靶向心肌組織的新型腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及篩選

陳 晨， 杜增民， 吳 俠， 蔣 威， 趙 陽(yáng)， 肖 嘯， 鄭 靜

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237）

心肌病屬于一組異質(zhì)性心肌疾病，是導(dǎo)致患者過(guò)早死亡的主要原因，常見(jiàn)癥狀為心力衰竭、外周水腫、疲勞、勞累呼吸困難、陣發(fā)性夜間呼吸困難、暈厥和心臟缺血等[1-3]。常規(guī)的治療包括使用β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、手術(shù)治療和外科治療。但是常規(guī)的治療方法預(yù)后不太理想，嚴(yán)重時(shí)更需要進(jìn)行心臟移植[1,4]，治療難度大、風(fēng)險(xiǎn)高，而基因治療的發(fā)展為心肌病持久治療或治愈提供了新的可能。

腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)是目前心臟基因傳遞最有效的載體[5-6]。天然的AAV血清型，例如AAV1、AAV6和AAV9能夠在小鼠靜脈注射后轉(zhuǎn)導(dǎo)到心肌[7-8]，而AAV6直接心肌內(nèi)注射最迅速，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最為高效[9-10]，靜脈注射會(huì)較多地轉(zhuǎn)導(dǎo)到成年小鼠骨骼肌和肝臟中[11-12]。轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中AAV載體會(huì)感染其他組織，AAV6會(huì)感染較多的骨骼肌，AAV9會(huì)大量地感染肝臟，這會(huì)造成不必要的脫靶危險(xiǎn)，所以降低其他組織的特異性十分必要[13-15]。對(duì)于特定的疾病，則需要基因載體在特定的細(xì)胞和組織中表達(dá)，在AAV載體的構(gòu)建中，使用特異性啟動(dòng)子能夠減少AAV載體全身性的表達(dá)，可避免目的基因在細(xì)胞或組織中有害表達(dá)[16]，因此，開(kāi)發(fā)新的能夠靶向心肌的同時(shí)減少非心肌組織感染的AAV載體非常重要，可以減少心肌病基因治療中的副作用[17]。

AAV基因組由rep基因和cap基因以及兩側(cè)的末端重復(fù)序列（ITR）基因構(gòu)成[18]。其中rep基因編碼涉及病毒復(fù)制、包裝和基因組整合的非結(jié)構(gòu)蛋白，而cap基因編碼包括3個(gè)衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3[19]。從人類(lèi)和猴子中分離出的大量AAV血清型和其突變體在不同組織上表現(xiàn)出不同的感染性。AAV血清型特異性的主要決定于受體、輔助受體、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等因素[20-21]，AAV衣殼的特異性為新型AAV載體的研究和篩選打下了基礎(chǔ)[22]。DNA shuffling技術(shù)常用來(lái)做AAV衣殼載體的改造，得到突變體AAV衣殼庫(kù)可以被用來(lái)篩選理想的載體，例如低中和抗體水平[23-24]和特定組織親和性[25]的AAV衣殼。

本研究通過(guò)DNA shuffling技術(shù)和小鼠體內(nèi)篩選技術(shù)設(shè)計(jì)了心肌靶向的AAV衣殼，對(duì)AAV血清型AAV1～AAV4, AAV6～AAV9的cap基因進(jìn)行了重組，構(gòu)建了突變體AAV衣殼文庫(kù)；同時(shí)根據(jù)AAV在心肌中高靶向性和肝臟中低靶向性的原則，將AAV衣殼文庫(kù)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了兩輪篩選，最終篩選到了AAVH50與AAVH59兩種衣殼，并且對(duì)其在小鼠模型和原代大鼠新生心肌細(xì)胞（Primary Neonatal Rat Cardiomyocytes，PNRC）中進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了其在心肌靶向性和心肌以外組織的非靶向性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

