高耐受Pb2+酵母菌抗氧化及吸附Pb2+特性的研究

張豐生，李麗杰，賀銀鳳

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

重金屬是指密度大于4.5 g/cm3的金屬，常見的有鉻、銅、鎘、鎳等，鉛（plumbum，Pb）是其中對環(huán)境和人體危害較大的一種[1]。在灌溉小麥和水稻時，如果使用含鉛濃度在0.1 mg/L～4.4 mg/L的水，成熟作物中的含鉛量就會顯著增加[2]。有學(xué)者分別研究了重金屬鉛對野生植物種子發(fā)芽和水稻生長情況的影響，結(jié)果表明，Pb的污染對野生種子的發(fā)芽和水稻根系的生長影響顯著[3-4]。鉛還能通過呼吸和消化兩大途徑進入機體并蓄積于體內(nèi)，產(chǎn)生大量的自由基攻擊生物大分子，主要體現(xiàn)在DNA損傷和對特定酶的氧化鈍化，甚至可能破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成機體各大器官等一系列的系統(tǒng)損傷[5-8]。具體表現(xiàn)為：小腦和大腦的皮層細胞損傷[9]；對兒童智力發(fā)育產(chǎn)生損害[10]；免疫系統(tǒng)損傷[11]；心血管系統(tǒng)損傷[12]；腎臟系統(tǒng)損傷[13-14]等。重金屬鉛對人體的這種危害已經(jīng)不容忽視，對重金屬鉛中毒的防治與治療引起眾多學(xué)者的關(guān)注，除西醫(yī)絡(luò)合類藥物及食療驅(qū)鉛等治療方法外，由于微生物具有種類多、來源廣、易獲取等特點，使得對鉛有吸附性及抗氧化活性微生物的利用提供了極大的可能性。

酵母菌是一種單細胞真核微生物，在人類漫長的歷史長河中，很早被人們發(fā)現(xiàn)和利用。直到現(xiàn)在，酵母菌的研究熱度和使用熱度依舊不減，是世界上被研究最多的微生物之一。根據(jù)對酵母菌抗氧化性的研究，酵母菌在受到重金屬脅迫時，自身的抗氧化應(yīng)激酶系統(tǒng)能夠緩解重金屬對菌株的脅迫傷害。重金屬離子在與細胞壁接觸過程中，會與其中多種官能團上的氧、氮、磷、硫等原子配位發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[15-16]。李昌寶等通過對11種酵母發(fā)酵的冬瓜酒進行抗氧化性能力比較發(fā)現(xiàn)，BV818酵母發(fā)酵的冬瓜酒具有良好的·OH、O-2·、DPPH·清除能力，其清除率分別為6.70%、43.25%、45.73%[17]。崔靜等對釀酒酵母細胞壁上的多糖類物質(zhì)抗氧化性進行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度升高至2.0 mg/mL時，對·OH清除率高達91.5%[18]；王欣卉等通過研究酵母菌中的金屬硫蛋白發(fā)現(xiàn)，其能夠顯著降低錦鯉腎臟中的Pb2+含量[19]。邵昭等通過對固定化酵母菌吸附重金屬離子規(guī)律進行研究發(fā)現(xiàn)，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高對吸附能力的提高有一定作用[20]。本文選擇對Pb2+的耐受質(zhì)量濃度在6 000 mg/L～7 000 mg/L之間的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8，對其進行一系列抗氧化能力試驗，并研究pH值、濕菌體濃度、初始Pb2+濃度、吸附溫度、吸附時間等因素對酵母菌吸附Pb2+的影響，為同時具有抗氧化和吸附重金屬特性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)團隊提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]：北京Coolaber公司；2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）：山西東亞化學(xué)工業(yè)有限公司；水楊酸、鄰苯三酚、亞油酸、三羥甲基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、2，6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、硫酸亞鐵[iron（II）sulfate heptahydrate，F(xiàn)eSO4]、抗壞血酸（ascorbic acid，VC）等均為分析純。

