矢車菊素-3-葡萄糖苷與大豆蛋白相互作用的多重光譜分析及分子對接

黃 國，陳 騏，池云峰，羅小雪，衣艷嬌，王 迪，隋曉楠

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑米作為我國一類有色稻米，因其良好的口感和香氣而被廣泛食用。黑米的“有色”歸因于較高含量的花青素和原花青素。黑米中游離花青素對其總量的貢獻率在99.5%～99.9%之間[1]。黑米中主要花青素有矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）和芍藥色素-3-葡萄糖苷，前者的含量明顯高于后者[2]。花青素被視為自然界的天然色素，具有預防、治療心血管疾病、抗癌抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)以及良好的清除自由基能力，在食品與醫(yī)療、保健等領域的產(chǎn)品生產(chǎn)、開發(fā)中起到重要作用[3]。但由于易受pH值、溫度、輻射與氧氣等環(huán)境因素的影響，花青素在加工與貯藏過程中往往發(fā)生高度降解或破壞，導致其加工穩(wěn)定性差，生物利用度低下，成為在食品工業(yè)應用中的最大阻礙[4]。因此，防止和控制花青素的降解將有助于提高花青素的穩(wěn)定性和生物活性。

近年來，由于蛋白質優(yōu)異的生物相容性和良好的功能特性，以蛋白質為載體的多酚穩(wěn)定方式引起了眾多學者的研究興趣。蛋白質作為一種生物大分子，可以通過氫鍵、疏水相互作用等與多酚小分子發(fā)生結合進一步改善其穩(wěn)定性[5]?；ㄇ嗨赜捎讵毺氐亩喾咏Y構，已被證實是一種優(yōu)良的蛋白親和性小分子，可以與包括大豆蛋白在內(nèi)的多種蛋白質結合[6]。一方面，多酚與蛋白質的結合可以影響蛋白質的結構與功能特性。You Yaohui等[7]報道了表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）誘導大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的三級結構解折疊，暴露出更多的活性基團，從而提高起泡、乳化等功能特性。黑米花青素與SPI交聯(lián)后，促使SPI的二級結構由β-折疊向β-轉角和無規(guī)卷曲轉變，其起泡和乳化性得到改善[8]。另一方面，蛋白質可以充當載體進而影響多酚的抗氧化能力及生理活性。Zang Zhihuan等[4]發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白與乳清分離蛋白可以通過疏水相互作用和氫鍵與藍莓花青素結合，其蛋白顆?？梢宰鳛榛ㄇ嗨氐谋Ｗo載體。Zou Yucong等[9]研究表明葡萄籽原花青素以靜態(tài)猝滅的方式猝滅SPI的內(nèi)源熒光，并通過以氫鍵為主導的作用力與SPI形成復合物，其抗氧化性與穩(wěn)定性顯著提高。水稻谷蛋白分子對接實驗表明二聚原花青素能在蛋白質內(nèi)腔保持穩(wěn)定，從而提高原花青素的穩(wěn)定性和抗氧化能力[10]。β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白作為大豆蛋白中最主要的2種儲存蛋白，兩者的構象、分子質量及功能特性上的差異已被眾多學者所深究[11]。然而更多的集中于多酚對SPI結構及功能特性的影響，而對于β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白與多酚的相互作用鮮有研究。Wu Di等[12]研究表明β-伴大豆球蛋白對金絲桃苷的運載能力強于大豆球蛋白；并指出這可能是因為β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的分子質量和氨基酸殘基數(shù)量的差異影響了金絲桃苷的運載效率。Ochnio等[13]發(fā)現(xiàn)葉酸能夠通過疏水相互作用結合至大豆蛋白中并誘導其發(fā)生變化；與β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白能夠被葉酸誘導成更加廣泛的聚集體，有利于自組裝以形成更高效的維生素運輸載體，并使葉酸的裝載能力高于β-伴大豆球蛋白。研究表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G的相互作用是由疏水相互作用和靜電力共同驅動的，其相互作用改變了大豆蛋白的二、三級結構和表面活性并在一定程度上降低其熱穩(wěn)定性[14]。盡管該研究詳細探究了兩者的相互作用及對蛋白質功能特性的影響，然而缺少對多酚小分子穩(wěn)定性等的探討及兩者在分子水平上相互作用的見解。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白因不同的結構特征、分子質量等特性可能會影響它們與花青素等多酚小分子的互作機制（如相互作用力差異），從而影響了多酚的穩(wěn)定性和抗氧化活性。因此，從分子水平機制上了解β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G的相互作用的差異，對揭示β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白對C3G的穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響十分必要[8]。

