β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的致敏性研究

陳曉旭，吳玥琨，張燕*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室，天津 300071）

近年來，人們對于食物過敏的關(guān)注度越來越高。常見的食物過敏原包括花生、大豆、奶、蛋、魚、貝類、堅果等，食品標(biāo)識委員會將其定義為八大食物過敏原[1]。其中大豆為人們膳食提供了豐富的植物蛋白，而致敏性是它的主要劣勢，阻礙其在食品加工中的應(yīng)用。大豆致敏蛋白中β-伴大豆球蛋白約占大豆蛋白總量的30%[2]，是大豆主要的過敏原[3]。β-伴大豆球蛋白是由α、α′和β亞基組成的三聚體結(jié)構(gòu)，每個亞基由酸性肽鏈和堿性肽鏈組成，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，因此β-伴大豆球蛋白的致敏性相對穩(wěn)定。

目前已經(jīng)報道了很多用來降低蛋白質(zhì)的致敏性的食品加工方法[4-6]，包括發(fā)酵、煎炸、烘烤等，主要是通過蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的共價鍵或非共價鍵相互作用，導(dǎo)致二級或三級結(jié)構(gòu)改變，從而影響蛋白質(zhì)的致敏性。糖基化反應(yīng)是在酶的作用下，蛋白質(zhì)的氨基和還原糖的羰基之間形成糖蛋白的過程[7]。在食品加工中糖基化反應(yīng)可能引起蛋白質(zhì)功能特性發(fā)生改變，并對蛋白質(zhì)具有一定的修飾作用，可修飾蛋白質(zhì)的抗原表位，從而影響蛋白質(zhì)的致敏性[8]。據(jù)報道，經(jīng)糖基化反應(yīng)后降低了花生過敏原的致敏性[9]。劉俊等將牛血清蛋白和α-乳白蛋白經(jīng)超聲波輔助糖基化處理后，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)發(fā)生了改變，并降低了α-乳白蛋白的致敏性[10]。糖基化反應(yīng)中，蛋白質(zhì)的抗原表位發(fā)生了變化，從而影響蛋白質(zhì)的致敏性[11]。

目前，評價糖基化修飾對過敏原的影響，主要是通過酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測過敏原免疫活性，但這類方法缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性，還有待進(jìn)一步完善。因此本研究選擇食品加工中常用的配料葡萄糖和β-伴大豆球蛋白，通過幾種典型的熱加工條件，制備β-伴大豆球蛋白的糖基化修飾產(chǎn)物，并進(jìn)行體內(nèi)動物實驗，探討加熱過程中葡萄糖對β-伴大豆球蛋白的糖基化修飾作用，以及對β-伴大豆球蛋白致敏性的影響，為通過食品加工方式降低蛋白致敏性奠定了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-伴大豆球蛋白：自制；葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；霍亂毒素（cholera toxin，CT）：美國 Sigma-Aldrich公司；組胺、免疫球蛋白（immunoglobulin E，IgE）、類胰蛋白酶試劑盒：南京建成有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水儀：德國默克密理博公司；FE20K型PH計：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R離心機(jī)：美國Beckman公司；MS3渦旋混合器：德國IKA公司；SB-4200D超聲波清洗機(jī)：中國新芝生物科技股份有限公司；BL610電子天平：德國Sartorius公司；UF-110烘箱：上海美墨爾特貿(mào)易有限公司；Evolution 300紫外分光光度計：美國Thermo公司；SBH200D/3干浴器：英國Stuart公司。

1.3 方法

1.3.1 β-伴大豆球蛋白的制備

參考文獻(xiàn)[12]中方法對β-伴大豆球蛋白進(jìn)行分離及提純。

1.3.2 β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備

將50 mg純度為92.46%的β-伴大豆球蛋白加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液，葡萄糖與β-伴大豆球蛋白的質(zhì)量比為4∶1，反應(yīng)的條件分別為低溫糖基化：70℃加熱8 h；蒸煮糖基化：100℃加熱30 min；高壓滅菌糖基化：121℃加熱15 min。所有條件下反應(yīng)后的糖基化產(chǎn)物需透析處理除掉游離糖等小分子。

1.3.3 免疫方法

雌性、4周齡、質(zhì)量在（20±5）g的BALB/c小鼠，飼養(yǎng)在溫度（25.5±2）℃和濕度70%的條件下。將50只小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只。第1周小鼠正常飲食，第2周開始，灌胃小鼠300 μL生理鹽水（空白組，n=10）、灌胃小鼠 300 μL β-伴大豆球蛋白（1 mg/mL）和霍亂毒素（CT）（0.01 mg/mL）混合液（過敏組，n=10）、灌胃小鼠300 μL低溫糖基化產(chǎn)物（1 mg/mL）和CT（0.01 mg/mL）混合液（低溫糖基化組，n=10）、灌胃小鼠300 μL 蒸煮糖基化產(chǎn)物（1 mg/mL）和 CT（0.01 mg/mL）混合液（蒸煮糖基化組，n=10）和灌胃小鼠300 μL高壓滅菌糖基化產(chǎn)物（1 mg/mL）和 CT（0.01 mg/mL）混合液（高壓滅菌糖基化組，n=10），以上灌胃的所有混合液溶劑均為生理鹽水。每周灌胃1次，第5次激發(fā)，觀察過敏癥狀后，處死，取血清-80℃保存待測。