KDC-140HR型高速冷凍離心機：安徽中佳儀器有限公司；MBR-022UP型深孔板高速振搖培養(yǎng)箱：日本TAITEC公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；JY 88-IIN型超聲波細胞粉碎機：寧波生物股份有限公司；HF-SAFE 1500型生物安全柜：力康生物醫(yī)療有限公司；SX-500型全自動高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；AAS990型火焰原子吸收光譜儀：北京普析通用公司。

1.1 樣品的制備

將篩選出的高耐受Pb2+的W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8利用酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基進行活化（30℃，160 r/min）培養(yǎng)三代，利用無菌超純水將第三代菌液離心（4 000 r/min，4 min）洗滌3次，制成約為107CFU/mL菌懸液，吸取5 mL，利用超聲波破碎儀（300 W，4 s/6 s，14 min）冰浴破碎處理，離心，取上清液，獲得無細胞提取物。

1.2 菌株抗氧化能力的測定

1.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

以 1、50、100、150、200 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：y=0.397 9x+7.033，R2=0.992 2。用2 mL超純水替代樣品為陰性對照組，用1 mL無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液為空白組，1.5 mL超純水與同體積無水乙醇混合溶液調(diào)零。清除率按公式（1）計算[21]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算清除能力。

式中：A0為樣品組的吸光值；A1為空白組的吸光值；A2為對照組的吸光值。

1.2.2 羥基自由基清除能力的測定

以 1、100、200、400、800 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標(biāo)，羥基自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：y=0.123 4x+0.805 3，R2=0.992 8。用超純水替代樣品為陰性對照組。清除率按公式（2）計算[22]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算清除能力。

式中：A1為樣品組的吸光值A(chǔ)0為陰性對照組的吸光值[22]。

1.2.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定

以 1、50、100、200、300 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標(biāo)，超氧陰離子自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：y=0.3x+10.748，R2=0.992 6。用超純水替代樣品為陰性對照組。清除率按以公式（3）計算[17]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算清除能力。

式中：A1為樣品組的吸光值；A0為陰性對照組的吸光值。

1.2.4 脂質(zhì)過氧化物抑制能力的測定

以 1、50、100、150、200 μg/mL 的 VC濃度為橫坐標(biāo)，脂質(zhì)過氧化物清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：y=0.382 9x+8.717 7，R2=0.990 1。用超純水替代樣品為陰性對照組。清除率按公式（4）計算[23]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算抑制脂質(zhì)過氧化能力。

式中：A0為樣品組的吸光值；AX為陰性對照組的吸光值。

1.3 酵母菌對Pb2+吸附特性的研究

以 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 Pb2+儲備液為橫坐標(biāo)，火焰原子吸收分光光度計測定的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：y=0.009x+0.001 8，R2=0.999 7。根據(jù)公式（5）、（6）計算 Pb2+吸附量和吸附率。

式中：b為未接種酵母菌處理溶液中的Pb2+含量，mg；c為酵母菌處理后溶液中的 Pb2+含量，mg；d為酵母菌的添加量，g。

1.3.1 pH值對酵母菌吸附Pb2+的影響

將 1.4 mL 不同 pH（2.0～6.0）的 100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入菌體濃度為15 g/L的菌懸液，在深孔板搖床（800 r/min，30℃，120 min）條件下進行Pb2+吸附試驗。

1.3.2 菌體濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4 mL pH 6.0的100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入不同菌體濃度（9 g/L～17 g/L）的菌懸液，在深孔板搖床（800 r/min，30℃，120 min）條件下進行Pb2+吸附試驗。

1.3.3 初始Pb2+濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4mLpH6.0的不同Pb2+濃度（100mg/L～500mg/L）儲備液加到48孔方形深孔板中，再加入菌體濃度為15 g/L的菌懸液，在深孔板搖床（800 r/min，30℃，120 min）條件下進行Pb2+吸附試驗。

1.3.4 吸附溫度對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4 mL pH 6.0的100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入菌體濃度為15 g/L的菌懸液，在不同溫度（25℃～45℃）下利用深孔板搖床（800 r/min，120 min）進行Pb2+吸附試驗。

