99%）、1，2-二氯乙烷（DCE，分析純）和無水三氯化鐵（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二乙烯苯（DVB，80%），江蘇豪隆化工有限公司；牛血清白蛋白（BSA，96%）和磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4），上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉和氯化鎂，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸吲哚酚（IS）、對(duì)甲酚硫酸鹽（PCS）和吲哚乙酸（IAA），美國Sigma-Aldrich 公司；甲狀旁腺激素（PTH）、β2-微球蛋白（β2M）及白細(xì)胞介素6（IL-6），美國R&D Systems公司.

Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國賽默飛世爾科技公司；Merlin型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），德國Zeiss公司；JPS-9200型X射線光電子能譜儀（XPS），日本JEOL公司；3Flex型比表面積及孔徑分析儀，美國麥克儀器公司；LC1100型高效液相色譜儀［（HPLC，配備Inertsil OSD 型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）］，美國安捷倫科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 超高交聯(lián)聚苯乙烯吸附樹脂的制備 采用懸浮聚合法制備含咪唑基團(tuán)的低交聯(lián)度改性聚苯乙烯多孔樹脂.在1000 mL三口瓶中加入400 mL去離子水和5 g明膠，于50 ℃下攪拌2 h，待分散劑明膠完全溶解后，依次加入15 g 氯化鈉和10 g 氯化鎂，攪拌使其完全溶解，得到水相；將58 g St、11.6 g DVB、12 g VMZ、1.33 g BPO、34 g甲苯和76 g MIBC于室溫下混合，待引發(fā)劑完全溶解后得到油相；將油相緩慢加入水相中，在一定的攪拌速度下，于78 ℃反應(yīng)8 h，再繼續(xù)升溫至83 ℃反應(yīng)5 h；聚合反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物依次用水和乙醇洗滌數(shù)次，以除去分散劑和致孔劑等，烘干，得到含咪唑基團(tuán)的低交聯(lián)度改性聚苯乙烯多孔樹脂［P（St-DVB-VMZ）］.

將50 g P（St-DVB-VMZ）和500 mL二氯乙烷加入三口燒瓶中，室溫?cái)嚢?2 h，使樹脂充分溶脹；依次加入140 g FDA和250 g 無水三氯化鐵，在50 ℃下回流反應(yīng)3 h后，升溫至80 ℃繼續(xù)回流反應(yīng)6 h；靜置降溫后，將樹脂分離出來，先用乙醇洗滌至澄清，再用稀鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）洗滌8 h，然后用乙醇索氏抽提8 h，烘干，即得到含咪唑基團(tuán)的超高交聯(lián)聚苯乙烯吸附樹脂［HCP（St-DVB-VMZ）］.

1.2.2 牛血清白蛋白環(huán)境中PBUT 的吸附性能測試 將牛血清白蛋白溶解于0.2 mol/L PBS 溶液（pH=7.4）中，得到蛋白含量為40 g/L的模擬血清蛋白溶液；將一定量的蛋白結(jié)合類毒素（IS，PCS和IAA）加入容量瓶中，用模擬血清蛋白溶液定容，配制成需要濃度的毒素-蛋白溶液；將1 mL 濕樹脂［其中，HA130樹脂含量約為0.21 g，HCP（St-DVB-VMZ）含量約為0.26 g］加入25 mL三角瓶中，加入PBS溶液浸潤12 h后，得到待測濕樹脂.

向濕樹脂中分別加入10 mL 不同濃度的毒素-蛋白溶液，其中IS，PCS 和IAA 初始濃度分別為25，25和5 mg/L；于37 ℃的恒溫振蕩器中以110 r/min的速率振蕩吸附一段時(shí)間后，吸取清液與等體積色譜純乙腈混合，漩渦振蕩和離心；取上層清液，經(jīng)針頭過濾器過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析；流動(dòng)相為乙腈-水溶液（VCH3CN∶VH2O=1∶4），采用等度洗脫，流速為1.0 mL/min，IS，PCS 和IAA 的檢測波長分別為277，265和280 nm.利用HPLC 測定吸附前和吸附后不同時(shí)間段溶液中蛋白結(jié)合類毒素的濃度，以不加樹脂的毒素-蛋白溶液作為空白對(duì)照，吸附率（R，%）由吸附前后蛋白結(jié)合類毒素的濃度差計(jì)算：

式中：c0（mg/L）為PBUT初始濃度；cS（mg/L）為吸附后PBUT濃度.