因此，本實驗在前人研究基礎上以C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白為研究對象，借助多重光譜以及分子模擬對接等技術手段，揭示C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白之間的相互作用，深入分析C3G與大豆蛋白的互作機理與差異。該研究旨在分子水平上為花青素的保護提供見解，從而更深層次了解大豆蛋白對花青素等酚類物質的穩(wěn)態(tài)化作用及生理活性特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米花青素由實驗室自制[15]，以C3G含量為標準計花青素純度為（95.05±0.92）%；低溫脫脂豆粕 山東禹王實業(yè)有限公司；所用試劑均為分析純，水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

ALPHA 1-4LSC冷凍干燥機 德國Christ公司；FTIR-8400S傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜儀 日本島津公司；F-7100熒光光譜儀日本Hitachi公司；Chirascan圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 英國應用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的制備

根據(jù)Nagano等[16]描述的方法稍作改動。將脫脂豆粕粉碎過100 目篩，得到脫脂大豆粉。將脫脂大豆粉分散溶解在10 倍體積的去離子水中。在室溫下用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，在4 ℃，10 000×g離心30 min，棄沉淀物；取上清液加入固體無水亞硫酸氫鈉（0.98 g/L）并用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4，保持4 ℃過夜。在4 ℃、6 500×g離心20 min，所得沉淀為大豆球蛋白。其上清液中按照最終濃度為0.25 mol/L添加固體NaCl并用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，在4 ℃、10 000×g離心30 min，棄沉淀物。取上清液用等體積去離子水稀釋，而后調(diào)節(jié)pH值至4.8，在4 ℃、6 500×g離心20 min，所得沉淀物即為β-伴大豆球蛋白。用去離子水水洗沉淀物β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后再溶解，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，在3 500 Da透析袋中透析48 h后，冷凍干燥得到β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白粉末備用。經(jīng)凱氏定氮法測定（N×6.25），分別得到基于干基蛋白質質量分數(shù)為（92.40±1.03）%、（97.25±0.92）%的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白。而后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分別得到純度為（83.21±2.18）%、（92.65±1.73）%的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白[8]。

1.3.2β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白-C3G溶液的制備

將β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白溶解于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）后，將C3G按比例分別溶于上述蛋白溶液中，在室溫避光隔氧的條件下攪拌90 min分別制成β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白的C3G復合溶液。將未添加C3G的大豆蛋白溶液設置為空白對照，編號為0，添加C3G的溶液按照濃度梯度依次編號為1～10。

1.3.3 內(nèi)源熒光光譜測定

按照1.3.2節(jié)的方法制備β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液（β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白最終質量濃度為0.05 mg/mL、C3G的最終濃度在0～45 μmol/L之間），置于熒光比色杯中后利用熒光光譜儀分別測定各樣品的熒光光譜。其中，掃描發(fā)射波長在290～460 nm之間，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設定為5 nm，掃描速率設定為1 200 nm/min，電壓設定為600 V。

1.3.4 同步熒光光譜測定

按照1.3.3節(jié)方法（溶液的量與濃度均相同）室溫條件下，激發(fā)和發(fā)射的波長差值分別為Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，進行同步熒光光譜掃描。

1.3.5 三維熒光光譜測定

按照1.3.2節(jié)方法制備β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液（β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的質量濃度均為10 mg/mL、C3G質量濃度分別為0、0.10 mg/mL）。在室溫條件下，將樣品稀釋至200 倍后，記錄樣品三維熒光光譜。其中，激發(fā)波長范圍200～350 nm，發(fā)射波長為200～500 nm，波長間隔均為5 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min，電壓設定為600 V。

1.3.6 FTIR光譜分析

將1.3.5節(jié)制備的β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G樣品冷凍干燥后，將樣品粉末與溴化鉀粉末質量比為1∶100的比例混合后利用模具進行壓片，在分辨率為1 cm-1的條件下掃描32次，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1條件下掃描紅外光譜。

1.3.7 CD光譜分析

將1.3.5節(jié)制備的β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液在遠紫外區(qū)190～250 nm進行掃描，速率為60 nm/min，分辨率為0.2 nm，響應時間為0.25 s，狹縫寬度為1 nm。使用CD Pro軟件對蛋白質二級結構的組成成分及相對含量進行擬合[17]。