8種天然AAV載體（AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9）、pAAVCMV-GFP、pAAV-CMV-Luc、phelper為華東理工大學(xué)新藥設(shè)計(jì)與研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌TOP10購(gòu)于全式金生物；Taq聚合酶、T4連接酶、DNase I酶購(gòu)于Takara公司；限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和NotI購(gòu)于Takara公司；HEK293細(xì)胞為ATCC（美國(guó)菌株保藏中心）保存；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng) 基（Dulbecco’s modified eagle medium）、雙 抗（Penicillin-Streptomycin）及胰蛋白酶（2.5 g/L）均購(gòu)于Biological Industries公司；Benzonase酶購(gòu)于HaiGene公司；碘克沙醇購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；C57BL/6J小鼠購(gòu)于杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高速離心機(jī)（日本日立公司，Sorvall LYNX型）；臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司，F(xiàn)RESCO17型）；超速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司，Sorcall WX100+型）；蛋白純化儀（美國(guó)GE公司，AKTA pure 150型）；超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰公司，SW-CJ-2FD型）；PCR儀（美國(guó)ABI公司，Veriti DX型）；qPCR儀（德國(guó)耶拿公司，qTOWER3G touch型）；活體成像系統(tǒng)（上海銳珂醫(yī)療公司，In-vivoMultispectral System FX型）；熒光顯微鏡（德國(guó)LEICA公司，DMC4500型）。酶標(biāo)儀（美國(guó)bio Tek公司，Synergy 2型）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 突變體AAV衣殼文庫(kù)的構(gòu)建 用AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9為PCR模板。用引物F1（5′-CCCAAGCTTCGATCATA CGCAGAGAGTACCAA-3′）與R1（5′-ATAAGAATG CGGCCGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3′）來(lái)進(jìn)行衣殼基因的擴(kuò)增，并將8種AAV載體經(jīng)擴(kuò)增得到的DNA片段進(jìn)行等比例混合，在15 ℃下，用DNaseI處理，DNA片段化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、對(duì)300～1 000 bp的片段膠回收，加入DNA聚合酶變性，再退火重新組裝隨機(jī)衣殼基因。將產(chǎn)物稀釋后，用DNA聚合酶和引物F1/R1來(lái)進(jìn)行PCR（Polymerase Chain Reaction），PCR產(chǎn)物與含有ITR的AAV2衣殼質(zhì)粒用HindIII和NotI進(jìn)行雙酶切，將PCR產(chǎn)物的基因與AAV2骨架進(jìn)行連接，連接DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌，隨機(jī)選擇克隆進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和擴(kuò)增，得到重組衣殼基因的突變體AAV質(zhì)粒文庫(kù)。將突變體AAV質(zhì)粒文庫(kù)使用Muller等[26]開(kāi)發(fā)的包裝技術(shù)，制備了多種突變體AAV衣殼，將其按相同的比例混合得到突變體AAV衣殼文庫(kù)。

1.3.2 小鼠體內(nèi)突變型AAV衣殼文庫(kù)的直接篩選將5×1011vg的突變體AAV衣殼文庫(kù)注射入成年C57BL/6J小鼠體內(nèi)。3 d后處死小鼠，使用磷酸鹽緩沖液灌流將組織中的血液去除，從心臟和肝臟組織提取DNA，用Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增后篩選在心肌中出現(xiàn)頻率較高但在肝臟中出現(xiàn)頻率低的AAV衣殼，再將這些AAV衣殼按相同比例混合，產(chǎn)生二級(jí)AAV衣殼文庫(kù)，再次通過(guò)小鼠尾靜脈注射，用相同的方法進(jìn)行了兩輪體內(nèi)篩選后，最終得到目的AAV衣殼。

1.3.3 小鼠各個(gè)組織基因表達(dá)檢測(cè) 衣殼（AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6）、pAAV-CMV-Luc報(bào)告基因以及輔助質(zhì)粒phelper進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，從而得到AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMVLuc、AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc 4個(gè)載體。將含有CMV-Luc報(bào)告基因的AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6載體以3×1011vg的劑量通過(guò)尾靜脈注射C57BL/6J小鼠。3周后，對(duì)注射AAVH50、AAVH59、AAV9病毒的小鼠進(jìn)行活體成像。取AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6病毒注射的小鼠的各個(gè)組織。用熒光素酶法檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。提取心臟和肝臟的總DNA，用QPCR（Real-time Quantitative PCR）進(jìn)行定量。

