MLST在乳酸菌鑒定及其多樣性分析中的應(yīng)用

趙塵培，姜琳琳，張建龍，陳國(guó)忠，于馨，朱洪偉，張興曉

（魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠發(fā)酵糖類物質(zhì)最終產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在細(xì)菌分類學(xué)上將乳酸細(xì)菌分為43個(gè)屬，包括373個(gè)種及亞種[1]。目前，在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用最多的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、雙歧桿菌屬及片球菌屬等。這些乳酸菌株可以定植在人和動(dòng)物的腸道中，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降膽固醇及抑菌等功能。其中，乳酸菌在菌株水平上的分化是決定菌株功能差異性的重要因素。因此，在菌株水平上精確鑒定乳酸菌是非常重要的，可消除不同來(lái)源菌株對(duì)功能的影響。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）發(fā)展起來(lái)的許多分子分型方法被用于乳酸菌及其亞種的分類鑒定及種群遺傳進(jìn)化分析研究。例如，基于16S rDNA測(cè)序、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）以及聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,CAPs）等技術(shù)，對(duì)乳酸菌株的特異性鑒定具有重要意義。其中，16SrDNA技術(shù)難以區(qū)分近緣種或亞種，而其它分子技術(shù)依賴于電泳圖譜，對(duì)工作量、辨識(shí)度、成本及重現(xiàn)性要求較高，使其應(yīng)用受到局限[2]。而多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing,MLST）技術(shù)依靠表征菌株不同管家基因位點(diǎn)的等位基因，可以區(qū)分不同菌株的序列類型（sequence type,ST）以及克隆復(fù)合體（clonal complex,CC），具有較高的區(qū)分性，已廣泛用于致病菌的遺傳多樣性分析[3]。近些年該方法開始應(yīng)用在非致病性食品菌株乳酸菌株的遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)及微進(jìn)化研究中。

1 多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)

多位點(diǎn)序列分型（MLST）是一種基于多個(gè)管家基因部分片段的核苷酸序列分析來(lái)區(qū)分相同微生物物種分離株的基因分型技術(shù)。近幾十年，MLST已經(jīng)發(fā)展成為監(jiān)測(cè)細(xì)菌進(jìn)化及遺傳多樣性的有效技術(shù)手段。最初Maiden等應(yīng)用11個(gè)管家基因?qū)?07株腦膜炎奈瑟菌的菌株間等位基因多樣性進(jìn)行比較評(píng)估[4]，后來(lái)擴(kuò)展到其它的細(xì)菌種類，來(lái)監(jiān)測(cè)菌株種群內(nèi)的基因重組現(xiàn)象，分析細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的進(jìn)化關(guān)系。MLST技術(shù)已成功被用于了解干酪乳桿菌(Lactococcus casei)、酒類酒球菌(Oenococcus oeni)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)等諸多乳酸菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系。

1.1 MLST管家基因的確定

MLST用于表征細(xì)菌的遺傳多樣性，主要依賴于管家基因選擇及其內(nèi)部片段的核苷酸序列。管家基因是生物體細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)的一類基因。在MLST研究中，選擇管家基因主要是由于核苷酸序列變異速率相對(duì)較慢，多態(tài)性相對(duì)于其它基因程度低，并且細(xì)菌不同菌株間在管家基因內(nèi)仍具有足夠的變異，在相同基因座上提供足夠數(shù)量的獨(dú)特等位基因，所以選擇合適的管家基因在MLST中顯得尤為重要。被選擇的管家基因應(yīng)為長(zhǎng)度不短于1 kb單拷貝基因，具有編碼蛋白的功能，并盡量涵蓋整個(gè)染色體[5]。不同乳酸菌MLST方案管家基因的選擇及數(shù)量見表1。

對(duì)于管家基因數(shù)量的選擇原則是省時(shí)省力，并具有一定的分辨率以保證獲得足夠的序列型。所以綜合考慮，一般6個(gè)～10個(gè)管家基因基本能夠滿足菌株群體變異分析的要求[14]。如表1所示關(guān)于乳酸菌的MLST分析中，管家基因的選擇同樣遵循上述原則。在植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MLST方案中，設(shè)計(jì)了7個(gè)管家基因[15]，而在親緣關(guān)系相近且樣品來(lái)源特殊菌株的MLST分析中，例如發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的研究中，管家基因設(shè)計(jì)為11個(gè)[16]。最后，目標(biāo)基因的片段長(zhǎng)度一般為450 bp左右，通過(guò)一些菌株分型的試驗(yàn)證明，該長(zhǎng)度的目的基因足以用來(lái)監(jiān)測(cè)物種的變異情況及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。當(dāng)然，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，較長(zhǎng)片段的基因檢測(cè)已成為可能。在乳酸菌的MLST研究中，為了獲取更多的遺傳信息，人們開始選擇600 bp～700 bp的目的片段[17-18]。

