葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的高效分泌表達

魏東升， 段廣東， 錢江潮

（華東理工大學生物反應器國家重點實驗室，上海 200237）

葡萄糖氧化酶（GOD，EC 1.1.3.4）是一種氧化還原酶，由兩個亞基組成同源二聚體，不同來源的GOD理化性質(zhì)存在差異[1]，分子量在130～175 kDa范圍內(nèi)的GOD可催化β-D-葡萄糖發(fā)生氧化反應生成葡萄糖酸和過氧化氫[2]。GOD被廣泛應用于食品、化工、生物醫(yī)療等領(lǐng)域。在食品行業(yè)，GOD可被用于催化葡萄糖耗盡真空袋中氧氣，抑制微生物生長和繁殖，延長食品保質(zhì)期[3]，還可提升面制品的口感[4]。在化工領(lǐng)域，GOD不僅常被應用于漂白脫色工藝[5]，還是葡萄糖酸及其衍生物生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶。醫(yī)療領(lǐng)域中，GOD是葡萄糖檢測試劑盒的關(guān)鍵原料[6]，也被加入牙膏中用于降低口腔疾病發(fā)生率[7]，還能作為生物電池的電極，為生物傳感器和人造器官提供持續(xù)的能源[8]。因此，大規(guī)模高效生產(chǎn)GOD具有重要的經(jīng)濟價值。

目前工業(yè)水平的GOD生產(chǎn)，主要以黑曲霉和青霉作為生產(chǎn)菌株，但存在酶活水平低、分離純化復雜的問題。為了實現(xiàn)GOD的高效生產(chǎn)，研究者已利用不同宿主嘗試了GOD的高效異源表達。但是，大腸桿菌（Escherichia coli）異源表達GOD時，容易形成無活性的包涵體[9]。釀酒酵母表達的GOD，由于過糖基化的原因，會降低重組GOD與葡萄糖的親和力和催化效率[10]。而畢赤酵母（Pichia pastoris）表達的GOD并不會產(chǎn)生過糖基化修飾的現(xiàn)象。Yamaguchi等[11]在P. pastoris中實現(xiàn)了GOD的分泌表達，但酶活只有1.23 U/mL。Gao等[12]通過密碼子優(yōu)化，使GOD酶活達到了615 U/mL。顧磊等[13]通過對GOD進行定點突變以及改造P. pastoris的翻譯加工和轉(zhuǎn)運的過程，提高了GOD的表達能力，在3 L發(fā)酵罐中，GOD分泌產(chǎn)量達到1 972 U/mL，為目前文獻報道的最高水平。

P. pastoris遺傳背景清楚，易于進行遺傳操作，分泌的蛋白糖基化適中，是一種進行外源蛋白表達的常用宿主。尤其是利用P. pastoris進行蛋白分泌表達，可大大簡化分離純化的過程，具有重要的應用價值。但是，外源蛋白的高效表達會對重組菌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生脅迫壓力，影響外源蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運。因此，共表達輔助折疊因子，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理蛋白的能力成為促進外源蛋白分泌表達的常用策略。例如，HAC1是由HAC1基因編碼的一個參與未折疊蛋白反應（Unfolded Protein Response, UPR）的轉(zhuǎn)錄因子，共表達HAC1可提高GOD和白介素等不同外源蛋白在P. pastoris中的分泌表達水平[13-14]。此外，外源蛋白的表達也會對宿主的碳代謝產(chǎn)生影響，Nocon等[15]通過強化磷酸戊糖途徑的SOL3和三羧酸循環(huán)的MDH1基因，使得重組超氧化物歧化酶產(chǎn)量提高了40%。