1.3.4 原代大鼠新生心?。≒NCR）細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 衣殼（AAVH50、AAVH59、AAV9、AAV6）、pAAV-CMV-Luc/pAAV-CMV-GFP報(bào)告基因以及輔助質(zhì)粒phelper進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，從而得到AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc、AAV9-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-GFP、AAVH59-CMV-GFP、AAV9-CMV-GFP、AAV6-CMV-GFP 8種載體。將含有CMV-Luc的AAVH50，AAVH59，AAV6，AAV9載體與含有CMV-GFP的AAVH50，AAVH59，AAV6，AAV9載體分別感染大鼠原代心肌細(xì)胞，72 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)和熒光成像檢測(cè)不同血清型介導(dǎo)GFP基因表達(dá)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行至少3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），并用Prism 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選用T檢驗(yàn)用于組間比較，p＜0.05被認(rèn)為是差異顯著，p＜0.01被認(rèn)為是差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 體內(nèi)AAV突變體庫(kù)的建立與心肌靶向性衣殼的篩選。

突變體AAV衣殼文庫(kù)與小鼠體內(nèi)篩選的結(jié)果如圖1所示。由圖1（a）可見(jiàn)，構(gòu)建了隨機(jī)AAV質(zhì)粒文庫(kù)后，連接到含有ITR的AAV2載體，對(duì)隨機(jī)篩選的突變型AAV衣殼基因進(jìn)行DNA限制性酶切分析(圖1（b）)，結(jié)果表明絕大多數(shù)隨機(jī)篩選出的AAV衣殼基因包裝AAV衣殼可行。接下來(lái)進(jìn)行了突變體AAV載體文庫(kù)三質(zhì)粒包裝。在成年小鼠體內(nèi)進(jìn)行突變體AAV衣殼文庫(kù)的生物篩選，尾靜脈注射劑量為5×1011vg的AAV衣殼文庫(kù)，獲取心肌中豐富且肝臟中較少的克隆。在兩輪篩選后，得到了兩個(gè)名為AAVH50與AAVH59具有心肌靶向潛力的AAV衣殼。

2.2 AAVH50和AAVH59衣殼序列分析

用軟件Align X將AAVH50與AAVH59的測(cè)序結(jié)果與AAV1～AAV4、AAV6～AAV9的衣殼序列經(jīng)過(guò)對(duì)比和篩選，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明AAVH50衣殼蛋白VP1的氨基酸序列由AAV1(583～736)、AAV2(1～79)、AAV3B(80～123)、AAV6(344～582)、AAV7(222～309)、AAV8(178～221)和AAV9(124～177、210～221、310～343)的衣殼部分序列組成。AAVH59由AAV3B(1～65、262～327)、AAV6(147～261、328～735)與AAV8(66～146)衣殼的部分序列組成。

2.3 AVV9、AAVH50、AAVH59介導(dǎo)Luc基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)情況

C57BL/6J小鼠尾靜脈分別注射3×1011vg的AAV9-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMVLuc后，通過(guò)活體成像檢測(cè)體內(nèi)熒光素酶活性結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明AAV9在小鼠肝臟中有明顯的Luc基因表達(dá)，但是AAVH50和AAVH59在肝臟中的基因表達(dá)低于AAV9，并且在心臟處均有明顯的基因表達(dá)，而且AAVH50在心臟處表達(dá)效果要好于AAVH59。

2.4 AAV6、AVV9、AAVH50、AAVH59衣殼載體在小鼠體內(nèi)各個(gè)組織轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及心臟與肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對(duì)比

為了探究不同衣殼載體在各個(gè)組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，小鼠尾靜脈分別注射3×1011vg的AAV9-CMVLuc、AAV6-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后，對(duì)比了11種小鼠組織中的熒光素酶的活性，結(jié)果如圖4（a）所示。結(jié)果表明，在心臟、脛骨前?。═ibialis anterior，TA）、前肢、隔膜?。―iaphragm，DIA）中，AAVH50、AAVH59的表達(dá)均低于AAV9（p＜0.05）的表達(dá)，在肝臟、肺部、腎臟中AAVH50、AAVH59的表達(dá)均低于AAV9和AAV6（p＜0.05）的表達(dá)，在脛骨前肌中，AAVH50的表達(dá)低于AAV6的表達(dá)（p＜0.05），在腓腸?。℅astrocnemius GAS）中AAVH50表達(dá)比AAV9的表達(dá)低（p＜0.01），在股肌中AAVH50的表達(dá)高于AAV6的表達(dá)（p＜0.05），在脾臟中AAVH59的表達(dá)低于AAV6的表達(dá)（p＜0.05），在胰臟中表達(dá)AAVH50低于AAV9（p＜0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與AAV6、AAV9、AAVH50相比，AAVH59在肝臟中的表達(dá)水平極低。將4種AAV衣殼載體在心臟與肝臟熒光素酶基因的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4（b）所示，AAVH50在心臟與肝臟表達(dá)的比率為17∶1，AAVH59在心臟與肝臟的表達(dá)比率為35∶1，AAV9和AAV6在心臟與肝臟中的比率為分別1∶2和1∶4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAVH50與AAVH59心肝表達(dá)比顯著性高于AAV6與AAV9（p＜0.01）。