1.3.8 分子對接

分子對接在結果分析前的全部操作均在AutoDockTools-1.5.6軟件中進行。β-伴大豆球蛋白（PDB ID：1UIK）/大豆球蛋白（PDB ID：1OD5）的晶體結構取自Protein Data Bank蛋白質數(shù)據(jù)庫，C3G（黑米花青素主要成分）的結構取自PubChem數(shù)據(jù)庫。分別利用Autodock對β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G進行去水與加全氫等預處理。由于缺乏對接位點的信息，采用盲對接的方式，建立可包含整個蛋白質的對接網(wǎng)格盒子。隨后利用Lamarckian genetic algorithm算法對接50次，其他參數(shù)采取默認值，根據(jù)結合能大小對結果進行排序，借助Pymol、Discovery Studio 2019等軟件對最低能量構象進一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組數(shù)據(jù)均做平行重復實驗3次，利用SPSS 17.0軟件進行相關分析及ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 8.0、CD Pro、Pymol 2.3、Discovery Studio 2019等軟件進行圖表制作與CD光譜數(shù)據(jù)分析等操作。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)源熒光光譜分析

2.1.1 C3G對β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

熒光光譜已成為表征蛋白質與多酚相互作用后微環(huán)境變化的主要手段。蛋白質的內(nèi)源熒光主要是在280 nm激發(fā)波長下，由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基所引起[18]。如圖1所示，C3G的加入使蛋白的內(nèi)源熒光強度降低，降低程度與C3G的添加量呈正相關，說明C3G可以猝滅β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的內(nèi)源熒光，且具有濃度依賴性。另外，大豆球蛋白的熒光強度遠大于β-伴大豆球蛋白，可能是由于大豆球蛋白具有更高含量的Trp和Tyr殘基導致[19]，這與Ren Cong等[14]的研究結果一致。C3G對β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的猝滅效率分別為（62.14±1.06）%和（70.35±1.14）%，即C3G與大豆球蛋白的相互作用更強。

圖1 C3G對β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白（B）內(nèi)源熒光光譜的影響Fig. 1 Effect of C3G on the intrinsic fluorescence spectra of β-conglycinin (A) and glycinin (B)

2.1.2 猝滅類型、表觀結合常數(shù)及結合位點數(shù)

熒光猝滅根據(jù)形成機理不同可分為動態(tài)和靜態(tài)猝滅機制。其中靜態(tài)猝滅由猝滅劑和熒光團形成的復合物引起，隨著溫度的提高，復合物的穩(wěn)定性下降，靜態(tài)猝滅常數(shù)降低；而動態(tài)猝滅則由二者的碰撞引起，猝滅常數(shù)隨溫度的變化與靜態(tài)猝滅相反[20]。依據(jù)Stern-Volmer方程進行計算，如式（1）所示：

式中：F0、F分別為未加入和加入猝滅劑時蛋白的熒光強度；Q為猝滅劑的濃度/（mol/L）；Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為無猝滅劑時熒光體的壽命，蛋白的平均壽命約為10-8s。

圖2 不同溫度下C3G猝滅β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白（B）的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plots for quenching of β-conglycinin (A) and glycinin (B) by C3G at different temperatures

圖2和表1表明，隨著溫度的提高，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的Stern-Volmer方程線性斜率逐漸增大，說明存在動態(tài)猝滅。但C3G對β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的熒光猝滅速率（1012L/（mol·s）），遠大于最大擴散碰撞猝滅常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），表明猝滅方式中也存在靜態(tài)猝滅[21]。此類動態(tài)與靜態(tài)兼具的猝滅方式在多酚與蛋白質的相互作用中較為常見，如在麥醇溶蛋白與C3G[22]、β-酪蛋白與低聚原花青素[20]的研究中均有報道。

表1 不同溫度下C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白相互作用的熒光猝滅常數(shù)及其決定系數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants and determination coefficients for C3G binding to β-conglycinin/glycinin at different temperatures