為了構(gòu)建高效分泌表達GOD的P. pastoris，在本文中，黑曲霉來源的GOD序列被優(yōu)化后用于構(gòu)建分泌表達GOD的P. pastoris重組菌，通過增加抗生素濃度，篩選得到GOD高拷貝重組菌株。在此基礎(chǔ)上，進一步共表達多個輔助折疊因子以及強化碳代謝途徑，探索多種組合策略組合對GOD分泌表達影響，獲得了第2代GOD高產(chǎn)菌，并在5 L和50 L發(fā)酵罐中對高產(chǎn)菌的工業(yè)應用前景進行考察和驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司，畢赤酵母GS115購自Invitrogen公司；pPIC9K：購自Invitrogen，含有α-MF信號肽，以AOX1為啟動子，并能通過同源基因his整合到P. pastoris基因組上的表達載體（AmpR）；pPIC9K-GOD：本課題構(gòu)建，以pPIC9K為載體，分泌表達GOD的重組質(zhì)粒（AmpR）;T-GAPDH：本課題構(gòu)建，將GAPDH基因片段整合到pUCm-T載體（含有LacZ基因，用于克隆含有A末端的線性載體）上；pAOX-SSN：本實驗室保存，包含P.pastoris染色體ADRH和DDKC基因同源序列，以AOX1調(diào)控基因表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-PDI1：本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控PDI1表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-MPD1：本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控MPD1表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-PDI2:本實驗室保存， 以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控PDI2表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-BIP:本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控Bip表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-SIL1: 本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控SIL1表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-HAC1:本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控HAC1基因表達的載體（ZeocinR）[16]; pAOX-ZWF1: 本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控ZWF1表達的載體（ZeocinR）[17]; pAOX-SOL3: 本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控SOL3表達的載體（ZeocinR）[17]; pAOX-MDH1: 本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控MDH1表達的載體（ZeocinR）[17]; pAOX-GDH3: 本實驗室保存，以pAOX-SSN為載體所構(gòu)建AOX1調(diào)控GDH3表達的載體（ZeocinR）[17]。

1.1.2 酶和試劑 工具酶，包括T4連接酶、限制性內(nèi)切酶（BamH I、EcoR I、XhoI、NotI、SalI等）、標準蛋白分子量Marker、標準核酸分子量Marker均購自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；PCR所用的rTaqPCR聚合酶和pfuPCR 聚合酶均購自北京天根生化科技有限公司。

所用分子克隆試劑盒，包括質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、核酸純化試劑盒以及酵母基因組DNA提取試劑盒，均購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建 文中所用的引物見表1（劃線部分為限制性酶切位點）。構(gòu)建AOX1啟動子調(diào)控GOD表達的質(zhì)粒pPIC9K-GOD時，根據(jù)黑曲霉的GOD蛋白序列（UniProt: P13006），按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化后，合成Pgod基因，使用引物GODF和GODR擴增GOD序列，通過EcoR I和NotI酶切位點連接到pPIC9K載體上，構(gòu)建GOD分泌表達載體pPIC9K-GOD。

表1 本研究中所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組菌的構(gòu)建和篩選 用限制性內(nèi)切酶SalI線性化質(zhì)粒pPIC9K-GOD，純化后通過電擊畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，利用GS115的組氨酸缺陷型特征，在MD（Minimal Dextrose）固體培養(yǎng)基上篩選重組菌，并經(jīng)PCR和測序驗證。

使用無菌水洗滌收集MD培養(yǎng)皿中的重組菌，涂布在含有不同質(zhì)量濃度（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0 mg/mL）遺傳霉素G418的YPD（Yeast Peptone Dextrose）培養(yǎng)皿上。挑取耐高抗生素濃度的重組菌，考察GOD產(chǎn)量并測定高產(chǎn)菌的拷貝子數(shù)。

獲得高拷貝高產(chǎn)菌G/GODM后，為了進一步共表達折疊因子或碳代謝途徑基因，將pAOX-PDI1、pAOX-MPD1、pAOX-PDI2、pAOX-BIP、pAOX-SIL1、pAOX-HAC1、pAOX-ZWF1、pAOX-SOL3、pAOXMDH1和pAOX-GDH3經(jīng)XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切后得到線性化片段，電擊轉(zhuǎn)化G/GODM，利用共表達基因兩端所插入的ADRH基因和DDKC基因同源序列，通過同源重組的方式分別整合到菌株G/GODM的基因組上。經(jīng)過博來霉素抗性篩選得到陽性克隆，經(jīng)PCR驗證及測序后篩選到正確的重組菌。

1.2.3 拷貝子數(shù)目測定 按照文獻已報道的方法[18]測定重組菌中GOD基因拷貝數(shù)。將參比質(zhì)粒T-GAPDH、pPIC9K-GOD分別稀釋至每微升中有109、108、107、106、105、104、103個質(zhì)粒、分別取1 μL上述質(zhì)粒稀釋液作為模版進行熒光定量PCR，以Ct值（循環(huán)次數(shù)）為縱坐標、起始模版質(zhì)粒濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線。

