水溶性近紅外Ⅱ區(qū)熒光Ag2Te量子點(diǎn)的合成

周潔瓊，黃 艷，張志凌，龐代文，田智全

（武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢 430072）

量子點(diǎn)（QDs）由于其一元激發(fā)多元發(fā)射、耐光漂和量子產(chǎn)率高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［1～3］.近紅外窗口熒光，特別是近紅外Ⅱ區(qū)（NIR-Ⅱ區(qū)，1000～1700 nm［4］）窗口熒光，在生物組織及血液中的散射和衰減系數(shù)明顯降低，且受生物組織自發(fā)熒光的干擾顯著減弱，因此近紅外Ⅱ區(qū)量子點(diǎn)在活體成像時(shí)具有更深的穿透深度，能極大提高成像信號的信噪比，在活體成像應(yīng)用方面具有明顯的優(yōu)勢［5～7］.

Ⅰ-Ⅵ族量子點(diǎn)作為近紅外量子點(diǎn)家族中的一員，具有帶隙窄和不含有毒重金屬元素等優(yōu)勢，引起了研究者的廣泛關(guān)注.已有研究［8～14］表明，Ⅰ-Ⅵ族量子點(diǎn)生物毒性小，應(yīng)用前景大.Ⅰ-Ⅵ族量子點(diǎn)帶隙分別為：Ag2Te（0.06 eV），Ag2S（0.93 eV），Ag2Se（0.15 eV）［15，16］，其中Ag2Te帶隙最窄，說明其熒光發(fā)射波長理論上能調(diào)節(jié)至更長的波段.當(dāng)溫度較低時(shí)，Ag2Te 半導(dǎo)體材料表現(xiàn)為單斜相（β-Ag2Te）；當(dāng)溫度升高至150 ℃時(shí)，則會轉(zhuǎn)化為面心立方相（α-Ag2Te）［17］.

目前，Ag2Te量子點(diǎn)的合成主要有油相合成［18］和水相合成［19］2類方法.油相合成法可以將波長調(diào)至NIR-Ⅱb 區(qū)［20］，但是要求嚴(yán)格的無氧條件，需要用到三正辛基膦（TOP）等有毒、價(jià)格昂貴的試劑［8，21，22］，且必須經(jīng)過水溶性修飾才能進(jìn)一步應(yīng)用.目前，水溶性Ag2Te量子點(diǎn)的研究較少.Yang等［23］采用多齒巰基為配體，制得發(fā)射波長為995～1068 nm的Ag2Te量子點(diǎn).Jin等［24］以十二烷胺為配體制備Ag2Te量子點(diǎn)，所得產(chǎn)物發(fā)射波長的調(diào)節(jié)范圍為930～1084 nm.Dong等［25］通過牛血清白蛋白生物礦化策略制備了熒光發(fā)射波長為1080 nm的多功能Ag2Te量子點(diǎn)，用于CT成像引導(dǎo)的腫瘤光熱治療.Chen等［26］利用陽離子交換法制備了水溶性Ag2Te量子點(diǎn)，但這是一種間接的合成方法，其過程較為復(fù)雜.然而，以上研究都是通過包覆殼層的方法來提高量子產(chǎn)率，不可避免地會增加其粒徑，從而限制其在生物體系中的進(jìn)一步應(yīng)用.綜上所述，水溶性Ag2Te 量子點(diǎn)的直接合成還處于萌芽階段，且發(fā)射波長在1100 nm 以下.因此，開展直接合成熒光發(fā)射波長更長的水溶性Ag2Te量子點(diǎn)的研究具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.本文在25 ℃及大氣氛圍條件下，以硝酸銀為銀源，N-乙酰-L-半胱氨酸為配體，利用硼氫化鈉還原亞碲酸鈉得到碲源，結(jié)合陽離子處理策略，簡單、便捷地制備了發(fā)射波長為1160 nm的水溶性Ag2Te量子點(diǎn)（Scheme 1），其量子產(chǎn)率高達(dá)8.0%（以IR26染料為參比），且該量子點(diǎn)具有良好的生物相容性，可用于生物體內(nèi)活體成像.

