艷山姜葉片和果實化學成分預試驗及總黃酮含量測定

吳芳 李莉 黃彭 邸陽陽 嫣珍 魏琴

摘要?[目的]研究艷山姜葉片和果實所含的化學成分，并測定葉片和果實中總黃酮的含量。[方法]采用系統(tǒng)預試驗法對艷山姜葉片和果實的水、95%乙醇、石油醚提取液進行化學成分研究;以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測定艷山姜葉片和果實中總黃酮的含量。[結果]艷山姜葉片和果實中均含有酚類、鞣質、有機酸、甾體、三萜以及揮發(fā)油、總黃酮;葉片中可能含生物堿，果實中不含生物堿;葉片和果實中不含皂苷，葉片和果實中總黃酮含量分別為13.05、11.98 mg/g。[結論]該研究初步確定了艷山姜葉片和果實中化學成分類型并測定了總黃酮含量，可為進一步研究其活性成分的提取分離及探索其化學成分與藥理活性之間的關系奠定基礎。

關鍵詞?艷山姜;葉片和果實;化學成分;預試驗;總黃酮含量

中圖分類號?R284?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）09-0172-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.046

Abstract?[Objective]To study the chemical components of leaves and fruits of Alpinia zerumbet，and to determine the content of total flavonoids in leaves and fruits.[Method]The extraction of leaves and fruits with water，95% ethanol and petrol ether was respectively experimented by comprehensive preliminary tests.Using rutin as substance control，the contents of total flavonoids in leaves and fruits were measured by colorimetric method with sodium nitrite-aluminum nitrate-sodium hydroxide.[Result]The leaves and fruits of Alpinia zerumbet contained phenols，tannins，organic acids，steroids，triterpenoids，volatile oils and total flavonoids.There may be alkaloids in leaves but no in fruits.Saponins were not found in leaves and fruits.The contents of total flavonoids in leaves and fruits were 13.05 and 11.98 mg/g，respectively.[Conclusion]This study initially determines the types of chemical components in the leaves and fruits of Alpinia zerumbet，and determines the content of total flavonoids，which can lay a foundation for further research on the extraction and separation of its active components and the exploration of the relationship between its chemical components and pharmacological activities.

Key words?Alpinia zerumbet;Leveas and fruits;Chemical components;Preliminary tests;Content of total flavonoids

艷山姜[Alpinia zerumbet（pers.）]，是姜科（Zingiberaceae）山姜素屬（Alpinia Roxb.）植物，廣布于我國南方各省區(qū)，是民間用于驅寒暖胃的良藥[1];其果實具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧的功效[2]，我國許多地區(qū)習用果實及根莖入藥，而葉片常被廢置丟棄。艷山姜的葉在巴西作為一種藥茶在民間使用，具有降低血壓、利尿和抗?jié)兊淖饔肹3]，國外也有對艷山姜葉揮發(fā)油應用研究的報道[4]。目前國內對于艷山姜揮發(fā)油成分研究較多[5-6]，對艷山姜化學組成的系統(tǒng)研究還比較缺乏。該研究對該植物果實和葉片中化學成分進行系統(tǒng)預試驗，為其化學成分的系統(tǒng)研究和有效成分的分離奠定基礎。

黃酮類化合物是一類天然的抗氧化劑，不僅具有很強地清除自由基的能力，而且在抗衰老、抗血栓、降血壓、降血脂、 降糖等方面表現(xiàn)出明顯的藥理活性[7]，因此有必要對艷山姜中總黃酮含量進行測定。為明確其化學成分類型，該研究通過預試驗初步探索艷山姜葉片和果實的化學成分類型及差異，并采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測定葉片和果實中總黃酮含量，以期為進一步研究其活性成分的提取分離及探索其化學成分與藥理活性之間的關系提供試驗基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試材。艷山姜葉片和果實，宜賓市屏山縣八一專業(yè)合作社提供。

1.1.2?儀器與設備。SYD-175粉碎機（上海東亞壓力容器制造有限公司）;AL204電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）;DHG-9140A電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雷諾儀器廠）;PHS-3B精密pH計（佑崎有限公司）;T6紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;SY-3000A旋轉蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）;SB-600DTY掃頻超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）;DLSB-5/20 ℃低溫冷卻循環(huán)泵 （鄭州長城科工貿有限公司）。

1.1.3?試劑。

氫氧化鈉、無水乙醇、溴甲酚綠、溴酚藍、碘化汞鉀、碘化鉍鉀、硅鎢酸、濃硫酸、鐵氰化鉀、氯化鉀、三氯化鐵、三氯化鋁、石油醚、鹽酸、氨水均為國產分析純，其他試劑均為自配，水為蒸餾水。蘆丁標準品（98%），貴州迪大科技有限責任公司。