以重組菌的基因組DNA為模板，以引物gapdhF、gapdhR、qGODF和qGODR進行熒光定量PCR。根據(jù)測得的Ct值和標準曲線確定重組菌GAPDH和GOD的起始模版量，計算兩者起始模版數(shù)量的比值，得到重組菌中GOD基因的拷貝子數(shù)。

1.2.4 重組菌的培養(yǎng)方法 在搖瓶中進行培養(yǎng)時，將重組菌接種到含25 mL的BMGY（Buffered Glycerol-Complex Medium）培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)約18 h至OD600在4～6之間，收集菌液至無菌的50 mL離心管中，于4 ℃、4 000 r/min離心5 min，用BMMY（Buffered Methanol-Complex Medium）培養(yǎng)基重懸菌體，并調(diào)節(jié)OD600在1左右，后轉(zhuǎn)移至裝有50 mL BMMY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中進行誘導培養(yǎng)，每隔24 h取樣，并補充1%（體積分數(shù)）的甲醇。

發(fā)酵罐中的培養(yǎng)分為3個階段：分批發(fā)酵階段、甘油流加階段和甲醇誘導階段。在分批發(fā)酵階段，控制通氣比約為1.5 VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，待分批發(fā)酵結(jié)束、溶氧（Dissolved oxygen, DO）開始反彈時，開始補加甘油，通過控制甘油流加速率，使DO維持在5%～10%之間，當OD600達到400時，停止補加甘油，待DO反彈至100%，饑餓培養(yǎng)30～60 min后，開始緩慢流加甲醇，通過調(diào)整甲醇流加速率、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等操作變量，控制DO在0～5%之間。整個培養(yǎng)過程中，通過補加氨水維持pH值在5.5，批發(fā)酵和甘油流加階段溫度設定在30 ℃，誘導階段溫度設定在22 ℃。

1.2.5 GOD活性測定 GOD酶活定義：在37 ℃下，每分鐘催化1 μmol的β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸的酶量定義為1個單位酶活U。采用終點法測定GOD酶活：在10 mL離心管中依次加入2.5 mL的0.21 mmol/L的鄰聯(lián)茴香胺、0.3 mL的0.18 g/mL葡萄糖、0.1 mL的90 U/mL的辣根過氧化物酶，37 ℃保溫5 min后，向離心管中加入酶液，反應3 min后，加入2 mol/L硫酸終止反應，取出離心管，測定OD500的吸光值。

將GOD標準品稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U/mL，按照GOD酶活測定方法，測定反應3 min后的OD500值，以OD500值為橫坐標，以GOD酶活為縱坐標，繪制標準曲線用于計算酶活（Activity）：Activity=（0.157 8×OD500?0.003 3）×V/V0，其中V為反應總體積，V0為加入酶液的體積。

2 實驗結(jié)果

2.1 構(gòu)建GOD高產(chǎn)菌G/GODM

為了實現(xiàn)GOD在P. pastoris中的分泌表達，選擇了pPIC9K載體，在EcoRI和NotI酶切位點插入Pgod基因，構(gòu)建GOD分泌表達載體pPIC9K-GOD（圖1(a)），經(jīng)SalI酶切線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD固體培養(yǎng)基上挑取陽性單菌落，使用引物GODF/GODR進行菌落PCR驗證重組菌，并經(jīng)測序驗證重組菌G/GOD構(gòu)建成功（圖1(b)）。

圖1 酶切驗證質(zhì)粒pPIC9K-GOD（a）和重組菌G/GOD、G/GODM的PCR驗證（b）Fig. 1 Enzyme digestion to confirm plasmid pPIC9K-GOD (a)and verification of recombinant strain G/GOD and G/GODM by PCR analysis (b)