1.2.3 人血漿環(huán)境中PBUT的吸附性能測試 采用人血漿作為樹脂吸附環(huán)境，評(píng)價(jià)材料對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附性能.通過外添加法，得到IS，PCS和IAA初始濃度分別為25，25，和5 mg/L的PBUT-血漿溶液；將1 mL濕樹脂置入25 mL三角瓶中，加入PBS溶液浸潤12 h后，吸干樹脂表面的PBS緩沖液；加入10 mL所配制的PBUT-血漿溶液，于37 ℃的恒溫振蕩器中以110 r/min的速率振蕩吸附2 h后，分別檢測吸附前后不同PBUT毒素的濃度，計(jì)算得到相應(yīng)的吸附率.IS，PCS和IAA的濃度通過上述HPLC分析方法進(jìn)行檢測.

1.2.4 人血漿環(huán)境中大分子毒素的吸附性能測試 采用人血漿作為樹脂吸附環(huán)境，模擬臨床條件評(píng)價(jià)材料對(duì)甲狀旁腺激素，β2-微球蛋白和白細(xì)胞介素6等尿毒癥中大分子毒素及蛋白的吸附情況.通過外添加法，得到初始濃度分別為180 pmol/L，5 mg/L 和300 pg/mL 的PTH，β2M 和IL-6 的毒素-血漿溶液；將1 mL濕樹脂置于25 mL三角瓶中，加入PBS溶液浸潤12 h后，吸干樹脂表面的PBS溶液；加入10 mL配制的毒素-血漿溶液，于37 ℃的恒溫振蕩器中以110 r/min的速率振蕩吸附2 h后，分別檢測吸附前后不同毒素和蛋白的濃度，計(jì)算得到相應(yīng)的吸附率.

1.2.5 PBS溶液中PBUT的吸附平衡和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將0.06 g樹脂置于50 mL錐形瓶中，用PBS溶液洗滌數(shù)次后，吸干樹脂表面的PBS 溶液；然后分別加入20 mL 初始濃度為c0（mg/L）的PCS（或IAA）溶液，于37 ℃的恒溫振蕩器中以110 r/min的速率振蕩吸附；待吸附平衡后，利用HPLC測定溶液中蛋白結(jié)合類毒素的平衡濃度ce（mg/L），按下式計(jì)算平衡吸附量（qe，mg/g）：

式中：V（L）為吸附溶液體積；m（g）為吸附樹脂質(zhì)量.

用PBS溶液分別配制濃度為100 mg/L的PCS和IAA溶液；將0.15 g樹脂置于100 mL錐形瓶中，用PBS溶液洗滌數(shù)次后，吸干樹脂表面的PBS溶液；加入50 mL PCS或IAA溶液，于37 ℃的恒溫振蕩器中以110 r/min的速率振蕩吸附；定時(shí)從錐形瓶中取0.5 mL溶液，利用HPLC測定溶液中蛋白結(jié)合類毒素濃度，以t時(shí)刻的吸附量qt（mg/g）對(duì)吸附時(shí)間t（min）作圖，獲得吸附動(dòng)力學(xué)曲線.

1.2.6 樹脂的溶血性能測試 參照GB/T 16886.4-2003中的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn).溶血實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組.在試管中裝入50 mg 樹脂樣品和10 mL PBS（pH=7.4）作為實(shí)驗(yàn)組，各種樹脂平行操作3管；試管中僅裝入10 mL PBS溶液（pH=7.4）作為陰性對(duì)照樣，平行操作3管；試管中僅裝入10 mL蒸餾水作為陽性對(duì)照樣，平行操作3管.將8 mL 新鮮兔血與10 mL PBS溶液混合稀釋，獲得紅細(xì)胞懸液；向?qū)嶒?yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的離心管中各加入0.2 mL紅細(xì)胞懸液，在37 ℃的恒溫條件下孵育1 h后，再置于離心機(jī)中以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；離心結(jié)束后移取上清液，以PBS溶液作為參比液在波長545 nm處測定其吸光度.吸附樹脂的溶血率（HR，%）的計(jì)算公式如下：

式中：AS，ANC和APC分別為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的吸光度.