Scheme 1 Strategy for preparing Ag2Te QDs with high quantum yield by cation handled

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀（AgNO3，純度99.8%）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，純度99%）和亞碲酸鈉（Na2TeO3，純度99.9%）購自Aladdin公司；硼氫化鈉（NaBH4）、氫氧化鈉（NaOH）、濃硝酸（HNO3）、1，2-二氯乙烷（DCE）和雙氧水（H2O2）均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)公司；IR26染料（C40H30Cl2O4S2）購自Extion 公司；吲哚菁綠（ICG，C43H47N2NaO6S2，純度90%）購自Sigma Aldrich公司.以上試劑均直接使用，未經(jīng)過進(jìn)一步純化；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率18 MΩ·cm）.

透射電子顯微照片和高分辨透射電子顯微照片通過JEOL 公司JEM2100-JEOL 型透射電子顯微鏡（TEM，200 kV）得到；采用Nano ZS ZEN3600型納米粒度及表面電位分析儀（Malvern公司）測量材料的水合粒徑；利用D8型X射線衍射儀（XRD，Bruker AXS公司）獲得元素的X射線衍射圖譜；XPS圖譜通過ESCALAB250Xi 型X 射線光電子能譜儀（XPS，Thermo Fisher Scientific 公司）表征得到；通過IRIS Intrepid II XSP型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES，Thermo Elemental公司）對元素含量進(jìn)行定量分析；采用UV-3600型紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)（日本Shimadzu 公司）和Fluorolog-3型熒光分光光度計(jì)（HORIBA Jobin Yvon 公司）分別測量紫外-可見-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜；利用配備了OMA-V 型近紅外檢測器（InGaAs，Princeton 公司）的10×Mitutoyo Plan Apo 型近紅外Ⅱ區(qū)小動物活體成像儀（Edmund Optics 公司）對小鼠或者材料進(jìn)行近紅外熒光成像；iS50 型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Nicolet公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 水溶性NIR-Ⅱ區(qū)Ag2Te量子點(diǎn)的合成 在10.0 mL反應(yīng)體系中，先加入100 μL 0.624 mol/L 硝酸銀溶液和500 μL 0.150 mol/LN-乙酰-L-半胱氨酸溶液，攪拌后加入150 μL 1.00 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，得到澄清透明溶液，再依次加入500 μL 0.0620 mol/L 亞碲酸鈉溶液和0.0013 g硼氫化鈉，攪拌后得到棕黑色的溶液.

1.2.2 陽離子處理 按摩爾比為1∶1.25 將硝酸銀溶液與N-乙酰-L-半胱氨酸溶液混合，調(diào)節(jié)pH 至7～8，得到澄清透明溶液.將上述溶液滴入量子點(diǎn)溶液中，振蕩.

1.2.3 量子點(diǎn)的洗滌與保存 先使用220 nm 尼龍水系濾頭過濾除去灰塵等雜質(zhì)，再用10 kDa 超濾管超濾洗滌量子點(diǎn)，并將純化的量子點(diǎn)保存在4 ℃低溫環(huán)境中，待用.

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag2Te QDs的形貌及結(jié)構(gòu)

對最終產(chǎn)物進(jìn)行了一系列表征實(shí)驗(yàn).TEM和HRTEM照片如圖1所示，從TEM照片［圖1（A）］可以看出，產(chǎn)物形狀為球形，粒徑分布均勻；由HRTEM照片［圖1（B）］可觀察到材料明顯的晶格，晶格間距為0.196 nm，與單斜相Ag2Te（2ˉ21）晶面吻合.

Fig.1 TEM(A)and HRTEM(B)images of Ag2Te QDs

圖2為產(chǎn)物的粒徑統(tǒng)計(jì)圖，通過統(tǒng)計(jì)250個顆粒的粒徑，得出其平均粒徑為（1.6±0.4）nm.利用納米粒度分析儀測得產(chǎn)物的水合粒徑為4.3 nm（圖3），結(jié)合統(tǒng)計(jì)得出的產(chǎn)物的平均粒徑，說明產(chǎn)物具有超小粒徑.量子點(diǎn)的X 射線衍射譜圖如圖4 所示，雖然未觀察到明顯的衍射峰信號，但仍可看出其衍射譜圖與單斜相β-Ag2Te晶體（JCPDS 81-1820）基本吻合，與已報(bào)道的銀系（Ag2X，X=S，Se，Te）量子點(diǎn)的X 射線衍射表征結(jié)果一致［27］.