在線性化pPIC9K-GOD轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115的MD培養(yǎng)板上，用無菌水洗滌收集陽性重組菌，涂布在含有不同質(zhì)量濃度（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0 mg/mL）遺傳霉素G418的YPD培養(yǎng)皿上，獲得多株耐G418質(zhì)量濃度達到2.0 mg/mL的重組菌，在搖瓶中初步篩選后，挑選得到產(chǎn)量最高的菌株G/GODM（圖1(b)）。測定G/GOD和G/GODM的拷貝子數(shù)目分別為1和7。

在搖瓶中培養(yǎng)重組菌G/GOD和G/GODM，并與整合了空載質(zhì)粒pPIC9K的對照菌G/9K相比，重組菌G/GOD和G/GODM的生長速率未發(fā)生改變（圖2(a) ），表明外源蛋白GOD表達并沒有影響重組菌生長，拷貝子數(shù)目的增加也對菌株生長沒有影響。在對照菌G/9K中無法檢測到GOD酶活，而兩株重組菌中的酶活在加入甲醇誘導后開始升高，但多拷貝重組菌G/GODM胞外產(chǎn)酶遠高于單拷貝菌G/GOD。G/GOD的胞外GOD產(chǎn)量在144 h達到最高，單位細胞干重酶活為714.2 U/g。G/GODM的胞外單位菌體酶活在120 h達到最高，為5 843.2 U/g（圖2(b)），是G/GOD最高產(chǎn)量的8.2倍。因此，在P. pastoris中整合高拷貝Pgod基因可得到GOD高產(chǎn)菌G/GODM。

圖2 不同拷貝重組菌在搖瓶中的生長（a）和胞外GOD比活（b）曲線Fig. 2 Growth (a) and extracellular GOD specific activity (b) curve of the recombinant strains containing different copy of Pgod gene in shake flask

2.2 強化蛋白折疊分泌和碳代謝途徑提高G/GODM的GOD產(chǎn)量

在得到GOD高產(chǎn)菌G/GODM后，為了進一步提高GOD的產(chǎn)量，通過強化G/GODM的蛋白折疊分泌碳和碳代謝途徑，嘗試構(gòu)建第2代高產(chǎn)重組菌,結(jié)果如圖3所示。基于本實驗室的前期工作[16-17]，選擇了P. pastoris分泌折疊途徑的基因PDI1、MPD1、PDI2、Bip、SIL1、HAC1，以及碳代謝途徑基因ZWF1、SOL3、MDH1、GDH3，并利用前期構(gòu)建的相應表達載體pAOX-X（X代表以上各基因），通過同源重組的方式整合到重組菌G/GODM基因組的RH-DDKC位點，即兩個相鄰基因ADRH（PAS_chr1-4_0191）和DDKC（PAS_chr1-4_0192）處。

挑取轉(zhuǎn)化得到的重組菌，分別用引物RHF/AOXR和CYCTTF/DDKCR驗證目的片段在上下同源臂位點的整合（如圖4），分別獲得了強化PDI1、MPD1、PDI2、Bip、SIL1、HAC1、ZWF1、SOL3、MDH1、GDH3基因的重組菌G/GMP1、G/GMMP1、G/GMP2、G/GMB、G/GMS1、G/GMH1、G/GMZ1、G/GMS3、G/GMMD1和G/GMG3。

圖3 二代重組菌的構(gòu)建Fig. 3 Construction of second-generation recombinant strains

圖4 二代重組菌的驗證Fig. 4 Verification of second-generation recombinant strains

在搖瓶中培養(yǎng)重組菌，測定不同重組菌的胞內(nèi)外酶活，結(jié)果如圖5所示。由圖可見，各重組菌都可有效將GOD分泌至胞外，誘導120 h、強化HAC1和PDI1后，與出發(fā)菌G/GODM相比，重組菌G/GMH1和G/GMP1的胞外單位菌體酶活分別提高了54.4%和32.7%，達到9 022.1 U/g和7 753.6 U/g；強化PDI2、SOL3和MDH1表達后重組菌胞外單位菌體酶活分別提高了8.9%、6.3%和11.6%。其余基因的共表達均未促進GOD胞外產(chǎn)量，其中共表達MPD1對產(chǎn)量的影響最大，G/GMMP1胞外單位菌體酶活只有2 330.6 U/g，比G/GODM下降了60%。從各重組菌的胞內(nèi)酶產(chǎn)量來看，共表達這些基因的影響不大。

