大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的富集分離研究

王昱婷 王笑宇 許 晶

大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的富集分離研究

王昱婷 王笑宇 許 晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

以低溫脫脂豆粕為原料，采用優(yōu)化Nagano法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白。本文系統(tǒng)考察提取過程中多個(gè)單因素對(duì)分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量和提取率的影響。并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量進(jìn)行優(yōu)化，分別確定高提取率大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離條件。試驗(yàn)結(jié)果表明：大豆球蛋白的最佳提取條件為浸提溫度44.4℃，浸提pH 8.5，CaCl220 mmol／L，提取率64.14%，純度83.6%；β－伴大豆球蛋白的最佳提取條件為浸提溫度49.5℃，浸提pH 8.6，CaCl20.00 mmol／L，提取率40.15%，純度82.9%。

大豆球蛋白 β－伴大豆球蛋白 富集 分離

大豆蛋白作為一種重要的植物蛋白，具有優(yōu)良的功能性質(zhì)和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。按照沉降模式，大豆蛋白可分為4個(gè)主要的組分：2S、7S、11S 和15S［1－2］，其中11S 的成分是大豆球蛋白，即11S球蛋白；7S的主要成分是β－伴大豆球蛋白，即7S球蛋白。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白二者結(jié)構(gòu)不同，在理化性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性方面均有很大差異［3］。因此，如何從大豆蛋白中高效分離這兩種組分是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。

目前，Thanh 法［4］、Saio 法［5］和Nagano 法［6］是分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的3種主要方法。在這3 種方法的基礎(chǔ)上，王孝英等［7］、段春紅等［8］、朱曉燁等［9］、姜?jiǎng)Φ龋?0］、宋佳等［11］不斷改進(jìn)和完善試驗(yàn)方法，簡(jiǎn)化了分離步驟，提高了產(chǎn)品的純度。但結(jié)合Thanh法、Saio法、Nagano法3種經(jīng)典方法，在保證一定蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)上，單獨(dú)的分別確定大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白高提取率的系統(tǒng)優(yōu)化鮮見報(bào)道。

本研究采用優(yōu)化Nagano法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，基于Thanh法和Saio法加入沉淀劑，系統(tǒng)考察浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量對(duì)分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量和提取率的影響。在保證一定蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量進(jìn)行優(yōu)化，為分別得到高收率的大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕：哈高科；NaOH、SBS（NaHSO3）、NaCl、HCl、電泳試劑盒、Tris 堿、甘氨酸、SDS（十二烷基硫酸鈉）、考馬斯亮蘭R250、冰乙酸、甲醇、溴酚藍(lán)、DTT、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鉀（K2SO4）、濃硫酸（H2SO4）、硼酸、碳酸鈉、甲基紅、溴甲酚綠，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；HSY2－SP電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；ZD－2型自動(dòng)電位滴定儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LNK－872型多功能快速消化器：江蘇省宜興市科教儀器研究所制造；自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂大豆粉的制備

將低溫脫脂大豆粕經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過50目篩，得低溫脫脂大豆粉。

1.3.2 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離方法

采用優(yōu)化Nagano法［6］分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，分離流程圖見圖1。

圖1 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白分離流程圖

蛋白提取率＝（凍干粉中蛋白含量×凍干粉質(zhì)量）／（脫脂豆粉中的蛋白含量×脫脂豆粉質(zhì)量）×100%

1.3.3 單因素試驗(yàn)

通過3組單因素試驗(yàn)考察浸提溫度（25、35、45、55、65 ℃）、浸提pH（8.0、8.5、9.0）、沉淀劑用量（0、5、10、20、30 mmol／L）對(duì)分離大豆球蛋白和β － 伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量及提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用響應(yīng)面分析以浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量為試驗(yàn)因素，分別以大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box－Behnken試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分析

根據(jù)Laemmli法［12］的SDS－PAGE 不連續(xù)電泳方法，分別配制5%的分離膠，12%的濃縮膠，上樣量為10μL。開始電泳時(shí)電壓為80 V，樣品到達(dá)分離膠后改為120 V，電泳結(jié)束后，取出膠片用考馬斯亮藍(lán)R－250染色，然后用甲醇／冰醋酸脫色后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析。