表1 不同乳酸菌MLST方案管家基因的選擇及數(shù)量Table 1 Option and quantity of housekeeping genes in different lactic acid bacteria MLST schemes

1.2 MLST結(jié)果分析

多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)流程圖見圖1。

如圖1所示，MLST技術(shù)是以等位基因圖譜和序列分型（ST）為基本分析單位。應(yīng)用測(cè)序技術(shù)對(duì)目的基因序列進(jìn)行分析，提交至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得等位基因編號(hào)，所有等位基因的編號(hào)組成菌株最終的序列型?？蓪⑷樗峋蛄刑峤恢罰ubMLST及BIGSdb等數(shù)據(jù)庫(kù)。

圖1 多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)流程圖Fig.1 Technical flow chart of Multi-site sequence typing(MLST)

在乳酸菌的序列分型中，若管家基因中有最多不超過(guò)2個(gè)位點(diǎn)等位基因不同，則可以聚集為一個(gè)克隆復(fù)合體（CC）[19]。例如在Bao等的副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）MLST方案中，分析定義10個(gè)等位基因，確定了71個(gè)ST型和25個(gè)克隆復(fù)合體[7]。運(yùn)用START、eBURST、MEGA、Sturcture、SplitsTree 等生物信息學(xué)分析軟件，對(duì)序列進(jìn)行分析。其中，先利用MEGA軟件進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，獲得等位基因圖譜；START軟件主要分析多態(tài)性位點(diǎn)、核酸多態(tài)性（π）、G+C含量（%）等；eBURST軟件對(duì)ST型進(jìn)行克隆復(fù)合體歸類分析；在Duan的研究中利用eBURST軟件對(duì)馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）不同 ST型進(jìn)行分析，確定了具有相同起源的菌株[20]。然后使用Sturcture及SplitsTree軟件對(duì)分離菌株的遺傳進(jìn)化關(guān)系和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)在乳酸菌分類中的應(yīng)用

乳酸菌具有較高的物種多樣性，在食品工業(yè)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，其分子水平上的鑒定，對(duì)該菌株的種群生物學(xué)研究具有重要意義。MLST最初應(yīng)用于致病菌的進(jìn)化和種群生物學(xué)研究，由于具有較高的分辨能力，已拓展至乳酸菌的多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化分析。目前，MLST已用于乳酸菌的進(jìn)化和種群結(jié)構(gòu)分析，包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬等。

2.1 MLST在乳桿菌屬（Lactobacillus）遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

MLST技術(shù)在乳桿菌屬中的應(yīng)用見表2。

新彩繪畫起稿有大致幾個(gè)步驟，起圖、升圖、作圖、拍圖、勾勒、上色等。起圖是用單黑水繪制大概紋樣，升圖是用墨水與上勾勒一邊，主要目的是為了畫面更精細(xì)，把多余不需要的精細(xì)刪減，對(duì)于繪制畫面而言是一個(gè)提升的過(guò)程從而達(dá)到最后定稿的目的。作圖是于后在瓷器上復(fù)出正稿，拍圖則是需要大量批量，可以重復(fù)使用。

表2 MLST技術(shù)在乳桿菌屬中的應(yīng)用Table 2 Application of MLST in Lactobacillus

目前，MLST用于闡明乳桿菌屬的進(jìn)化和種群結(jié)構(gòu)主要包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、清酒乳桿菌等。

最初，MLST用于從發(fā)酵水果和蔬菜以及青貯飼料、葡萄酒、泡菜和奶酪中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的鑒定。由于受分離株數(shù)量的限制，對(duì)于植物乳桿菌的遺傳多樣性分析不夠準(zhǔn)確。2015年，Xu等采用8個(gè)等位基因的MLST技術(shù)分析了179株分離自不同地理區(qū)域、不同來(lái)源的植物乳桿菌及7株參考菌株，涵蓋全部遺傳多樣性和種群物種的結(jié)構(gòu)[11]。結(jié)果顯示186株分離株具有73個(gè)不同的序列類型（ST），形成 10個(gè)克隆復(fù)合體（CCs），共有 158個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，來(lái)自相同生態(tài)位的植物乳桿菌分離株具有相似的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，對(duì)乳酸菌的微生態(tài)學(xué)研究具有重要意義。