選擇GOD分泌產(chǎn)量提高的5個重組菌，考察它們的生長（圖6(a)）和胞外酶活（圖6(b)）。在這5個菌中，只有G/GMH1的生長速度低于出發(fā)菌G/GODM。從胞外GOD產(chǎn)量來看，除G/GMS3外，其他重組菌均明顯高于G/GODM，其中G/GMH1的胞外酶活最高，在120 h達到最高（9 022.1 U/g），比G/GODM的最高酶活提高了54.4%。

圖5 誘導120 h時二代重組菌胞內(nèi)外酶活Fig. 5 Extracellular and intracellular GOD specific activity of the second-generation recombinant strains after 120 h of induction

2.3 反應器中考察高產(chǎn)重組菌的特性

根據(jù)搖瓶培養(yǎng)得到的結(jié)果，挑選高產(chǎn)重組菌G/GODM以及兩株第2代高產(chǎn)菌G/GMP1和G/GMH1，以單拷貝菌G/GOD為對照，在5 L反應罐中比較它們的生長曲線和產(chǎn)酶能力，結(jié)果如圖7所示。如圖7(a)所示，在甲醇誘導階段，G/GMH1的產(chǎn)菌量略低于其余3株重組菌，與搖瓶結(jié)果一致。各重組菌在誘導階段持續(xù)分泌GOD，隨著誘導培養(yǎng)的進行，胞外酶產(chǎn)量不斷升高（圖7(b)），誘導144 h后，單拷貝菌G/GOD胞外酶產(chǎn)量最低，重組菌G/GMH1的胞外酶產(chǎn)量最高，單位菌體酶活最高達到7 030.4 U/g，是G/GOD的6.6倍。除了G/GOD外，其余3株重組菌的胞外酶產(chǎn)量均低于搖瓶水平，G/GODM和G/GMP1尤其顯著。誘導結(jié)束時，G/GODM、G/GMP1、G/GMH1的酶活分別達到377.7、490.9、1 010.5 U/mL，分別是單拷貝菌G/GOD的2.2、2.8、5.8倍。

圖6 二代高產(chǎn)重組菌的生長（a）和胞外酶活（b）Fig. 6 Growth (a) and extracellular GOD specific activity (b) of the second-generation recombinant strains

圖7 5 L發(fā)酵罐中重組菌的生長（a）和胞外酶活（b）Fig. 7 Cell growth (a) and extracellular GOD specific activity (b) of recombinant strains in the 5 L bioreactor

對于胞外酶產(chǎn)量最高的G/GMH1，進一步在50 L發(fā)酵罐考察其特性。培養(yǎng)24 h時開始流加甲醇誘導，此后DO一直保持較低水平，而攝氧率（Oxygen Uptake Rate，OUR）和二氧化碳釋放率（Carbon Dioxide Evolution Rate，CER）都在快速上升至48 h后基本穩(wěn)定，此后呼吸熵（Respiratory Quotient，RQ）也相對穩(wěn)定（圖8(a)）。隨著甲醇誘導的開始，重組菌持續(xù)向胞外分泌GOD（圖7(b)），至發(fā)酵結(jié)束時，單位菌體和體積酶活均達到最高，分別為6 656.6 U/g和1 150.5 U/mL。這一結(jié)果表明，G/GMH1可在50 L發(fā)酵罐中實現(xiàn)較高的GOD分泌表達，具有良好的工業(yè)應用前景。

圖8 G/GMH1在50 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵的胞外GOD酶活、細胞干重、DO、OUR、CER、RQ時間曲線（a）和培養(yǎng)上清液的蛋白電泳（b）Fig. 8 Time courses of extracellular GOD specific activity, Dry cell weight, DO, OUR, CER, RQ (a) and protein electrophoresis of supernatant solution (b) in the 50 L fedbatch fermentation using the strain G/GMH1