兩者的表觀結合常數(shù)及結合位點數(shù)使用雙對數(shù)曲線方程計算，如式（2）所示：

式中：Ks為表觀結合常數(shù)；n為結合位點數(shù)。

如圖3和表2所示，一方面，C3G和β-伴大豆球蛋白之間的Ks值隨著溫度的升高而增加，這表明C3G-β-伴大豆球蛋白的形成是吸熱反應，其穩(wěn)定性隨著溫度的升高而增加；而大豆球蛋白則相反，表明升溫不利于復合物的穩(wěn)定[22]。另一方面，大豆球蛋白較β-伴大豆球蛋白具有更大的Ks值，并大于104數(shù)量級，說明C3G對大豆球蛋白的結合親和力強于β-伴大豆球蛋白[23]。此外，2 組復合物的結合位點數(shù)n均接近于1，說明C3G與2種蛋白均形成了物質的量比約為1∶1的靜態(tài)復合物[24]。

圖3 不同溫度下C3G猝滅β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白結合（B）的雙對數(shù)圖Fig. 3 Double logarithmic plots for C3G quenching of β-conglycinin (A) and glycinin (B) at different temperatures

表2 不同溫度下C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白相互作用的結合位點數(shù)、表觀結合常數(shù)及其決定系數(shù)Table 2 Number of binding sites, apparent binding constants and determination coefficients for interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin at different temperatures

2.1.3 熱力學參數(shù)及作用力類型

根據(jù)式（3）～（5）計算熱力學參數(shù)：

式中：K為對應溫度下的表觀結合常數(shù)；R為理想氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；ΔG為吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

利用熱力學參數(shù)分析蛋白質與多酚互作中的主導作用力。當ΔH＞0、ΔS＞0時，為疏水相互作用；當ΔH＞0、ΔS＜0時，靜電相互作用和疏水相互作用為主導；當ΔH＜0、ΔS＜0時，范德華力和氫鍵共同主導；ΔH＜0、ΔS＞0時，為靜電作用力[25]。如表3所示，C3G與β-伴大豆球蛋白結合時，ΔG＜0、ΔH＞0、ΔS＞0，說明兩者發(fā)生了吸熱的自發(fā)結合，且疏水作用力是兩者結合的主要結合力。作為在多酚與蛋白質互作中最常見的主導作用力，同樣在EGCG與SPI的互作中起穩(wěn)定復合物構象的關鍵作用[26]；而C3G與大豆球蛋白結合時，ΔG＜0、ΔH＜0、ΔS＜0，說明二者之間的相互作用是自發(fā)的放熱反應，范德華力和氫鍵為兩者結合的主要結合力，這與Tang Lin等[27]對C3G與肌紅蛋白、血清蛋白和血紅蛋白的互作情況所得到的結果一致。

表3 不同溫度下C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結合的熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the binding of C3G to β-conglycinin/glycinin at different temperatures

類似的，劉勤勤[28]和Zhou Yucong[9]等分別研究了SPI與茶多酚及SPI與原花青素的相互作用，均發(fā)現(xiàn)氫鍵為兩者結合的主導作用力；大豆球蛋白作為大豆蛋白的主要成分，當與多酚相互作用時，在大豆蛋白整體上其氫鍵可能占據(jù)了主導作用。而β-伴大豆球蛋白作為含量僅次于大豆球蛋白的大豆蛋白，其分子表面具有許多的疏水性區(qū)域[12]，當單獨與多酚相互作用時，疏水性區(qū)域可能有利于疏水作用的發(fā)生。這與You Yaohui等[7]對SPI與EGCG的相互作用研究結果一致。然而，在結合過程中，由于蛋白質、配體和溶劑分子之間的各種相互作用和能量交換，很難同時剖析其貢獻，因此基于熱力學分析只能確定主導作用力[29]。

盡管如此，應當指出維持多酚與蛋白質相互作用力不只有或僅有唯一作用力，兩者之間的相互作用力受多種因素影響。Yang Yaxuan等[30]發(fā)現(xiàn)EGCG與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結合的熱力學參數(shù)為ΔH＜0、ΔS＞0，即靜電作用力為主要結合力；Lan Tian等[31]通過溶劑組合發(fā)現(xiàn)了大豆蛋白肽與EGCG主要通過3種相互作用力穩(wěn)定，疏水相互作用最為重要，其次是氫鍵，最后是二硫鍵；陳爽等[32]在VD3與SPI互作研究中發(fā)現(xiàn)SPI-VD3復合物的穩(wěn)定性主要由靜電作用力與疏水作用力共同維持。以上研究結果說明這可能是由不同的配體結構導致配體分子疏水/親水性質的差異以及配體與蛋白質氨基酸殘基間的相互作用差異所導致[33]。因此，大豆蛋白與多酚的結構復雜，未來應結合多種分析技術進一步詳細分析兩者之間的相互作用。