2015年，Dan等首次利用MLST技術(shù)對(duì)203株發(fā)酵乳桿菌的11個(gè)管家基因進(jìn)行多樣性分析[8]，研究結(jié)果得到57個(gè)序列分型（ST），其中27株菌屬于獨(dú)立的序列型，表明具有高度的遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，發(fā)酵乳桿菌的分離株主要分為兩個(gè)主要類群，同一類群中的發(fā)酵乳桿菌分離株進(jìn)化關(guān)系較近。另外，Sulaiman等利用MLST技術(shù)檢測(cè)速食罐頭中的發(fā)酵乳桿菌[16]，表明MLST技術(shù)中的管家基因可以為發(fā)酵乳桿菌的物種鑒定提供依據(jù)，并可用于罐頭食品的安全監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。

干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌及副干酪乳桿菌中的其它亞種親緣關(guān)系非常近，而傳統(tǒng)的發(fā)酵特性很難進(jìn)行區(qū)分，因此需要結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。Feng等利用7個(gè)管家基因?qū)?00株來(lái)自西藏自然發(fā)酵乳制品的乳酸菌進(jìn)行多樣性研究，設(shè)計(jì)并創(chuàng)建了有針對(duì)性的MLST方案[23]。另外研究表明，增加dnaK基因可以明顯區(qū)分出這4株菌。因此，dnaK基因可以作為干酪乳桿菌的一個(gè)附加分子系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，利用該基因測(cè)序可以很容易地解決這些菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[22]。這對(duì)干酪乳桿菌菌株的管理及溯源具有重要意義。

2.2 MLST在鏈球菌屬（Streptococcus）遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

嗜熱鏈球菌被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理（Food and Drug Administration,FDA）認(rèn)定為鏈球菌屬93個(gè)物種中唯一具有“安全”狀態(tài)且在酸奶、奶酪和其他乳制品發(fā)酵中具有重要作用的菌株[42]。人們對(duì)嗜熱鏈球菌的分離與研究工作開始于上個(gè)世紀(jì)初。最初通過(guò)分析對(duì)比16S rRNA和超氧化物歧化酶基因，認(rèn)為嗜熱鏈球菌與唾液鏈球菌親緣關(guān)系相近，曾一度被劃為唾液鏈球菌的一個(gè)亞種，直到1991年通過(guò)DNA-DNA重組試驗(yàn)才將嗜熱鏈球菌恢復(fù)到種的水平。因此，分析嗜熱鏈球菌的多樣性及種群結(jié)構(gòu)對(duì)于理解其生態(tài)進(jìn)化及其在工業(yè)上應(yīng)用非常重要。Yu等開發(fā)了10個(gè)管家基因的MLST分析方案[43]，對(duì)不同生態(tài)來(lái)源和地理區(qū)域分離的239株嗜熱鏈球菌和36個(gè)全基因組菌株（18株嗜熱鏈球菌，2株前庭鏈球菌和16株唾液鏈球菌）進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌分離株的進(jìn)化與地理位置有一定關(guān)系，但與發(fā)酵乳制品的類型無(wú)關(guān)。對(duì)36個(gè)全基因組菌株（18株嗜熱鏈球菌、2株前庭鏈球菌和16株唾液鏈球菌）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，MLST方案可以清楚地分離唾液鏈球菌的3個(gè)密切相關(guān)的物種，并且適合于分析種群結(jié)構(gòu)，這對(duì)研究不同地理區(qū)域的嗜熱鏈球菌菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有重要意義。

2.3 MLST在乳球菌屬（Lactococcus）遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

乳酸乳球菌屬（Lactococcus lactis）包含乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp.cremoris）和乳酸乳球菌霍氏亞種（Laclococcus lactis subsp.hordniae）、Laclococcus lactis subsp.tructae 4個(gè)亞種。其中，Lactococcus lactis subsp.lactis與 Lactococcus lactis subsp.cremoris在乳制品的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，尤其是在干酪的生產(chǎn)過(guò)程中，發(fā)揮重要的作用。所以，從食品工業(yè)和科學(xué)研究的角度，對(duì)這兩個(gè)亞種的區(qū)分就顯得尤為重要。

3 多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）在乳酸菌基因組多樣性分析中的應(yīng)用

乳酸菌基因組上的遺傳信息具有復(fù)雜性和多樣性，而基因的遺傳變異是追溯菌株進(jìn)化發(fā)展的重要依據(jù)，因此乳酸菌基因組多樣性也是關(guān)注的焦點(diǎn)之一。MLST技術(shù)雖然具有分辨率強(qiáng)、精確度高、數(shù)據(jù)可重復(fù)性好、菌株間數(shù)據(jù)可標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，但其畢竟只局限于基因組上的個(gè)別位點(diǎn)，有可能遺漏一些遺傳信息，導(dǎo)致菌株間的親緣及進(jìn)化關(guān)系存在偏差。隨著分子生物學(xué)及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，比較基因組雜交（comparative genome hybridization，CGH）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等技術(shù)成為提高其分辨力的良好補(bǔ)充。