1.3.5 吸附時間對酵母菌吸附Pb2+的影響

將1.4 mL pH 6.0的100 mg/L Pb2+儲備液加到48孔深孔板中，再加入濃度為15g/L的菌懸液，利用深孔板搖床（30℃，800 r/min）分別吸附不同時間（60 min～180min）進行Pb2+吸附試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗3次平行3次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 23.0中的one-way ANOVA和Origin 2018進行數(shù)據(jù)分析及作圖，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 W.anomalus抗氧化能力測定結(jié)果

2.1.1 DPPH·清除能力

按1.2.1方法，酵母菌清除DPPH·結(jié)果見圖1。

圖1 酵母菌菌懸液和無細胞提取物對DPPH·的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of yeast suspension and cell-free extract

由圖1可知，不同的酵母菌對DPPH·清除能力不同，W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 菌懸液對DPPH·清除能力分別是（66.37±2.21）、（85.09±1.11）、（76.89±3.15）μg/mL；超聲破碎離心后的無細胞提取物對 DPPH·清除能力分別是（38.87±1.69）、（46.70±2.25）、（48.45±2.02)μg/mL。菌懸液清除DPPH·水平顯著高于無細胞提取物（p<0.05)，其中W.anomalus QI-1-7菌懸液對DPPH·清除能力最高，但低于陳君試驗中酵母菌對DPPH·的清除能力，原因可能是不同酵母菌間產(chǎn)生的抗氧化活性物質(zhì)分布不同（細胞內(nèi)或菌體表面），從而導(dǎo)致不同酵母菌清除DPPH·能力不同[24]。

2.1.2 羥基自由基清除能力

按1.2.2方法，酵母菌清除羥基自由基結(jié)果見圖2。

圖2 酵母菌菌懸液和無細胞提取物對羥自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of yeast suspension and cell-free extract

由圖2可知，不同的酵母菌對羥基自由基清除能力不同，W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 菌懸液清除羥基自由基的能力分別為（117.95±5.01）、（240.88±7.69）、（100.20±2.76）μg/mL 超聲破碎離心后的無細胞提取物對羥基自由基的清除能力分別是（34.88±0.98）、（107.85±4.55）、（43.56±2.54）μg/mL。W.anomalus菌懸液清除羥基自由基的水平顯著高于無細胞提取物（p<0.05），無論菌懸液還是無細胞提取物，W.anomalus QI-1-7清除羥基自由基能力最優(yōu)。與清除DPPH·不同的是，陳君[24]試驗中酵母菌對羥基自由基的清除能力為 140.81 μg/mL，顯著低于 W.anomalus QI-1-7。

2.1.3 超氧陰離子自由基清除能力

按1.2.3方法，酵母菌清除超氧陰離子自由基結(jié)果見圖3。

由圖3可知，酵母菌不同，對超氧陰離子自由基的清除作用也會有所改變，其中W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8菌懸液清除超氧陰離子自由基能力分別是（137.74±7.30）、（171.41±6.92）、（158.60±7.97）μg/mL；超聲破碎離心后其清除能力分別是（24.70±2.15）、（5.74±0.57）、（34.27±0.91）μg/mL，W.anomalus菌懸液清除超氧陰離子自由基的水平顯著高于（p<0.05）無細胞提取物。由于存在種間差異，特性有所不同，菌懸液和無細胞提取物清除超氧陰離子自由基的能力也不盡相同。柳青[25]試驗中，抗氧化酵母DQ-1-2，F(xiàn)Q-7菌懸液清除超氧陰離子自由基能力分別為27.57%和24.97%，均低于本試驗W.anomalus酵母菌的清除率。

圖3 酵母菌菌懸液和無細胞提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3 Removal of superoxide anions radical by yeast suspension and cell-free extracts

2.1.4 酵母菌抑制脂質(zhì)過氧化能力

按1.2.4方法，酵母菌抑制脂質(zhì)過氧化能力結(jié)果見圖4。

圖4 酵母菌菌懸液和無細胞提取物的抑制脂質(zhì)過氧化能力Fig.4 Inhibition of lipid peroxidation by yeast suspension and cell-free extract