3 討 論

為了獲得具有工業(yè)生產(chǎn)價值的GOD高產(chǎn)菌，我們采用黑曲霉的葡萄糖氧化酶蛋白序列，經(jīng)過密碼子優(yōu)化，構(gòu)建分泌表達GOD的P. pastoris重組菌G/GOD，并通過提高抗生素濃度，篩選得到高產(chǎn)量重組菌G/GODM，在搖瓶中GOD分泌產(chǎn)量可達5 843.2 U/g，為G/GOD最高產(chǎn)量的8.2倍。在此基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了多個共表達輔助折疊因子和強化碳代謝途徑的第2代高產(chǎn)菌（表2），其中，共表達HAC1的重組菌G/GMH1單位菌體酶活最高，為9 022.1 U/g。在5 L和50 L反應器中，重組菌G/GMH1的胞外GOD產(chǎn)量可達到了7 030.4 U/g和6 656.6 U/g。與已報道GOD表達水平比較，重組菌G/GMH1胞外單位菌體酶活為目前報道搖瓶培養(yǎng)和反應器水平最大值，顯示了工業(yè)應用的潛力。

圍繞提高GOD在P. pastoris的分泌表達，我們嘗試了增加基因拷貝數(shù)、共表達輔助折疊因子和強化碳代謝途徑的策略，其中，增加GOD基因的拷貝數(shù)和共表達UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄因子HAC1取得了最顯著的促進作用。這一結(jié)果表明，增加基因劑量可有效促進外源蛋白的表達，但過量的外源蛋白表達有可能導致蛋白無法及時進行正確折疊和轉(zhuǎn)運，此時共表達HAC1不僅能夠刺激蛋白酶的表達，降解折疊錯誤的蛋白，而且可以調(diào)控UPR響應下游基因的表達，促進蛋白的正確折疊和轉(zhuǎn)運。此外，共表達PDI1和PDI2蛋白也可增強GOD的分泌表達，可能是因為GOD蛋白的186和228位點存在二硫鍵，這兩種二硫鍵異構(gòu)酶蛋白有助于二硫鍵形成，促進了蛋白的正確折疊和分泌。

表2 所構(gòu)建重組菌的胞外單位菌體GOD酶活Table 2 Extracellular GOD specific activity of the recombinant strains

對碳代謝途徑進行改造時，強化三羧酸循環(huán)循環(huán)的蘋果酸脫氫酶基因MDH1和磷酸戊糖途徑的6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因SOL3均能提高GOD的胞外產(chǎn)量。MDH1催化蘋果酸向草酰乙酸的轉(zhuǎn)化，并伴隨NAD+向NADH的還原，可增強細胞的能量代謝，為蛋白合成提供ATP[19]。SOL3是磷酸戊糖途徑途徑中第二步關(guān)鍵酶，強化SOL3的表達有可能提高磷酸戊糖途徑途徑的通量，為蛋白質(zhì)合成提供更充足的還原性輔因子NADPH。強化SOL3和MDH1基因有利于外源蛋白的表達，這與Nocon等[15]通過模型預測得到的結(jié)果一致，也說明在外源蛋白高效表達時，需要對P. pastoris的胞內(nèi)碳代謝進行改造以適應蛋白合成的需求并促進其表達。在我們分別強化輔助折疊因子和碳代謝途徑取得正效應的基礎(chǔ)上，后續(xù)可嘗試多基因組合的優(yōu)化策略，或通過蛋白質(zhì)改造提高GOD的催化活性，來構(gòu)建下一代的高產(chǎn)菌。

在得到GOD高產(chǎn)菌后，我們進一步在反應器規(guī)模驗證G/GMH1的性能。雖然共表達HAC1基因后，重組菌的生長稍低于出發(fā)菌G/GODM，但其單位菌體產(chǎn)量遠高于出發(fā)菌，在50 L規(guī)模的反應器中最高體積產(chǎn)量達到1 150.5 U/mL。但是，隨著發(fā)酵規(guī)模的擴大，G/GMH1單位菌體酶活出現(xiàn)下降的趨勢，在50 L反應器中，GOD的最高胞外單位菌體酶活為6 656.6 U/g，僅為搖瓶最高水平（9 022.1 U/g）的73.4%。這一現(xiàn)象表明，G/GMH1的高產(chǎn)性能并沒有在發(fā)酵罐中得以實現(xiàn)，重組菌在反應器中的發(fā)酵過程還需進行優(yōu)化。后續(xù)可通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方，調(diào)整和優(yōu)化過程控制參數(shù)，為重組菌的生長和蛋白表達提供更適宜的環(huán)境，充分發(fā)揮G/GMH1的高產(chǎn)性能。