1.2.7 樹脂的復(fù)鈣時(shí)間測試 將樹脂樣品置于錐形瓶中，加入生理鹽水，使樣品充分浸潤；在EP管中量取0.3 mL樹脂，吸干水分后待用.采用不加入樹脂的空白管作為陰性對(duì)照樣，采用玻璃珠作為陽性對(duì)照樣，每個(gè)樣品準(zhǔn)備3個(gè)平行樣.

用EDTA真空采血管取新鮮兔血，在1200 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，用移液槍將上清液取出，得到PRP富血小板血漿.向每個(gè)樣品中加入0.6 mL PRP 血漿，于37 ℃孵育15 min，期間每隔5 min顛倒混勻一次，使樣品與血漿充分接觸；使用排槍同時(shí)在每個(gè)樣品中加入100 μL氯化鈣溶液（0.2 mol/L），用秒表開始計(jì)時(shí)，同時(shí)將樣品置于37 ℃水浴中反應(yīng).將樣品管中從加入氯化鈣開始到血漿完全凝固不動(dòng)的時(shí)間作為復(fù)鈣時(shí)間檢測結(jié)果.

1.2.8 樹脂的粒徑分布和力學(xué)強(qiáng)度測試 采用標(biāo)準(zhǔn)篩檢測所制備HCP（St-DVB-VMZ）樹脂的粒徑分布，即分別采用12 目（1.6 mm）、16 目（1.18 mm）、18 目（1.0 mm）、30 目（0.6 mm）、40 目（0.45 mm）、50目（0.3 mm）和60目（0.25 mm）的不銹鋼網(wǎng)篩對(duì)樹脂進(jìn)行篩分，稱重，計(jì)算其粒徑分布.利用不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩分離出30個(gè)粒徑在1.0～1.18 mm的樹脂顆粒，采用智能顆粒強(qiáng)度儀進(jìn)行顆粒耐壓強(qiáng)度檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 含咪唑基團(tuán)超高交聯(lián)聚苯乙烯吸附樹脂的制備

首先通過傳統(tǒng)懸浮聚合法，將苯乙烯、二乙烯苯和1-乙烯基咪唑通過共聚制備出帶有咪唑基的改性低交聯(lián)聚苯乙烯微球P（St-DVB-VMZ）；在此基礎(chǔ)上，以二甲氧基甲烷為交聯(lián)劑，在氯化鐵催化條件下，使二甲氧基甲烷的甲氧基與P（St-DVB-VMZ）結(jié)構(gòu)上的苯環(huán)之間發(fā)生復(fù)雜的傅克烷基化反應(yīng)，形成剛性高度交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)［18］，高效合成出具有高比表面積和豐富孔結(jié)構(gòu)的含咪唑基團(tuán)超高交聯(lián)聚苯乙烯吸附樹脂HCP（St-DVB-VMZ），合成路線如Scheme 1 所示.本文采用小分子二甲氧基甲烷交聯(lián)劑進(jìn)行傅克烷基化后交聯(lián)反應(yīng)，可避免超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂傳統(tǒng)合成工藝中有毒致癌氯甲醚試劑的使用，為新型血液灌流用功能化超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂的低成本、環(huán)保、高效制備提供了新思路.

Scheme 1 Schematic diagram of fabricating HCP(St-DVB-VMZ)

2.2 樹脂的力學(xué)強(qiáng)度和微觀結(jié)構(gòu)表征

圖1 為所制備HCP（St-DVB-VMZ）樣品粒徑范圍的比重分布圖.從圖1 可以看到，樹脂的粒徑在0.3～1.6 mm 范圍之間，其中0.45～0.6 mm，0.6～1.0 mm 和1.0～1.18 mm 粒徑范圍內(nèi)的樣品比例較大，分別為16.4%，41.1%和27.4%.粒徑在1.0～1.18 mm范圍內(nèi)的樹脂顆粒的耐壓強(qiáng)度檢測結(jié)果表明，HCP（St-DVB-VMZ）的顆粒耐壓強(qiáng)度為（11.5±0.9）N，與商用HA130 樹脂的耐壓強(qiáng)度［（10.2±1.5）N］處于同一水平.合適的吸附樹脂顆粒的大小和強(qiáng)度可避免在血液灌流過程中對(duì)血液成分造成破壞，提高材料的使用安全性.