1.3.6 結(jié)果分析

根據(jù)凱氏定氮法［13］進(jìn)行蛋白質(zhì)含量分析，采用BandScan 5.0軟件進(jìn)行SDS－PAGE分離效果和蛋白組分純度分析，采用Microsoft Office Excel 2007和Design－Expert 8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸提溫度的確定

較高的溫度有利于蛋白溶出，但過高的溫度又會(huì)造成蛋白變性。Riblett等［2］報(bào)道大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的最初變性溫度接近82℃和68℃。因此本試驗(yàn)浸提溫度選擇25～65℃。隨著溫度升高大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量和提取率先增加后減少（除65℃ β－伴大豆球蛋白提取率），在45℃時(shí)最高。65℃ β－伴大豆球蛋白提取率又出現(xiàn)上升，這可能是由于浸提溫度升高蛋白質(zhì)變性并產(chǎn)生熱聚集導(dǎo)致的。

表2 浸提溫度對(duì)大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量及提取率的影響

2.1.2 浸提pH的確定

Than法的浸提pH是8.0。但大豆球蛋白的基本亞基的等電點(diǎn)是8.0～8.5，較低的pH值（低于8.0）對(duì)于基本亞基的提取是不利的［14］。因此，進(jìn)一步考察浸提pH是必要的，試驗(yàn)結(jié)果見表3。在pH 8.5的條件下提取大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量和提取率最高，選擇浸提pH 8.5。

表3 浸提pH對(duì)大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量及提取率的影響

2.1.3 沉淀劑用量的確定

鈣鹽沉淀法［15］可用于提取大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，試驗(yàn)考查了0～30 mmol／L CaCl2沉淀劑對(duì)提取結(jié)果的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表4。隨著沉淀劑用量的增加，大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量下降，且分別保證在80%和65%以上，可以用于一定的性質(zhì)測(cè)定；但大豆球蛋白的提取率從0～10 mmol／L CaCl2明顯增加，然后10 ～ 30 mmol／L CaCl2趨于平緩，β－伴大豆球蛋白的提取率隨之從0 ～10 mmol／L CaCl2明顯下降，這與Zi等［16］研究結(jié)論一致，然后10～30 mmol／L CaCl2趨于平緩。因此，10 mmol／L CaCl2沉淀劑的加入與否對(duì)大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的提取率有很大影響。

表4 沉淀劑用量對(duì)大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)含量及提取率的影響

2.2 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

使用Design－Expert 8.0.6軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，可以得到如下的回歸方程：

大豆球蛋白＝54．45 －0．93A －0．75B ＋19．52C －0．20AB ＋0．24AC ＋0．58BC －5．79A2－4．87B2－8．58C2

β－伴大豆球蛋白＝6．94＋0．75A＋0．31B －17．58C ＋0．035AB － 0．74AC － 0．47BC － 1．67A2－1．63B2＋15．19C2

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表6。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白模型P＞F小于0.000 1，說明該模型是極顯著的。此外在模型中的其他參數(shù)A、B、C、BC、A2、B2、C2都是顯著的（P ＞ F 小于0.05）。模型失擬項(xiàng)Lack of Fit（P ＞F 大于0.05），說明模型失擬項(xiàng)是不顯著的，結(jié)果表明該模型選擇合適；相關(guān)系數(shù)均大于0.9，說明模型擬合程度良好；大豆球蛋白模型的變異系數(shù)為1.04，β－伴大豆球蛋白模型的變異系數(shù)為4.42，表示所得的模型方程可以反映真實(shí)的試驗(yàn)值。通過上述分析，可知能用該模型來分析大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率的變化。

經(jīng)過表6的回歸分析，可以得出浸提溫度A、浸提pH B、沉淀劑加入量C三因素對(duì)考察指標(biāo)交互作用影響，采用響應(yīng)面分析法，得到大豆球蛋白預(yù)測(cè)的最佳提取條件為浸提溫度44.41℃，浸提pH 8.49，CaCl220 mmol／L，提取率65.42%；β－伴大豆球蛋白預(yù)測(cè)的最佳提取條件為浸提溫度49.51℃，浸提pH 8.62，CaCl20.00 mmol／L，提取率40.15%。由于表5響應(yīng)面設(shè)計(jì)中，不包含分析得到的最佳提取條件，需要檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性。本試驗(yàn)結(jié)合實(shí)際操作情況，根據(jù)優(yōu)化條件對(duì)大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取條件進(jìn)行修正，大豆球蛋白提取條件修正為浸提溫度44.4℃，浸提pH8.5，CaCl2