2.2 同步熒光光譜分析

圖4 C3G與β-伴大豆球蛋白（A、B）、大豆球蛋白（C、D）結合的同步熒光光譜Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of C3G binding to β-conglycinin (A, B) and glycinin (C, D)

同步熒光已選擇性地應用于研究蛋白質的構象，特別是熒光團微環(huán)境的變化。同步熒光光譜最大吸收峰所對應波長的偏移可以反映蛋白氨基酸殘基所在微環(huán)境極性的變化。當波長間隔為Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm時，分別表示Tyr殘基和Trp殘基的特征熒光信息[14]。如圖4所示，Trp殘基的熒光強度明顯大于Tyr殘基，表明Trp殘基是蛋白熒光的主要貢獻者。隨著C3G濃度的增加，Trp殘基的熒光猝滅程度遠強于Tyr殘基，這可能表明Trp殘基比Tyr殘基對蛋白質熒光的猝滅貢獻更大[34]。對于Tyr殘基，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的最大吸收波長變化均不明顯，表明C3G對大豆蛋白的Tyr殘基微環(huán)境的影響較小。對于Trp殘基，大豆球蛋白最大吸收波長變化不明顯，而β-伴大豆球蛋白的最大吸收波長產(chǎn)生輕微的紅移；這暗示C3G可能誘導β-伴大豆球蛋白的Trp殘基微環(huán)境向親水環(huán)境轉變，且與Tyr殘基相比，結合位點可能更靠近Trp殘基[7]。而對大豆球蛋白Trp殘基微環(huán)境無明顯影響。類似的，Cheng Jing等[35]實驗觀察到C3G使β-乳球蛋白的Tyr殘基的最大吸收波長發(fā)生輕微紅移，而Trp殘基無明顯變化。這表明Tyr殘基周圍親水性增強，而Trp殘基微環(huán)境無顯著改變；并推測C3G結合位點可能更靠近Tyr殘基。

2.3 三維熒光光譜分析

圖5 C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結合的三維熒光光譜Fig. 5 Three-dimensional fluorescence spectra of C3G binding to β-conglycinin/glycinin

如圖5所示，峰1（λEm＝340 nm，λEx＝280 nm）、峰2（λEm＝350 nm，λEx＝230 nm）、峰a（λEm＝λEx）和峰b（λEm＝2λEx）分別對應于Trp和Tyr殘基的熒光特征峰、多肽鏈骨架結構的特征峰、瑞利散射和拉曼散射的特征峰[36]。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的拉曼散射峰都有所降低，表明C3G-大豆蛋白復合物的形成并降低了光散射作用[37]；C3G的添加猝滅了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白峰1的熒光強度，表明大豆蛋白部分Trp、Tyr殘基與C3G發(fā)生強烈的相互作用[8]。此外，峰2的熒光強度也有所降低，這表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白多肽鏈的展開和解折疊[38]。上述現(xiàn)象與Jiang Lianzhou等[15]的實驗結果一致，即表明C3G誘導大豆蛋白多肽鏈發(fā)生解折疊，并表示由于蛋白質部分或完全的展開，促使部分Trp等殘基暴露于親水性環(huán)境中，進而表現(xiàn)出熒光強度的降低。

2.4 FTIR光譜分析

圖6 C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結合的FTIR光譜Fig. 6 FTIR spectra of C3G binding to β-conglycinin/glycinin

利用FTIR光譜研究C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子間的相互作用及二級結構變化，其中蛋白質二級結構的變化情況主要由酰胺I帶（反映C＝O伸縮振動）、II帶（反映C—N伸縮振動與N—H彎曲振動）吸收峰的變化反映[21]。如圖6所示，C3G的加入使β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的酰胺A帶（反映N—H的伸縮振動）、酰胺I帶和酰胺II帶的峰值下降及峰位均發(fā)生紅移或藍移；這意味著氫鍵和疏水相互作用參與C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結合的過程[39]，并可能引起了蛋白質二級結構發(fā)生變化[30]。該現(xiàn)象可能是由于C3G的羥基和大豆蛋白中—OH或C＝O氫鍵供體/受體基團之間發(fā)生非共價作用[40]。此外，大豆蛋白還可以與C3G中的芳香環(huán)之間形成疏水相互作用。因此，大豆蛋白和C3G之間的氫鍵與疏水相互作用，可能被認為是促進兩者結合的主要作用力；并進一步影響了蛋白質的二級結構的變化[22]。Chen Zhongqin等[21]指出，C3G可能與蛋白質的疏水腔結合，導致多肽鏈中氫鍵網(wǎng)絡的重新排列和相關蛋白質的二級結構的改變。