Fig.1 Particle size distribution for the HCP(St-DVB-VMZ) adsorbents

圖2給出了不同樹脂樣品的光學(xué)照片和SEM照片.由圖2（A）和（D）可以看出，2 種樣品均為光滑球形顆粒；P（St-DVB-VMZ）樣品外觀為白色，經(jīng)過后交聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色的HCP（St-DVB-VMZ）樣品；由圖2（A）和（D）插圖可以看到，未經(jīng)交聯(lián)的P（St-DVB-VMZ）樣品在機(jī)械捏力作用下，經(jīng)歷明顯變形之后破碎，而經(jīng)過高交聯(lián)處理的HCP（St-DVB-VMZ）樣品表現(xiàn)出剛性，在破碎之前無明顯變形.從材料表面的SEM照片［圖2（B）和（E）］可以看出，兩種樣品表面均較平整，HCP（St-DVB-VMZ）樣品表面可見明顯的細(xì)小孔結(jié)構(gòu).從材料內(nèi)部橫截面的SEM照片［圖2（C）和（F）］可以看出，與P（St-DVB-VMZ）相比，HCP（St-DVB-VMZ）樹脂內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)更加豐富.

Fig.2 Optical microscopy micrographs(A,D)and SEM images(B，C，E，F(xiàn))of P(St-DVB-VMZ)(A—C)and HCP(St-DVB-VMZ)(D—F)

通過N2等溫吸附-脫附實(shí)驗(yàn)表征吸附樹脂在后交聯(lián)反應(yīng)過程中孔結(jié)構(gòu)的變化.在N2吸附-脫附等溫線［圖3（A）］中，HCP（St-DVB-VMZ）的吸附量在低壓區(qū)有一個(gè)急劇的抬升，表明樹脂內(nèi)部有大量微孔存在；然后吸附量緩慢增加并在高壓區(qū)出現(xiàn)明顯的回滯環(huán)，表明三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有中/大孔存在［19］.由孔徑分布曲線［圖3（B）］可以看到，P（St-DVB-VMZ）樣品在微/中孔區(qū)域無明顯的孔結(jié)構(gòu)分布；HCP（St-DVB-VMZ）在孔徑0～10 nm 內(nèi)有明顯的孔結(jié)構(gòu)分布，并伴有大量交聯(lián)形成的不規(guī)則中/大孔分布，表明HCP（St-DVB-VMZ）具有多級(jí)層次分布的三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).

Fig.3 N2 adsorption-desorption isotherms(A) and pore size distribution curves(B) of P(St-DVB-VMZ)（a）and HCP(St-DVB-VMZ)(b)

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)過后交聯(lián)反應(yīng)制得的HCP（St-DVB-VMZ）樹脂具有豐富的微孔結(jié)構(gòu)和高比表面積，其總比表面積和微孔比表面積分別高達(dá)709和481 m2/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于P（St-DVB-VMZ）樣品.該現(xiàn)象主要?dú)w因于：在后交聯(lián)過程中二甲氧基甲烷交聯(lián)劑增加了樹脂的交聯(lián)橋，使樹脂在結(jié)構(gòu)上更加豐富和穩(wěn)定，同時(shí)也導(dǎo)致HCP（St-DVB-VMZ）樹脂的平均孔徑變小和孔容增大，其平均孔徑為4.31 nm，孔容為0.62 cm3/g.上述結(jié)果證明，采用以二甲氧基甲烷為交聯(lián)劑的后交聯(lián)法可成功制備出具有豐富孔結(jié)構(gòu)的超高交聯(lián)多孔樹脂HCP（St-DVB-VMZ）.