1.3.4 過敏癥狀評分

每組小鼠激發(fā)后30 min～50 min，仔細(xì)觀察小鼠的行為及體貌特征并依照表1中表述的內(nèi)容進(jìn)行評價[13]。

表1 小鼠過敏癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard for allergic mouse symptoms

1.3.5 血清中組胺含量的測定

采用組胺含量測定試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.6 血清中免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）含量的測定

采用IgE含量測定試劑盒試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.7 血清中類胰蛋白酶含量的測定

采用類胰蛋白酶含量測定試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.8 糖基化產(chǎn)物接枝度的測定

參照文獻(xiàn)[14]中的方法測定β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的接枝度。將2 mg/mL 200 μL β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物溶液（溶劑為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）加入4 mL鄰苯二甲醛試劑，并在35℃下水浴2 min，用紫外分光光度計分別測其在340 nm處的吸光值?？瞻坠芾锓謩e加入4 mL鄰苯二甲醛和200 μL磷酸鹽緩沖液。

接枝度（grafting degree，DG）計算公式如下。

式中：At為接枝物溶液的吸光值；A0為單一蛋白溶液在同一反應(yīng)條件下的吸光值。

1.3.9 糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性的測定

參照文獻(xiàn)[15]中的方法測定糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性。用磷酸鹽緩沖液溶解，配制成濃度為0.2 mg/mL的β-伴大豆球蛋白溶液。熒光儀參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長為295 nm，掃描速度為60 nm/min。最終測定β-伴大豆球蛋白的熒光發(fā)射光譜范圍在300 nm～400 nm。

1.3.10 糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的測定

分別準(zhǔn)確的稱取2mg的β-伴大豆球蛋白和150mg的溴化鉀，充分的研磨，再將研磨后的混合粉均勻的放于壓片機(jī)中，進(jìn)行紅外光譜掃描。以溴化鉀作為空白樣，充分研磨后放置壓片機(jī)中，再進(jìn)行紅外光譜掃描。紅外光譜分別進(jìn)行背景掃描和樣品掃描，參數(shù)設(shè)置掃描的波段為4 000 cm-1～1 000 cm-1、分辨率為4 cm-1。采用OMNIC 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4 統(tǒng)計與分析

每組試驗至少3次重復(fù)，本試驗所有數(shù)據(jù)通過軟件SPSS 14.0中單因素ANOVA檢驗和Duncan test進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示，p<0.05表示有顯著差異，所用作圖軟件為Origin 9。

2 結(jié)果與分析

2.1 過敏癥狀評分

不同糖基化條件對小鼠過敏癥狀的影響，見圖1。

圖1 小鼠過敏癥狀評分Fig.1 Mouse allergy symptom score

如圖1所示，與空白組相比，過敏組的小鼠過敏癥狀評分極顯著升高；與過敏組相比，蒸煮糖基化組過敏癥狀評分顯著降低；與低溫糖基化組相比，高壓滅菌糖基化組過敏癥狀評分差異不顯著。空白組小鼠無異?，F(xiàn)象；過敏組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的口唇腫脹、毛發(fā)豎立、運(yùn)動活力下降等癥狀；低溫糖基化組中有部分小鼠出現(xiàn)運(yùn)動活力下降、毛發(fā)豎立、抓撓面部等癥狀；灌胃蒸煮糖基化產(chǎn)物和高壓滅菌糖基化產(chǎn)物小鼠過敏反應(yīng)癥狀不明顯，說明過敏反應(yīng)較弱。

2.2 體重分析

不同糖基化條件對小鼠體重的影響，見圖2。

圖2 小鼠體重的測定Fig.2 Determination of mouse body weight

由圖2可知，與空白組相比，過敏組小鼠體重極顯著降低。與低溫糖基化組和蒸煮糖基化組相比，灌胃高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的小鼠體重差異不顯著?？赡苁且驗楣辔覆煌庸l件下糖基化產(chǎn)物的小鼠發(fā)生了不同程度的過敏反應(yīng)，導(dǎo)致小鼠體重不同程度的降低[16]。結(jié)果表明，高壓滅菌糖基化組中的小鼠體重降低程度最小，過敏反應(yīng)程度最弱。

2.3 組胺含量分析

不同糖基化條件對小鼠血清中組胺含量的影響，見圖3。

圖3 小鼠血清中組胺含量測定Fig.3 Determination of histamine in mouse serum

如圖3所示，小鼠血清中組胺水平過敏組和低溫糖基化組相比，過敏組小鼠組胺含量顯著升高。與低溫糖基化組相比，蒸煮糖基化組和高壓滅菌糖基化組中的小鼠組胺含量差異不顯著。不同條件下的糖基化組中小鼠的組胺含量出現(xiàn)不同程度的降低可能是因為肥大細(xì)胞脫顆粒作用降低，因此減少了組胺的釋放[17]。結(jié)果表明，高壓滅菌糖基化組中小鼠的組胺含量最低，導(dǎo)致過敏反應(yīng)程度最弱。