通過(guò)提取心臟和肝臟中的DNA，研究了尾靜脈注射后，小鼠的心臟和肝臟中的載體基因拷貝數(shù)，結(jié)果如圖5（a）所示。由圖可見(jiàn)，AAVH59在小鼠心臟中的載體DNA的拷貝數(shù)低于AAV6的拷貝數(shù)（p＜0.01），AAVH50的小鼠肝臟中的載體DNA拷貝數(shù)低于AAV9和AAV6的拷貝數(shù)（分別低169倍和30倍，p＜0.01），AAVH59在肝臟拷貝數(shù)更加低于AAV9和AAV6的拷貝數(shù)（分別低55 000倍和9 830倍，p＜0.01），表明AAVH59在肝臟中的表達(dá)極低。將4種AAV的心臟與肝臟載體DNA拷貝數(shù)的進(jìn)行比較（圖5（b）），結(jié)果顯示，AAVH50在心臟與肝臟載體拷貝數(shù)的比率高于AAV9（p＜0.01）和AAV6的比率（p＜0.05），AAVH59顯著高于AAV9和AAV6（p＜0.01），熒光素酶與DNA拷貝數(shù)在小鼠心臟和肝臟比率兩個(gè)方面具有相似的趨勢(shì)。因此，表明了AAVH50在心臟中表達(dá)與AAV6和AAV9表達(dá)相近，AAVH59在心臟中表達(dá)低于AAV6表達(dá)，但兩者在肝臟中的表達(dá)的均低于AAV6和AAV9表達(dá)，同時(shí)AAVH59在肝臟中的表達(dá)極低，兩個(gè)新篩選出的載體均在心臟有較好地表達(dá)，同時(shí)在肝臟中的表達(dá)很低。

2.5 AAV6、AVV9、AAVH50、AAVH59在PNRC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

圖1 DNA shuffling技術(shù)構(gòu)建突變體AAV衣殼文庫(kù)與小鼠體內(nèi)篩選Fig. 1 Construction of mutant AAV capsid library by DNA shuffling technology and in vivo screening in mice

為了體外模擬直接心肌注射的效果，直接對(duì)比AAV6、AVV9、AAVH50和AAVH59在大鼠原代心肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如圖6（a）所示，以MOI（Multiplicity of Infection）為1×104和1×103的比例加入AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc、AAV6-CMV-Luc、AAV9-CMV-Luc，利用熒光素酶試劑盒進(jìn)行熒光素酶含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與AAV6直接感染的效率最高，AAVH50直接感染的效率較差，AAVH59感染效率隨著MOI（Multiplicity of infection）增加，呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（p＜0.05）。

圖2 AAVH50與AAVH59的衣殼序列分析Fig. 2 Sequence analysis of the AAVH50與AAVH59 capsid

圖3 注射AAV9-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc后小鼠熒光素酶活體成像。Fig. 3 In vivo imaging of mouse luciferase after injection of AAV9-CMV-Luc、AAVH50-CMV-Luc、AAVH59-CMV-Luc

圖4 尾靜脈注射AAV載體后各種小鼠組織中的熒光素酶活性Fig. 4 Luciferase activity in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector

圖5 尾靜脈注射AAV載體后各種小鼠組織中載體基因組拷貝數(shù)Fig. 5 Vector genome copy numbers in various mouse tissues after tail vein injection of AAV vector

加入AAV9-CMV-GFP、AAV6-CMV-GFP、AAVH50-CMV-GFP、AAVH59-CMV-GFP感染大鼠心肌細(xì)胞，當(dāng)MOI值均為1×104時(shí)進(jìn)行GFP熒光檢測(cè)，結(jié)果如圖6（b）所示，結(jié)果表明每個(gè)AAV載體的GFP熒光表達(dá)從高到低排序?yàn)锳AV6，AAVH59，AAVH50和AAV9，與熒光素酶的結(jié)果呈相同的趨勢(shì)。