Table 1 Textural properties of P(St-DVB-VMZ)and HCP(St-DVB-VMZ)

2.3 樹脂的結(jié)構(gòu)表征

圖4 為P（St-DVB-VMZ）和HCP（St-DVB-VMZ）的FTIR 譜圖.可以看出，二者均在1450，1491 和1600 cm-1處出現(xiàn)歸屬于聚合單體芳環(huán)的不飽和—C=C—伸縮振動(dòng)的吸收峰［20］；在3100～3000 cm-1處出現(xiàn)歸屬于不飽和=C—H 的伸縮振動(dòng)峰；在2912 cm-1處出現(xiàn)主鏈上—CH2—的伸縮振動(dòng)吸收峰；1103 cm-1處的峰為咪唑環(huán)變形振動(dòng)吸收峰［21］.與P（St-DVB-VMZ）相比，HCP（St-DVB-VMZ）樣品在3300 cm-1處出現(xiàn)羥基（—OH）的伸縮振動(dòng)峰，在1697 cm-1處出現(xiàn)羰基官能團(tuán)（C=O）的特征峰［22］.這些吸收峰的出現(xiàn)說明P（St-DVB-VMZ）樣品在小分子二甲氧基甲烷交聯(lián)劑的作用下發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，在HCP（St-DVB-VMZ）上成功引入了新的官能團(tuán).

圖5 給出交聯(lián)前后樣品的XPS 譜圖.從圖5（A）可以看到，兩個(gè)樣品均具有明顯的C1s和N1s峰，經(jīng)過后交聯(lián)反應(yīng)的HCP（St-DVB-VMZ）還出現(xiàn)了較明顯的O1s峰.對(duì)HCP（St-DVB-VMZ）樣品的O1s峰進(jìn)行擬合分峰［圖5（B）］，分別在531.1，532.3 和533.4 eV 處出現(xiàn)了C=O，—OH 和C—O—C 上O 原子的特征峰［23］，表明通過后交聯(lián)反應(yīng)在HCP（St-DVB-VMZ）樣品上引入了新的含氧化學(xué)官能團(tuán)結(jié)構(gòu).在交聯(lián)前后樣品的N1s峰的擬合分峰圖［圖5（C）和（D）］中，分別在399.7和398.5 eV處出現(xiàn)了歸屬于咪唑環(huán)的—N—C—和C=N—上N 原子的峰［24］，表明在交聯(lián)前后樹脂化學(xué)結(jié)構(gòu)上均保留有咪唑環(huán)基團(tuán).

Fig.4 FTIR spectra of P(St-DVB-VMZ)(a)and HCP(St-DVB-VMZ)(b)

Fig.5 Survey XPS spectra of P(St-DVB-VMZ) and HCP(St-DVB-VMZ)(A),O1sXPS spectra for HCP(St-DVB-VMZ)(B)and N1s XPS spectra for P(St-DVB-VMZ)(C)and HCP(St-DVB-VMZ)(D)

2.4 樹脂對(duì)PBUT毒素的吸附性能

首先模擬尿毒癥患者體內(nèi)毒素濃度和臨床血液灌流治療參數(shù)，即在采用牛血清白蛋白模擬人體生理白蛋白濃度（40 g/L）條件下，通過外添加法分別得到IS，PCS和IAA初始濃度分別為25，25和5 mg/L的毒素-BSA溶液，以考察樹脂對(duì)毒素的吸附能力.圖6給出HCP（St-DVB-VMZ）樹脂對(duì)IS，PCS和IAA的吸附率隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線，并與現(xiàn)有商品化尿毒癥血液灌流器樹脂HA130的吸附率進(jìn)行對(duì)比.從圖6可以看出，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附率隨著接觸時(shí)間的延長先快速增加然后趨于平緩，P（St-DVB-VMZ）對(duì)毒素的吸附率較低.接觸2 h后，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)IS，PCS和IAA的吸附率達(dá)到峰值，分別為89%，88%和95%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HA130 樹脂對(duì)IS，PCS 和IAA 的吸附率（IS：48%，PCS：42%，IAA：55%）.