由圖 4 可知，W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8菌懸液抑制脂質(zhì)過氧化能力分別為（144.72±4.53）、（140.32±1.44）、（129.13±2.42）μg/mL，超聲破碎離心后無細胞提取物抑制脂質(zhì)過氧化能力分別為（80.84±1.67）、（76.66±2.17）、（59.94±2.72）μg/mL。其中菌懸液的脂質(zhì)過氧化抑制率顯著高于無細胞提取物的脂質(zhì)過氧化抑制率（p<0.05），W.anomalus QI-1-6菌懸液抑制脂質(zhì)過氧化能力最好，但與W.anomalus QI-1-7無顯著差異（p>0.05）。原因可能是因為完整細胞活性的酵母菌在抑制脂質(zhì)過氧化時產(chǎn)生相同的抗氧化物質(zhì)（如谷胱甘肽、多酚、多糖、酶類），因此抑制脂質(zhì)過氧化能力也相似。這與陳歷水等對12株酵母菌抑制脂質(zhì)過氧化能力進行測定的試驗中酵母菌完整細胞活性（49%～75%）高于相應(yīng)酵母菌提取物（0%～59%）的結(jié)果相似[26]。

2.2 不同因素對酵母菌Pb2+吸附能力的影響

2.2.1 pH值對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同pH值對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖5所示。

圖5 不同pH值對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.5 Effect of different pH values on adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

酵母菌在吸附重金屬過程中，pH值的變化會影響官能團結(jié)合重金屬離子的能力，因此，pH值是影響酵母菌吸附重金屬的主要因素之一。由圖5可知，在pH值升高的同時，吸附率和吸附量也在增大。具體表現(xiàn)為：當(dāng)pH值在2.0～3.0區(qū)間內(nèi)，菌株QI-1-7吸附Pb2+的能力較弱；當(dāng)pH值為5.0時，吸附能力達到最高，且顯著高于其他pH值（p<0.05），此時吸附率和吸附量分別為98.31%、6.55 mg/g。當(dāng)pH值大于5.0時，吸附率不再隨著pH值的增大而增大，反而呈一個負相關(guān)的關(guān)系，原因可能是隨著pH值的繼續(xù)升高，OH-會和金屬離子競爭菌體表面的結(jié)合位點[27]。

2.2.2 不同菌體濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同菌體濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖6所示。

圖6 不同菌體濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.6 Effect of different cell concentration on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

由圖6可知，當(dāng)菌體濃度為9 g/L～17 g/L，菌體吸附率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)菌體濃度為15 g/L時，吸附率達到最高的98.76%。當(dāng)菌體濃度為9 g/L時，吸附量最多，為7.96 mg/g，具體表現(xiàn)為：當(dāng)菌體濃度為9 g/L～15 g/L時，菌株QI-1-7的吸附能力維持在一個較高的水平，吸附量在6.5 mg/g～7.9 mg/g之間；當(dāng)菌體濃度為17g/L時，吸附量出現(xiàn)顯著的下降（p<0.05）。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于菌體QI-1-7在高的濃度下，部分細胞聚集導(dǎo)致細胞壁中化學(xué)反應(yīng)基團（OH-、COO-和NH3+）之間的內(nèi)部連接發(fā)生羥氨基化和酰胺化反應(yīng)，從而減少了金屬離子在菌體中的吸附[28]。

2.2.3 初始Pb2+濃度對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同初始Pb2+濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖7所示。

圖7 不同初始Pb2+濃度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.7 Effect of different initial Pb2+concentrations on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