唾液乳酸菌（Lactobacillus salivarius）是人類和動(dòng)物的口腔及胃腸道中重要的益生菌。盡管從不同環(huán)境來(lái)源中分離出來(lái)較多的唾液乳桿菌，但是關(guān)于環(huán)境對(duì)菌株的基因組多樣性的影響卻缺乏相應(yīng)的研究。Raftis等為了研究此問(wèn)題[41]，應(yīng)用MLST和比較基因組雜交技術(shù)（CGH），對(duì)來(lái)自人、動(dòng)物或食品中的33株唾液乳桿菌進(jìn)行基因多樣性分析。MLST技術(shù)清晰地分離了人源和動(dòng)物源菌株，而CGH方法基于對(duì)總基因組含量（包括小質(zhì)粒）的分析，確定了18個(gè)主要的基因組變異區(qū)域及變異熱點(diǎn)，表明唾液乳酸菌具有高水平的基因多樣性，這些基因揭示了菌株之間具有的特異性特征，包括碳水化合物利用、細(xì)菌素及胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）的產(chǎn)生，這項(xiàng)研究有助于了解唾液乳桿菌基因組的進(jìn)化規(guī)律與唾液乳桿菌生態(tài)位適應(yīng)和益生潛力之間的關(guān)系。

2014 年，González-Arenzana 等研究發(fā)現(xiàn) MLSTPFGE組合方法在30株酒明串珠菌（Oenococcus oeni）菌株鑒定上具有較高的分辨率[47]。MLST揭示了點(diǎn)突變以及少數(shù)基因中位點(diǎn)的缺失和突變，而脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）對(duì)大規(guī)?；蚪M重排更敏感。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種分型方法的組合可以得到最多的基因型數(shù)量（22種）及多樣性指數(shù)（ID值，0.947），這意味著PFGE和MLST技術(shù)組合可能會(huì)成為Oenococcus oeni菌株的可靠分型方法。

舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）是中國(guó)傳統(tǒng)酸面團(tuán)中的主要乳酸菌。Yang等通過(guò)多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)和多重隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)研究來(lái)自不同區(qū)域的11個(gè)中國(guó)傳統(tǒng)酸面團(tuán)中98株舊金山乳桿菌的種內(nèi)多樣性[12]。MLST揭示了10種不同的序列型（ST），其中6種就包含79.8%的分離株，并且被歸為同一種克隆復(fù)合體，表明它們之間進(jìn)化關(guān)系相近。多重RAPD-PCR技術(shù)將98株舊金山乳桿菌分離株分為6種類型，相似度為70%。MLST與多重RAPD-PCR相比具有更高的區(qū)分能力，但是多重RAPD可以幫助區(qū)分同一ST型中的某些菌株。因此，在MLST和多重RAPD-PCR技術(shù)組合下，針對(duì)不同遺傳變異，獲得了舊金山乳桿菌的最佳基因型特征。

4 展望

近年來(lái)，隨著乳酸菌的益生功能的不斷研究，乳酸菌制劑的生產(chǎn)及銷售量日漸增多，因此對(duì)乳酸菌菌株的精確鑒定及多態(tài)性研究已成為乳酸菌產(chǎn)業(yè)化的重要前提。MLST被認(rèn)為是細(xì)菌基因分型技術(shù)中的金標(biāo)準(zhǔn)，在乳酸菌的種群結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性的研究方面取得了一定的進(jìn)展。然而，在過(guò)去的幾十年中，MLST主要利用管家基因來(lái)進(jìn)行菌株的分類及鑒定，而對(duì)菌株基因多樣性與遺傳背景的相關(guān)性缺乏研究。由于乳酸菌的益生功能受不同地理區(qū)域、不同來(lái)源及不同環(huán)境因子的影響，因此，以特定的功能基因?yàn)橹饕獦?biāo)記分子進(jìn)行乳酸菌遺傳多樣性的分析，可以從不同的寄主和地理位置區(qū)分同一種屬的乳酸菌，并可以鑒定與之密切相關(guān)的菌株，對(duì)乳酸菌益生功能的開發(fā)具有重要意義。MLST方法已經(jīng)發(fā)展到基于幾百個(gè)基因的核心基因組MLST（core genome MLST）到幾千個(gè)基因的全基因組MLST(whole genome MLST)，這種大規(guī)模的MLST方案已被證明具有更高的分辨率。所以，可以將MLST技術(shù)與其相結(jié)合，全面、系統(tǒng)地了解乳酸菌基因組的結(jié)構(gòu)和組成，健全乳酸菌不同種屬的MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，促進(jìn)世界范圍內(nèi)乳酸菌株的遺傳進(jìn)化研究。