Fig.6 Adsorption rates of HA130 resin,P(St-DVB-VM2Z)and HCP(St-DVB-VMZ)for IS(A),PCS(B)and IAA(C)in BSA solution

為了更貼近模擬臨床治療，進(jìn)一步在人血漿環(huán)境中評(píng)價(jià)了材料對(duì)蛋白結(jié)合類毒素和尿毒癥患者血液中大分子毒素的吸附性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示.從圖7（A）可以看出，在經(jīng)過2 h 的接觸吸附后，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)IS，PCS 和IAA 的吸附率分別為82%，80%和96%，仍然明顯高于HA130 樹脂對(duì)IS，PCS 和IAA 的吸附率（IS：32%，PCS：30%，IAA：39%）.在尿毒癥患者體內(nèi)，由于腎功能下降導(dǎo)致代謝產(chǎn)物積累，一些中大分子毒素（PTH，β2M和IL-6等）的堆積會(huì)造成機(jī)體組織、器官的機(jī)能或器質(zhì)性損傷，進(jìn)而影響患者生存質(zhì)量［25］.因此，本文也測試了樣品對(duì)中大分子毒素的吸附性能，結(jié)果如圖7（B）所示.在血漿吸附環(huán)境下，經(jīng)過2 h的接觸吸附后，HCP（St-DVB-VMZ）樹脂對(duì)PTH，β2M和IL-6的吸附率可分別達(dá)到97.1%，90.9%和78.8%，與現(xiàn)有商品灌流器樹脂HA130的吸附能力相當(dāng)，表現(xiàn)出較好的中大分子毒素吸附性能.由此可知，本文制備的HCP（St-DVB-VMZ）表現(xiàn)出同等優(yōu)異的蛋白結(jié)合類毒素和中大分子毒素吸附性能.

Fig.7 Adsorption rates of HA-130 and HCPCST-DVB-VMZ for PBUT toxins(A) and large middle molecule uraemic toxins(B)in the human plasma with the treatment time of 2.0 h

2.5 PBS溶液中PBUT毒素的吸附等溫線及動(dòng)力學(xué)

為更好了解吸附樹脂對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附能力和吸附特點(diǎn)，以PBS溶液（pH=7.4）中的PCS和IAA為模型分子，探討蛋白結(jié)合類毒素在HCP（St-DVB-VMZ）樹脂上的吸附行為.

圖8示出了PBS 溶液中PCS 和IAA 在樹脂上的吸附等溫線數(shù)據(jù)，并采用非線性及線性的Langmuir［式（4）和（5）］和Freundlichr［式（6）和（7）］等溫吸附模型方程進(jìn)行擬合［26，27］，擬合結(jié)果如圖8 和表2所示.

式中：qe（mg/g）為平衡吸附量；qm（mg/g）為最大吸附量；ce（mg/L）為平衡吸附時(shí)蛋白結(jié)合類毒素的濃度；KL（L/mg）為Langmuir 吸附平衡常數(shù)；KF［（mg/g）（L/mg）1/n］為Freundlich 常數(shù)，是反映吸附劑吸附能力的參數(shù)；n為吸附劑的吸附強(qiáng)度，可用于判斷反應(yīng)的難易程度.

由表2 可知，Langmuir 吸附等溫方程得到的擬合度R2（大于0.99）均大于Freundlich 吸附等溫方程的擬合度（0.89～0.97），表明Langmuir 吸附等溫模型更適用于HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)蛋白結(jié)合類毒素（PCS 和IAA）的吸附.通常，Langmuir 吸附等溫方程假定吸附是單層吸附且吸附劑表面達(dá)到吸附飽和后，吸附量達(dá)到最大值.由此可認(rèn)為，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)蛋白結(jié)合類毒素（PCS和IAA）的吸附是一個(gè)單層表面吸附過程，且當(dāng)樹脂表面吸附達(dá)到最大值時(shí)，吸附過程達(dá)到飽和.從非線性Langmuir吸附等溫方程擬合結(jié)果可知，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PCS 和IAA 的最大吸附量可分別達(dá)到75.78 和137.92 mg/g.另外，從圖8和表2可看出，用Freundlich吸附模型擬合的結(jié)果也較好，且KF和n值均大于1，說明HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PCS和IAA有較強(qiáng)的親和吸附能力［28］.

Fig.8 Adsorption isotherms of HCP(St-DVB-VMZ)for PBUT

Table 2 Adsorption isotherm parameters of HCP(St-DVB-VMZ)towards PBUT

為進(jìn)一步研究HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附動(dòng)力學(xué)，在模擬人體體溫（37 ℃）條件下，分別用100 mg/L的PCS和IAA的PBS溶液進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，測定不同時(shí)間吸附溶液中毒素的剩余濃度，計(jì)算吸附量qt隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖9（A）所示.從圖9（A）可以看出，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)IAA和PCS的吸附都較快，大約在60 min時(shí)吸附已接近峰值；此后隨著時(shí)間的繼續(xù)延長，樹脂對(duì)IAA 的吸附量呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢.