由圖7可知，隨著初始Pb2+濃度的增大，吸附率逐漸下降，反觀吸附量，呈現(xiàn)增長的趨勢。具體表現(xiàn)為：當(dāng)Pb2+濃度為100 mg/L時，此時吸附率為最大值，達到98.98%；Pb2+濃度為500 mg/L時，吸附率達到最低的49.85%。當(dāng)Pb2+濃度為100 mg/L時，吸附量最低，為6.60 mg/g，隨著Pb2+濃度的持續(xù)升高呈現(xiàn)一個勻速增長的過程，Pb2+濃度增長到500 mg/L時，吸附量達到最高的16.62 mg/g。推測原因可能是：Pb2+濃度為100 mg/L時，菌株QI-1-7表面的結(jié)合位點較少，無法與較多的Pb2+進行結(jié)合所以吸附量較少；當(dāng)Pb2+濃度增大到500 mg/L時，菌株QI-1-7表面上的結(jié)合位點與Pb2+的結(jié)合逐漸趨于飽和，吸附率不再發(fā)生顯著變化，此時吸附量最大。本研究與Li等[29]和Wahab[30]的結(jié)論基本一致，而Gunjal等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著Pb2+質(zhì)量濃度的升高，菌體細胞對Pb2+的吸附量及吸附率均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，表明不同微生物對Pb2+的吸附能力有差異。

2.2.4 吸附溫度對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同吸附溫度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖8所示。

圖8 不同吸附溫度對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.8 Effect of different adsorption temperature on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

酵母菌QI-1-7在吸附重金屬Pb2+過程中，吸附溫度的變化會影響酵母菌吸附Pb2+的能力。由圖8可知，當(dāng)吸附溫度為25℃時，對菌株QI-1-7的吸附量和吸附率影響顯著；菌株QI-1-7在35℃時，吸附率與吸附量達到最大值，分別為98.2%和6.55 mg/g，吸附溫度超過35℃之后，隨著溫度的上升，菌株QI-1-7吸附Pb2+的能力呈顯著下降的趨勢。由此可知，酵母菌的最適宜生長溫度為35℃左右，在該溫度下，菌株可以保持較強的吸附能力，不論是溫度升高又或者是溫度降低，都會有一些細胞喪失活性，影響菌株的吸附率以及吸附量。本研究與趙曉峰對兩株高耐鉛菌株E.hirae Qaa和P.pento-saceus Fe3進行的不同溫度下鉛吸附試驗結(jié)果一致[32]。

2.2.5 吸附時間對酵母菌吸附Pb2+的影響

不同吸附時間對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響如圖9所示。

圖9 不同吸附時間對W.anomalus QI-1-7吸附Pb2+的影響Fig.9 Effect of different adsorption time on the adsorption of Pb2+by W.anomalus QI-1-7

由圖9可知，吸附時間達到150 min時，菌株QI-1-7吸附Pb2+的吸附率及吸附量達到最高，分別為98.87%和6.59 mg/g，與120 min和180 min時的吸附率及吸附量無顯著差異（p>0.05）。原因可能是菌株QI-1-7的吸附方式為胞外結(jié)合。當(dāng)細胞與Pb2+相接觸時，存在于細胞表面上的活性基團在靜電結(jié)合的作用下，開始與Pb2+進行結(jié)合，吸附能力會增強，活性基團的結(jié)合位點會隨著時間的推移逐漸趨向飽和狀態(tài)，此時吸附進入到平穩(wěn)的狀態(tài)，同時也表明，菌株QI-1-7對Pb2+的吸附是一個比較快的過程。

3 結(jié)論

W.anomalus QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 菌懸液和無細胞提取物都具有一定的抗氧化能力，菌懸液抗氧化能力顯著高于無細胞提取物（p<0.05）。W.anomalus QI-1-6菌懸液對DPPH·清除能力較好，達到（144.72±4.53）μg/mL；W.anomalus QI-1-7菌懸液對 DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較好，分別達到（85.09±1.11）、（240.88±7.69）、（171.41±6.92）μg/mL。

當(dāng)pH值為5時，W.anomalus QI-1-7對Pb2+的吸附能力最強，此時吸附率為98.31%；菌體濃度為15 g/L時，吸附率為98.75%；Pb2+濃度為100 g/L時，吸附率為98.97%；溫度為35℃時，吸附率為98.20%；吸附時間為150 min時，菌株QI-1-7對重金屬Pb2+的吸附能力最強，吸附率達到98.87%。