Fig.2 Size distribution of Ag2Te QDs

Fig.3 Hydrodynamic diameter characterization of QDs

Fig.4 Powder XRD pattern of QDs

利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀和X 射線光電子能譜儀分析了產(chǎn)物的元素組成.圖5為量子點(diǎn)的XPS譜圖，以C1s的結(jié)合能（284.8 eV）為基準(zhǔn)，對各元素的結(jié)合能進(jìn)行校準(zhǔn).通過對樣品進(jìn)行全掃描可得到全譜圖，根據(jù)圖5（A）所示結(jié)合能的數(shù)值可以判斷產(chǎn)物中含有Ag，Te，S，C，O和N元素.再對樣品進(jìn)行窄區(qū)掃描，得到XPS高分辨譜圖，如圖5（B）～（E）所示，通過對比結(jié)合能數(shù)值，并結(jié)合自旋軌道偶合分裂譜線的特點(diǎn)來判斷元素的價(jià)態(tài)和化學(xué)環(huán)境.其中，373.9和367.8 eV處的能譜峰分別歸屬于+1價(jià)Ag元素3d3/2和3d5/2的特征譜線［圖5（B）］，582.6和572.3 eV處的能譜峰分別歸屬于-2價(jià)Te元素3d3/2和3d5/2的特征譜線［圖5（C）］，說明Ag和Te分別以+1價(jià)和-2價(jià)的形式存在［8，21］.由于游離巰基的結(jié)合能約為164 eV［28～30］，因此162.1和161.2 eV處的能譜峰可分別歸屬于硫與金屬鍵合后S2p1/2和S2p3/2的特征譜線［圖5（D）］，這說明產(chǎn)物是以NAC為配體，并且NAC中的巰基是與銀進(jìn)行配位的.C1s的結(jié)合能可擬合成2 個峰，分別為284.8 和287.9 eV［圖5（E）］.其中，284.8 eV 處的峰歸屬于亞甲基中的碳元素，287.9 eV處的峰歸屬為C=O中的碳元素［13，31］，這說明NAC中的羧基是裸露的，因此產(chǎn)物可以穩(wěn)定地分散于水溶液中.此外，利用ICP-AES對元素含量進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，經(jīng)陽離子處理前后，Ag/Te物質(zhì)的量之比分別為2.7∶1和5.4∶1，說明經(jīng)陽離子處理后Ag含量顯著增加，符合預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.需要指出的是，經(jīng)陽離子處理前后Ag/Te比均高于其化學(xué)計(jì)量數(shù)之比，這可能是由于Ag2Te量子點(diǎn)的粒徑太小，因此比表面積大，其表面大量的銀原子與巰基結(jié)合導(dǎo)致的［32，33］.

Fig.5 XPS survey(A),high-resolution XPS spectra of Ag3d(B),Te3d(C),S2p(D)and C1s(E)of Ag2Te QDs

圖6給出N-乙酰-L-半胱氨酸配體和產(chǎn)物的紅外光譜.可見二者的紅外光譜存在顯著差別.其中，N-乙酰-L-半胱氨酸在2552 cm-1處有明顯的吸收峰，歸屬為游離巰基的特征吸收峰；而在Ag2Te 量子點(diǎn)中并未出現(xiàn)游離巰基的特征吸收峰，且在1640和1400 cm-1處可觀察到明顯的吸收峰，歸屬于羧酸根的特征吸收峰［11］.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，Ag2Te量子點(diǎn)以N-乙酰-L-半胱氨酸為配體，且配體中的巰基與銀發(fā)生了配位，配體中的羧基是裸露的.這與X射線光電子能譜儀表征結(jié)果相吻合.

Fig.6 FTIR spectra of NAC(a)and Ag2Te QDs(b)

2.2 Ag2Te QDs的光學(xué)性質(zhì)

Fig.7 Normalized fluorescence emission spectra(A),absorption spectra(B) and fluorescence emission spectra(C)of QDs