3 討 論

心肌疾病的基因治療，以AAV作為基因治療的載體具有一定的優(yōu)勢(shì)，AAV易于實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期持久的心肌表達(dá)，同時(shí)AAV不能自主復(fù)制，免疫原性低，較少引發(fā)免疫反應(yīng)，所以AAV載體能夠具有心肌基因治療的潛力。雖然現(xiàn)有的AAV6與AAV9能夠有著較強(qiáng)的心肌表達(dá)效果[9,12]，但是它們組織特異性較差，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌的同時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到心肌外的其他組織，尤其是肝臟[27]。本研究嘗試通過(guò)衣殼改造來(lái)解決AAV心肌特異性低的問(wèn)題。

本研究通過(guò)DNA shuffling構(gòu)建了AAV衣殼基因文庫(kù)，并在體內(nèi)進(jìn)行了直接篩選。主要優(yōu)點(diǎn)是避免了體外篩選的偏差與局限性。為了減少AAV在肝臟的靶向性，提高體內(nèi)篩選特異性，根據(jù)載體在心臟、肝臟出現(xiàn)的頻率作為篩選依據(jù)應(yīng)該是最理想和可行的策略[28]。研究結(jié)果表明：本研究成功地篩選到了心肌靶向性高且其他組織感染少的兩個(gè)載體AAVH50與AAVH59。同時(shí)，AAVH50與AAV9的心肌感染方式較為類(lèi)似，尾靜脈注射轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌的效率較高，AAVH59與AAV6較為類(lèi)似，直接感染具有較好心肌轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（圖4、5、6（a））。

對(duì)比圖3中Luc的活性與圖4中病毒拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)AAV9, AAVH50和AAVH59的變化趨勢(shì)相同，但是AAV6的結(jié)果出現(xiàn)了不一致的情況，可能是由于病毒拷貝數(shù)檢測(cè)使用的是qPCR定量的方法，反映的是AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況，而Luc的活性檢測(cè)則為AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后的DNA表達(dá)情況，因?yàn)椴煌逍虯AV在小鼠體內(nèi)存在差異性，導(dǎo)致AAV6的Luc的活性與病毒拷貝數(shù)不一致。

圖6 不同AAV載體在原代心肌細(xì)胞上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率Fig. 6 Transduction efficiency of different AAV vectors on primary cardiomyocytes

由圖6可見(jiàn)，AAV6的Luc表達(dá)遠(yuǎn)高于AAV9、AAVH50，對(duì)比圖3可以發(fā)現(xiàn)，AAV9與AAVH50的值變化不大，而AAV6、AAVH59有非常明顯的增加，可能是AAV6通過(guò)尾經(jīng)脈注射，難以透過(guò)血管,導(dǎo)致在心肌中的表達(dá)受限[11]。但是在對(duì)于直接感染心肌組織，AAV6能夠快速和高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)到嚙齒動(dòng)物心肌[10]。通過(guò)GFP熒光的驗(yàn)證，同時(shí)也證明了AAV6直接感染心肌細(xì)胞具有較高表達(dá)，而與AAV6對(duì)比，AAV9與AAVH50則熒光信號(hào)較低。

綜上，AAVH59的性質(zhì)與AAV6相類(lèi)似，同時(shí)AAVH50則展現(xiàn)出新的特性，兩個(gè)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)情況差異的具體機(jī)理尚不清楚，我們推測(cè)與載體組成的AAV親本有關(guān)，AAVH50由AAV1，AAV2，AAV3B，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9組成，AAVH59由AAV3B，AAV6，AAV8組成。AAV1和AAV6獲得的衣殼片段可能在心臟紋肌的感染性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而AAV7和AAV8可能通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層的轉(zhuǎn)運(yùn)而改善了系統(tǒng)基因的傳遞能力[29]，所以AAVH50較AAVH59有較好的傳遞性，而AAVH59同AAV6相似，具有較直接的感染性。

最后本研究并沒(méi)有能夠提高心肌的轉(zhuǎn)染效率，后續(xù)可以通過(guò)使用心臟特異性啟動(dòng)子進(jìn)行AAV載體的優(yōu)化，進(jìn)一步增強(qiáng)AAVH50與AAVH59在心肌中的基因表達(dá)，為心肌疾病的基因治療提供幫助。