根據(jù)HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PCS和IAA的吸附結(jié)果，分別采用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程［式（8）］和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程［式（9）］對(duì)其吸附過程進(jìn)行擬合［29，30］.

式中：qe和qt（mg/g）分別為平衡時(shí)刻及t時(shí)刻下HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附量；qe，cal，1和qe，cal，2（mg/g）分別為經(jīng)過擬合方程計(jì)算得到的平衡吸附量；k1（min）為準(zhǔn)一級(jí)方程的吸附速率常數(shù)，以ln（qe-qt）對(duì)t作圖，根據(jù)擬合圖的斜率得到k1值；k2（g·mg-1·min-1）為準(zhǔn)二級(jí)方程的吸附速率常數(shù)，以t/qt對(duì)t作圖，根據(jù)斜率及截距分別得到qe，cal，2及k2.

圖9（B）和9（C）分別為準(zhǔn)一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程和準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程的擬合曲線，擬合參數(shù)列于表3.由表3可知，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合的R2均大于準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2.此外，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合得到的HCP（St-DVB-VMZ）樹脂對(duì)PCS 和IAA 的平衡吸附量（qe）分別為21.35 和26.75 mg/g，與實(shí)驗(yàn)所得的平衡吸附量值21.56 和27.2 mg/g 比較接近，說明準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合方程更適用于描述HCP（St-DVB-VMZ）樹脂對(duì)PCS和IAA的吸附過程.由此可以看出，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PCS和IAA的吸附不僅受濃度因素的影響，還受活性位點(diǎn)的影響，即HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PCS和IAA的吸附更偏向于化學(xué)吸附.

Fig.9 Adsorption kinetics of HCP(St-DVB-VMZ)for PBUT

Table 3 Adsorption kinetic parameters of HCP(St-DVB-VMZ)towards PBUT

2.6 樹脂對(duì)蛋白的吸附性能

“材料-毒素-蛋白”三者之間的相互作用影響并決定吸附劑的PBUT 特異性吸附性能和血液相容性.當(dāng)材料與血液接觸后，首先發(fā)生蛋白分子在材料表面的非特異性吸附，其在凝血和免疫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，進(jìn)而影響材料的血液相容性［31］.材料對(duì)血漿蛋白的吸附能力如圖10所示.從圖10可以看出，經(jīng)過2 h 的接觸吸附后，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)血漿總蛋白（Total protein）和血漿白蛋白（Albumin）的吸附率分別為（4.3±0.7）%和（3.8±0.8）%，略低于HA130樹脂對(duì)蛋白的吸附率.這可歸因于HCP（St-DVB-VMZ）材料內(nèi)部引入了咪唑等基團(tuán)，親水性提高有助于降低對(duì)蛋白的吸附率，提高材料的血液相容性.在血漿中，由材料對(duì)蛋白結(jié)合類毒素（圖7）和蛋白（圖10）的吸附結(jié)果可以看到，盡管PBUT和蛋白之間具有較高的結(jié)合率，但HCP（St-DVB-VMZ）仍表現(xiàn)出較高的PBUT吸附率（≥80%）和較低的蛋白吸附率（≤5%），這表明HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PBUT具有較好的特異選擇性吸附能力.

Fig.10 Calculated adsorption rate of total protein(A) and albumin(B) from human plasma on different adsorbents

基于以上的數(shù)據(jù)和判斷，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附過程可通過Scheme 2 表示［32］.在PBUT的蛋白溶液中，蛋白與毒素之間的結(jié)合和解離存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，使得溶液中同時(shí)存在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的PBUT，由于蛋白與毒素之間具有較高的結(jié)合率，導(dǎo)致溶液中結(jié)合態(tài)的毒素濃度明顯高于游離態(tài)的毒素.當(dāng)向溶液中加入HCP（St-DVB-VMZ）吸附劑后，在材料多孔結(jié)構(gòu)和材料表面基團(tuán)（咪唑基團(tuán)等）與毒素分子之間氫鍵及靜電吸附等作用的協(xié)同作用下，游離態(tài)的PBUT分子逐漸被樹脂競爭吸附.同時(shí)，為維持毒素“解離-結(jié)合”平衡，新的毒素分子陸續(xù)從蛋白-毒素復(fù)合物（Protein-PBUT complex）中解離出來，隨著時(shí)間的延長，這個(gè)過程不斷進(jìn)行直到達(dá)到吸附平衡.