對陽離子處理前后產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜與紫外-可見-近紅外吸收光譜進(jìn)行了測定.圖7（A）為產(chǎn)物的歸一化熒光發(fā)射光譜，圖7（B）為產(chǎn)物的紫外-可見-近紅外吸收光譜，圖7（C）為產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜.圖7（A）中，陽離子處理前產(chǎn)物的發(fā)射峰位于1289 nm，經(jīng)陽離子處理后，產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長為1160 nm.圖7（B）中，經(jīng)陽離子處理前后，產(chǎn)物的吸收峰分別位于1026和1013 nm.圖7（C）中，經(jīng)陽離子處理后，產(chǎn)物熒光強(qiáng)度顯著增加，約為處理前的6.2倍.與處理前相比，經(jīng)陽離子處理后產(chǎn)物的吸收峰和發(fā)射峰均出現(xiàn)藍(lán)移，這是因?yàn)殛栯x子的加入鈍化了產(chǎn)物的表面缺陷，抑制了缺陷發(fā)光，從而使光譜發(fā)生藍(lán)移且熒光增強(qiáng)［32，34］.圖8（A）為利用近紅外Ⅱ區(qū)小動物活體成像儀獲得的產(chǎn)物近紅外成像圖，圖8（B）是用手機(jī)拍攝的數(shù)碼照片.樣品Ⅰ指陽離子處理前的產(chǎn)物，樣品Ⅱ指陽離子處理后的產(chǎn)物，二者濃度相同.從圖8可以看出，樣品Ⅱ的熒光性能顯著優(yōu)于樣品Ⅰ，與其熒光光譜圖結(jié)果相吻合，說明陽離子處理可增強(qiáng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度.以分散在1，2-二氯乙烷中的IR26染料（量子產(chǎn)率為0.5%［20，26］）為參照，測得經(jīng)陽離子處理后產(chǎn)物的量子產(chǎn)率高達(dá)8.0%，高于之前的部分報(bào)道［20，21，26］.綜上，所合成產(chǎn)物為粒徑均一且分散性好的超小粒徑Ag2Te量子點(diǎn)，具有進(jìn)一步生物應(yīng)用的潛能.

Fig.8 NIR-ⅡFL image(A)and digital photograph(B)of QDs samples

2.3 Ag2Te QDs的穩(wěn)定性

Fig.9 Photostability of Ag2Te QDs(A),stabilities of Ag2Te QDs in PBS and FBS(B)，at different temperatures(4 ℃,25 ℃and 37 ℃)(C,D)and in BR buffers with different pH values(pH=2,5,7,9,12)(E,F)

以50 W汞燈為光源，將Ag2Te量子點(diǎn)和ICG染料共同置于汞燈下照射不同時(shí)間后，分別測定其熒光光譜，重復(fù)3 次，得到Ag2Te 量子點(diǎn)的光照穩(wěn)定性結(jié)果.如圖9（A）所示，相比于ICG 染料，制備的Ag2Te量子點(diǎn)具有良好的光穩(wěn)定性，當(dāng)汞燈照射100 min時(shí)，ICG染料的熒光降為原來的約30%，而量子點(diǎn)的熒光則保持原來的86%，說明量子點(diǎn)具有較好的光穩(wěn)定性，與之前報(bào)道的油相合成的Ag2Te 量子點(diǎn)穩(wěn)定性相當(dāng)［8］.此外，還考察了制備的Ag2Te量子點(diǎn)在不同介質(zhì)、不同溫度及不同pH值下的穩(wěn)定性.將Ag2Te 量子點(diǎn)分別分散在1×PBS 緩沖液和未稀釋的胎牛血清（FBS）中，結(jié)果如圖9（B）所示，可見Ag2Te 量子點(diǎn)在PBS 緩沖液中有較好的穩(wěn)定性；在未稀釋的胎牛血清中，Ag2Te 量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度為PBS緩沖液中熒光強(qiáng)度的60%，且具有較好的穩(wěn)定性.由于未稀釋的胎牛血清中含有大量的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，量子點(diǎn)容易被吸附［35］，導(dǎo)致量子點(diǎn)團(tuán)聚，熒光強(qiáng)度下降.圖9（C）為將Ag2Te 量子點(diǎn)分別保存于4，25 和37 ℃時(shí)獲得的量子點(diǎn)的初始熒光強(qiáng)度對比圖；圖9（D）為分別將Ag2Te 量子點(diǎn)在4，25 和37 ℃下保存不同時(shí)間獲得的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化圖.可見，將Ag2Te量子點(diǎn)保存于不同溫度時(shí)，其初始熒光強(qiáng)度幾乎不變；在不同溫度保存時(shí)間長達(dá)60 h時(shí)，Ag2Te量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均無明顯變化，說明量子點(diǎn)在不同溫度下具有良好的穩(wěn)定性.圖9（E）為分別將Ag2Te量子點(diǎn)保存在不同pH值（pH=2，5，7，9，12）的BR緩沖溶液中獲得的量子點(diǎn)初始熒光強(qiáng)度對比圖；圖9（F）為分別將Ag2Te量子點(diǎn)在不同pH值的BR緩沖溶液中保存不同時(shí)間獲得的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化圖.可見，量子點(diǎn)在不同pH值下也具有良好的穩(wěn)定性.將Ag2Te量子點(diǎn)保存在不同pH值的環(huán)境中，初始時(shí)其熒光強(qiáng)度無明顯變化，但是隨著時(shí)間的延長，在酸性較強(qiáng)（pH=2）的環(huán)境中保存60 h時(shí)，其熒光強(qiáng)度下降至之前的約80%，這可能是因?yàn)樗嵝暂^強(qiáng)時(shí)，量子點(diǎn)易發(fā)生團(tuán)聚，使其熒光強(qiáng)度降低［36］.在弱酸性、中性及堿性環(huán)境中保存時(shí)，量子點(diǎn)均能較好地保持其熒光.綜上，制備的Ag2Te量子點(diǎn)具有良好的穩(wěn)定性，有利于其進(jìn)一步應(yīng)用.