2.4 IgE含量分析

不同糖基化條件對小鼠血清中IgE含量的影響，見圖4。

圖4 小鼠血清中IgE含量測定Fig.4 Determination of IgE in mouse serum

如圖4所示，與空白組相比，過敏組小鼠IgE含量極顯著升高。與低溫糖基化組相比，蒸煮糖基化組和高壓滅菌糖基化組的小鼠IgE含量差異不顯著。IgE含量是衡量過敏反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[18]。結(jié)果表明，灌胃高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的小鼠血清中IgE含量最低，導(dǎo)致小鼠的過敏反應(yīng)程度最弱。

2.5 類胰蛋白酶含量的分析

不同糖基化條件對小鼠血清中類胰蛋白酶含量的影響見圖5。

圖5 小鼠血清中類胰蛋白酶含量測定Fig.5 Determination of tryptase content in mouse serum

如圖5所示，與空白組相比，過敏組小鼠的類胰蛋白酶含量極顯著升高。與過敏組相比，各糖基化組小鼠的血清中類胰蛋白酶含量均有不同程度的降低。與低溫糖基化組相比，灌胃高壓滅菌糖基化產(chǎn)物小鼠的類胰蛋白酶含量差異顯著。因為類胰蛋白酶含量是過敏患者血清中檢測的重要指標(biāo)，可以一定程度上反應(yīng)過敏的程度[19]，結(jié)果表明高壓滅菌組的小鼠類胰蛋白酶含量最低，過敏反應(yīng)程度最弱。

2.6 糖基化產(chǎn)物接枝度的分析

不同條件下的糖基化產(chǎn)物對接枝度的影響，見圖6。

圖6 糖基化產(chǎn)物接枝度測定Fig.6 Determination of the degree of grafting of glycosylation products

從圖6中可看出，β-伴大豆球蛋白與葡萄糖在低溫、蒸煮和高壓滅菌條件處理后的接枝度分別為10.46%、15.06%和35.17%。與低溫糖基化組相比，高壓滅菌糖基化組的接枝度極顯著升高。結(jié)果表明，隨著加工溫度的升高接枝度也呈顯著升高的趨勢，原因可能是β-伴大豆球蛋白是三聚糖蛋白，反應(yīng)溫度越高，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)越容易發(fā)生改變[14]。由此表明，高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的接枝度最高，從而導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。

2.7 糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性的分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光性是通過測定生物大分子的熒光發(fā)色團(tuán)，從而獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能等信息。蛋白質(zhì)分子中能發(fā)射熒光的氨基酸主要有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[20]。因此，通過內(nèi)源熒光光譜測定蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度，可以判斷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。不同條件下的糖基化產(chǎn)物對熒光強(qiáng)度的影響，見圖7。

圖7 糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性的測定Fig.7 Determination of endogenous fluorescence of glycosylation products

從圖7可以看出，與低溫糖基化產(chǎn)物比較，蒸煮糖基化和高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度明顯降低。原因可能有以下幾種：1）熱處理后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，色氨酸殘基埋藏到疏水的環(huán)境中[21]；2）葡萄糖側(cè)鏈的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對色氨酸殘基具有屏蔽作用[22]；3）色氨酸發(fā)生熒光淬滅[23]；4）因為反應(yīng)溫度太高，蛋白質(zhì)分子迅速展開聚集，色氨酸殘基大量損失[24]，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。結(jié)果說明，高壓滅菌糖基化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度最低，導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。

2.8 糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是肽鏈中有規(guī)則的重復(fù)的構(gòu)象，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲[25]。不同條件下的糖基化產(chǎn)物對二級結(jié)構(gòu)的影響見表2。

從表2可以發(fā)現(xiàn)，與蒸煮糖基化和高壓滅菌糖基化產(chǎn)物相比，低溫糖基化產(chǎn)物α-螺旋含量顯著降低。與低溫糖基化和蒸煮糖基化產(chǎn)物相比，高壓滅菌糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)中β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著降低，無規(guī)則卷曲的含量顯著增加。隨著反應(yīng)溫度的升高，蛋白質(zhì)中有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無序結(jié)構(gòu)。在糖基化反應(yīng)中蛋白質(zhì)與糖之間以共價鍵聚集，其中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等通常情況下存在于肽鏈的內(nèi)部，熱處理后可能會導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[26]。結(jié)果表明，高壓滅菌糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量最低和無規(guī)則卷曲含量最高，導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。

表2 糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的測定Table 2 Determination of the secondary structure of glycosylation products

3 結(jié)論

通過評估典型過敏指標(biāo)以及糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與低溫糖基化產(chǎn)物和蒸煮糖基化產(chǎn)物相比，高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化最顯著，導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。本研究評價了不同加工條件下β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的致敏性，為有效降低食品熱加工中大豆制品的致敏性提供重要的參考。