20 mmol／L，β－伴大豆球蛋白提取條件修正為浸提溫度49.5 ℃，浸提pH 8.6，CaCl20.00 mmol／L，然后進(jìn)行提取測(cè)得大豆球蛋白蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)81.64%，提取率為64.14%，β－伴大豆球蛋白蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.84%，提取率為40.15%，與回歸方程預(yù)測(cè)值基本吻合，表明模型是合理有效的。

表6 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白響應(yīng)面方差分析

表6 （續(xù)）

2.3 不同方法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白效果的比較

SDS－PAGE凝膠電泳技術(shù)測(cè)定Saio法、Thanh法、Nagano法、優(yōu)化Nagano法分離出大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，比較蛋白分離效果和純度，其SDS－PAGE圖見圖2。根據(jù)電泳圖譜，用凝膠分析軟件（BandScan5.0）對(duì)SDS－PAGE電泳圖像中的條帶進(jìn)行含量分析，分析結(jié)果列于表7。

圖2 不同方法分離大豆球蛋白β－伴大豆球蛋白電泳圖

4種方法的大豆球蛋白組分和β－伴大豆球蛋白組分亞基組成和含量不同。由圖3、表7可知，Saio法分離的β－伴大豆球蛋白組分與大豆球蛋白組分并未完全分開，而Thanh法分離效果較好，Nagano方法分離效果最好，純度更高，本試驗(yàn)優(yōu)化后方法，大豆球蛋白分離純度沒有Nagano高，這可能是由于沉淀劑CaCl2的加入，但在蛋白質(zhì)含量和大豆球蛋白分段含量一定下，提取率較高，可以用于后續(xù)性質(zhì)測(cè)定。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)表明，該大豆球蛋白組分中大豆球蛋白純度為83.6%，β－伴大豆球蛋白組分中β－伴大豆球蛋白純度82.9%。采用優(yōu)化Nagano法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白得到樣品的純度較高，基本達(dá)到了預(yù)期的效果。

3 結(jié)論

本研究在Thanh法、Saio法和Nagano法3種提取大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的主要方法基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離方法，優(yōu)化的Nagano法提高了大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的提取率（大豆球蛋白可達(dá)64.14%和β－伴大豆球蛋白可達(dá)40.15%），且純度為大豆球蛋白83.6%和β－伴大豆球蛋白82.9%，為進(jìn)一步的實(shí)際生產(chǎn)提供了參考。

表7 大豆球蛋白中亞基含量分析

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Enrichment and Separation Study on Glycinin and β－conglycinin

Wang Yuting Wang Xiaoyu Xu Jing
（College of Science，Northeast Agricultural University，Haerbin 150030）

Based on low － temperature defatted soybean meal as raw material，this paper adopted the method of optimization of Nagano for separation of glycinin andβ－conglycin.This paper studied effect of the multiple single factors on protein content and extraction yield of glycinin andβ－conglycin in the process of extraction.According to the results of single factor experiment，we designed response surface experiments，and the extraction temperature，extraction pH and amount of precipitant were optimized.We had respectively determined the separation conditions for glycinin andβ－conglycin with high extraction yield.The experimental results showed that the optimum extraction conditions of glycinin were extraction temperature of 44.4 ℃，extraction pH of 8.5，CaCl220 mmol／L，the extraction yield of 64.14%and purity of 83.6%；the optimum extraction conditions of ptionglycin were extraction temperature of 49.5 ℃，extraction pH of 8.6，CaCl20.00 mmol／L，the extraction yield of 40.15%and purity of 82.9%.

glycinin，β － conglycin，enrichment，separation

TS209

A

1003－0174（2016）08－0024－06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301600），中國(guó)博士后特別資助（2014T70306），哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2014RFQXJ123），黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12541008）

2014－12－11

王昱婷，女，1989年出生，碩士，植物蛋白工程

許晶，女，1979年出生，副教授，糧食、油脂與植物蛋白工程