2.4 Ag2Te QDs的毒性

研究表明，不含Cd等重金屬元素的量子點(diǎn)具有較低的生物毒性［37］.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測了Ag2Te量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性.由圖10可見，在5 個不同Ag2Te 量子點(diǎn)濃度（0，27，53，110 和220 nmol/L）下，將MDCK 細(xì)胞與Ag2Te 量子點(diǎn)共孵育48 h 后，細(xì)胞仍具有較好的活性.即使孵育時(shí)間長達(dá)48 h（含Pb量子點(diǎn)孵育時(shí)間通常為12 h［38］），濃度高達(dá)220 nmol/L 時(shí)，細(xì)胞仍能維持94%的活性，與其它Ag 系材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近［11］，說明合成的Ag2Te 量子點(diǎn)具有良好的生物相容性，有望在生物體系中進(jìn)一步應(yīng)用.

Fig.10 Cell viabilities of MDCK cells incubated with Ag2Te QDs after cation handled for 48 h at various concentrations(0,27,53,110 and 220 nmol/L)

2.5 Ag2Te QDs的體內(nèi)近紅外熒光成像

Fig.11 In vivo NIR-Ⅱfluorescence images after tail vein injection of Ag2Te QDs

基于水溶性Ag2Te量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光性能，考察了其用于活體內(nèi)近紅外熒光成像的可行性.所用老鼠為6周齡的balb/c雌鼠，通過尾靜脈注射將200 μL 0.069 mmol/L Ag2Te量子點(diǎn)注入小鼠體內(nèi)，利用近紅外Ⅱ區(qū)小動物活體成像儀對小鼠成像.圖11（A）為未注射量子點(diǎn)的小鼠成像圖；圖11（B）～（D）為注射量子點(diǎn)后不同方位的小鼠成像圖.可見，小鼠的肝臟［圖11（B）-1和（D）-1］、膀胱［圖11（B）-2］及脾臟［圖11（C）-3 和（D）-3］有明顯的近紅外熒光，并且從背部［圖11（C）］也可觀察到明顯的近紅外熒光，說明Ag2Te量子點(diǎn)的近紅外熒光可以穿透小鼠的整個身體，具有較深的成像深度，能提高成像信噪比［12］，有望用于高分辨活體成像.

3 結(jié) 論

在室溫下制備了熒光發(fā)射波長為1160 nm 的水溶性Ag2Te 量子點(diǎn)，采用的陽離子處理策略可以鈍化量子點(diǎn)的表面缺陷并提高其量子產(chǎn)率；以分散在1，2-二氯乙烷的IR26染料為參照，測得其量子產(chǎn)率為8.0%.CCK-8法和活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ag2Te量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性低、生物相容性好，可用于活體熒光成像.該合成方法條件溫和、易于操作、不涉及有毒有機(jī)試劑，為量子點(diǎn)的合成提供了新思路.在活體成像及納米生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景.