Scheme 2 A possible adsorption process of PBUT onto HCP(St-DVB-VMZ)

2.7 樹脂的血液相容性

在全血灌流治療過程中，吸附樹脂會(huì)與血液直接接觸，如果材料對(duì)體內(nèi)血液的溶血作用超過規(guī)定的限度，就會(huì)造成安全性問題，故通常采用測定紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離程度的溶血實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)吸附材料的血液相容性［33］.材料的溶血實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果如圖11所示.可以看出，HCP（St-DVB-VMZ）吸附劑的溶血率為（1.2±0.5）%，與現(xiàn)有商用全血灌流吸附劑樹脂HA130的溶血率處于同一水平，均低于GB/T16886.4規(guī)定的醫(yī)用制品溶血率不大于5%的要求，說明HCP（St-DVB-VMZ）吸附劑對(duì)血細(xì)胞的破壞作用比較微弱，展示出較好的血液相容性.

Fig.11 Hemolysis ratios of the controls and adsorbents

Fig.12 Recalcification time of the controls and adsorbents

通過富血小板血漿的復(fù)鈣時(shí)間實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)吸附樹脂對(duì)凝血激活效果的影響，該方法可同時(shí)反映材料對(duì)凝血酶原和血小板的激活，具有較高的靈敏度［34］.在復(fù)鈣時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)樣品與血漿孵育后，血漿中的凝血因子FXII和血小板被不同程度地活化.加入氯化鈣溶液之后，內(nèi)源性凝血途徑啟動(dòng)，大量血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，使得血漿凝固成凝膠狀，樣品與血漿接觸時(shí)激活程度越高，血漿凝固時(shí)間越短.由圖12可見，陽性樣品最先凝固，計(jì)時(shí)開始后3～4 min即出現(xiàn)凝膠并快速凝固；未加入樹脂材料的血漿體系陰性對(duì)照樣的復(fù)鈣時(shí)間可達(dá)18～20 min；而加入HCP（St-DVB-VMZ）樹脂和HA130樹脂的血漿體系的復(fù)鈣時(shí)間分別為（15.0±0.5）min 和（14.0±1.0）min.這2種樹脂均表現(xiàn)出較好的抗凝血性能.

3 結(jié) 論

通過小分子外交聯(lián)劑的一步法傅克烷基化后交聯(lián)反應(yīng)，成功制備了含咪唑基的超高交聯(lián)聚苯乙烯多孔吸附樹脂HCP（St-DVB-VMZ）.該吸附樹脂具有多級(jí)層次分布的三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其總比表面積和微孔比表面積分別高達(dá)709 和481 m2/g.在BSA 和人血漿環(huán)境中，HCP（St-DVB-VMZ）可有效競爭吸附IS，PCS 和IAA，吸附率介于80%～96%之間，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有商品灌流器樹脂HA130；通過熱力學(xué)等溫線和動(dòng)力學(xué)曲線及其模擬分析可知，HCP（St-DVB-VMZ）對(duì)PCS和IAA的吸附過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，更適合于Langmuir吸附等溫模型，表明其對(duì)蛋白結(jié)合類毒素的吸附是一個(gè)由化學(xué)吸附控制的單層表面吸附過程.此外，HCP（St-DVB-VMZ）還對(duì)血液中的大分子毒素（PTH，β2M和IL-6）表現(xiàn)出較好的吸附效果，與HA130樹脂的吸附能力相當(dāng)；且具有較低的蛋白吸附率和溶血率及較好的血液相容性.

本文開發(fā)的功能性超高交聯(lián)聚苯乙烯樹脂的制備方法綠色、高效，可望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化制備.這為各種新型聚苯乙烯型血液灌流樹脂的改進(jìn)提供了借鑒和參考；也可促進(jìn)具有高效清除尿毒癥毒素的血液灌流吸附材料的發(fā)展與實(shí)際應(yīng)用.