1.2?化學成分預試驗

取艷山姜葉片和果實適量，分別置60 ℃烘箱干燥4 h，經粉碎機粉碎，過40目篩備用。具體供試品溶液的制備方法如下：

（1）水供試液。分別取葉片和果實樣品粗粉10 g，加水100 mL，冷浸24 h，濾過，棄濾液。濾渣在60 ℃水浴下加熱30 min，濾過，取濾液進行有機酸、皂苷、酚類及鞣質等的檢查。

（2）乙醇供試液。分別取葉片和果實部位樣品粗粉30 g，加95%乙醇300 mL，60 ℃水浴回流1 h，濾過，濾液濃縮至浸膏狀（葉提取液加入蒸餾水使其含醇量為70%，放冷后濾過，濾液用等量石油醚分別萃取2次，以除去葉綠素等）。將濃縮好的樣品分為2份：①1/3量加10 mL乙醇溶解，制成醇溶液，進行酚類和鞣質、有機酸、總黃酮、甾體及三萜的檢查;②剩下2/3量加鹽酸20 mL，充分攪拌，濾過，溶于鹽酸的部分進行生物堿的檢查。

（3）石油醚供試液。分別取葉片和果實樣品粗粉10 g，加入100 mL石油醚（沸程60～90 ℃），室溫密封放置3 h后抽濾，濾液濃縮后進行甾體及三萜、揮發(fā)油的檢查。

1.3?總黃酮含量的測定

1.3.1?供試品溶液的制備。

精密稱取樣品粗粉5 g，置錐形瓶中，加入100 mL 70%乙醇，70 ℃恒溫回流5 h，濾過，得乙醇提取液，用70%乙醇溶液定容至100 mL，即得。采用鹽酸-鎂粉試驗、三氯化鋁試驗和氨熏試驗檢查黃酮成分。

1.3.2?標準品溶液的制備。精密稱取蘆丁標準品20 mg，置于100 mL容量瓶中，加 70%乙醇溶解并定容，搖勻，得200 μg/mL的標準品溶液。

1.3.3?標準曲線的繪制。

參考孫玉婉等[8]方法進行。精密移取標準品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，各加入0.3 mL 5% NaNO2搖勻，放置6 min，再加入0.3 mL 10% Al（NO3）3搖勻，放置6 min，最后加入4 mL 4% NaOH、0.4 mL 蒸餾水，70%乙醇定容至10 mL，放置15 min。于500 nm波長處測定吸光度，以對照樣品加入量為0 mL的溶液作空白對照。以蘆丁標準品溶液的質量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，求出回歸方程。

1.3.4?總黃酮含量的測定。根據(jù)標準曲線回歸方程，計算總黃酮含量。按以下公式計算：

式中，C為根據(jù)回歸方程計算得到的總黃酮濃度（mg/mL），10為測定時定容體積（mL），Va為提取液的總體積（mL），Vb為測定時所用體積（mL），M為稱取的樣品質量（g）。

2?結果與分析

2.1?化學成分系統(tǒng)預試驗結果

水供試液、95%乙醇供試液和石油醚供試液的預試驗結果見表1。根據(jù)預試驗結果，若檢查某類成分的結果為正反應，則初步判斷艷山姜葉片或果實含有某類成分;若部分為正反應或成分干擾導致結果難以判斷，則判斷可能含有某類成分;若均為負反應，則判斷不含某類成分。綜合表1結果，艷山姜葉片和果實中所含有的成分有一定的差異。酚類和鞣質、有機酸反應都為陽性，且正反應現(xiàn)象明顯，說明艷山姜葉片和果實中均含有酚類和鞣質以及有機酸;葉片和果實中總黃酮的反應均為強陽性，說明艷山姜葉片和果實中含總黃酮;葉片中生物堿的碘化汞鉀反應為陰性、碘化鉍鉀和碘-碘化鉀反應為陽性，果實中生物堿的反應均為陰性，說明葉片中可能含生物堿，果實中不含生物堿;皂苷檢測反應均為陰性，說明艷山姜葉片和果實中不含皂苷。另外，試驗結果表明，艷山姜葉片和果實中有甾體和三萜以及揮發(fā)油。

2.2?總黃酮含量測定?采用比色法測定艷山姜葉片和果實中總黃酮含量，根據(jù)蘆丁標準曲線（圖1），得回歸方程A=7.123 8C-0.026 7（R2=0.999 9），蘆丁標準品溶液在0.01～0.10 mg/mL線性關系良好，可根據(jù)樣品吸光度，利用該回歸方程，計算出樣品總黃酮的質量濃度。根據(jù)回歸方程，得到葉片和果實樣品中總黃酮的平均質量濃度分別為0.089、0.082 mg/mL（n=3）。根據(jù)公式（1）計算，葉片和果實中總黃酮含量分別為13.05、11.98 mg/g。

3?結論與討論

艷山姜傳統(tǒng)藥用部分為其干燥成熟的果實，莖葉常常被丟棄，研究表明，果實中主要含有酚類[9]、黃酮類[10]、甾醇[10]和萜類化合物[11]，莖葉中主要化學成分為黃酮類[12]、酚類[13]、吡喃酮[12-13]、苯丙素類[14]和甾醇[14]。該研究通過對宜賓地區(qū)艷山姜化學成分系統(tǒng)預試驗和總黃酮含量測定發(fā)現(xiàn)，艷山姜葉片和果實中均含有總黃酮、多酚、鞣質、有機酸、甾體和三萜，葉片中可能含有生物堿、果實中不含生物堿，葉片和果實中均不含皂苷。大量研究表明，總黃酮具有明顯的抗脂質過氧化[15]、清除羥自由基、調節(jié)血脂功能及抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗?jié)?、抗病毒、保護心血管疾病和保肝等生理活性[7，16]，是一類極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑。我國對艷山姜的利用主要是果實，其莖葉常被丟棄，若能將艷山姜及其丟棄葉片加以利用，進行艷山姜總黃酮的提取開發(fā)，制成艷山姜抗氧化劑或自由基清除劑，既能豐富市場又可提高艷山姜的綜合利用，具有理想的社會意義和經濟效益。通過該研究，探明了艷山姜總黃酮含量超過1%，具有開發(fā)利用價值，可進一步對艷山姜總黃酮在藥用及食品工業(yè)中的應用展開研究。

參考文獻

[1] 溫遠影，陳燕方，解雪梅.艷山姜中的新二萜化合物[J].植物學報，1997，39（10）：983-984.

[2] 沈祥春，胡涵帥，肖海濤.GC-MS法分析艷山姜根莖、莖、葉及果實等部位揮發(fā)油化學成分[J].藥物分析雜志，2010，30（8）：1399-1403.

[3] 孫備.艷山姜水提物中具有生物活性的黃酮和麻醉椒吡喃酮化合物的分離[J].國外醫(yī)學（中醫(yī)中藥分冊），1999，21（5）：46-47.

[4] DE MOURA R S，EMILIANO A F，DE CARVALHO L C，et al.Antihypertensive and endothelium-dependent vasodilator effects of Alpinia zerumbet，a medical plant[J].J Cardiovasc Pharmacol，2005，46（3）：288-294.

[5] 吳萬征，林煥澤，吳秀榮.艷山姜揮發(fā)油成分的氣相質譜聯(lián)用分析[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2005，25（4）：332-333.

[6] 陶玲，沈祥春，彭佼，等.艷山姜全果及不同部位揮發(fā)油化學成分GC-MS分析[J].中成藥，2009，31（6）：909-911.

[7] 李楠，劉元，侯濱濱.黃酮類化合物的功能特性[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（6）：139-141.

[8] 孫玉婉，汪春牛，韓星，等.瓊欖不同部位化學成分預試驗及總黃酮含量測定[J].中國藥房，2013，24（7）：618-621.

[9]?ELZAAWELY A A，XUAN T D，KOYAMA H，et al.Antioxidant activity and contents of essential oil and phenolic compounds in flowers and seeds of Alpinia zerumbet（Pers.） B.L.Burtt.& R.M.Sm[J].Food Chem，2007，104（4）：1648-1653.

[10] CHOMPOO J，UPADHYAY A，GIMA S，et al.Antiatherogenic properties of acetone extract of Alpinia zerumbet seeds[J].Molecules，2012，17（6）：6237-6248.

[11] XU H X，DONG H，SIM K Y.Labdane diterpenes from Alpinia zerumbet[J].Phytochemistry，1996，42（1）：149-151.

[12] MPALANTINOS M A，SOARES DE MOURA R，PARENTE J P，et al.Biologically active flavonoids and kava pyrones from the aqueous extract of Alpinia zerumbet[J].Phytother Res，1998，12（6）：442-444.

[13] ELZAAWELY A A， XUAN T D，TAWATA S.Essential oils，kava pyrones and phenolic compounds from leaves and rhizomes of Alpinia zerumbet （Pers.） B.L.Burtt.& R.M.Sm.and their antioxidant activity [J].Food Chem，2007，103（2）：486-494.

[14] OBATA T，SAWABE A，MORITA M，et al.Several steroids and phenylpropanoid glycosides isolated from leaves of getto （Alpinia speciosa K.Schum.）[J].J Jpn Oil Chem Soc，1995，44（11）：1012-1014.

[15] BAHORUN T，LUXIMON-RAMMA A，CROZIER A，et al.Total phenol，flavonoid，proanthocyanidin and vitamin C levels and antioxidant activities of Mauritian vegetables[J].J Sci Food Agric，2004，84（12）：1553-1561.

[16] 王楠，劉戰(zhàn)霞，程衛(wèi)東.3種方法提取沙棗黃酮工藝的優(yōu)化研究[J].安徽農業(yè)科學，2018，46（26）：150-155.