2.5 CD光譜分析

圖7 β-伴大豆球蛋白-C3G（A）與大豆球蛋白-C3G（B）復合物的CD光譜Fig. 7 CD spectra of β-conglycinin-C3G (A) and glycinin-C3G (B)complexes

如圖7和表4所示，C3G的加入使大豆蛋白二級結構產(chǎn)生微小變化，即α-螺旋相對含量降低，β-折疊相對含量提高；而β-轉角和無規(guī)卷曲相對含量則無明顯變化。這暗示C3G可能結合到大豆蛋白α-螺旋結構的疏水區(qū)域，誘導其向β-折疊轉變，使肽鏈輕微解折疊[41]。朱穎等[17]通過CD光譜發(fā)現(xiàn)，黑米花青素誘導SPI中α-螺旋部分轉變?yōu)棣?折疊，即黑米花青素對SPI和具體組分二級結構相對含量的影響結果一致。這可能由于C3G結合至蛋白質的疏水區(qū)域中，并誘導多肽鏈二級結構單元間氫鍵發(fā)生重排，導致α-螺旋含量的下降及β-折疊含量的上升，從而產(chǎn)生了更穩(wěn)定的構象[21,42]。穩(wěn)定的構象可能會對C3G的穩(wěn)態(tài)化起到良好作用，正如Attaribo等[43]和Chen Zhongqin等[21]的研究結果表明：與C3G混合后，蛋白質α-螺旋含量降低和β-折疊含量增加可以提高C3G的穩(wěn)定性。因此，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能有望成為保護、遞送C3G的優(yōu)良載體。

表4 β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的二級結構相對含量變化Table 4 Changes in relative contents of secondary structures in β-conglycinin/glycinin

2.6 分子對接分析

表5 C3G-β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白互作能量細則Table 5 Energy requirements associated with interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin

選取黑米花青素中含量最高的C3G為模型多酚，進行分子對接。隨后從50種對接結果中選出結合能前5的對接姿態(tài)進行展示（表5），并遵循最小能量原則選出最優(yōu)結果（圖8），進行對接細節(jié)分析。從Autodock對接結果中可以提取出結合能（ΔG）、分子間作用力能量（Eintermol）、范德華力能量+氫鍵能量+疏水作用力能量總和（Evhd）、靜電相互作用能量（Eelec），其中Eintermol＝Evhd+Eelec。從結合能而言，ΔG的數(shù)值表明C3G均自發(fā)與兩種蛋白結合，且與大豆球蛋白的結合程度更大，在大豆球蛋白-C3G體系中表明該復合物更穩(wěn)定[44]。該結果表明，與β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白-C3G體系的組合降低了生物體內(nèi)小分子的利用度。小分子的生理活性及其在體內(nèi)的功能與載體蛋白的親和力有關，因此推測大豆球蛋白對C3G的運輸能力可能要比β-伴大豆球蛋白強。在Wu Di等[12]研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：與大豆球蛋白相比，β-伴大豆球蛋白對金絲桃苷具有更好的遞送性能。此外，在所有分子間作用力中以Evhd為主，表明范德華力、氫鍵和疏水作用力是兩者結合過程中的主要作用力；靜電作用力數(shù)值極小，表明其不是主要作用力，但對維持構象穩(wěn)定有一定的貢獻[27]。

圖8 C3G-β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白互作3D、局部、2D圖Fig. 8 Three-dimensional and two-dimensional illustration of interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin

圖8B和C表明β-伴大豆球蛋白共有7個氨基酸殘基參與了C3G的結合。其中疏水性氨基酸Asp-934、Ile-921、Lys-951和Arg-933的疏水部分與C3G距離較近，形成4個疏水相互作用，從而減少了水的介入，有助于C3G與β-伴大豆球蛋白形成穩(wěn)定的復合物；Arg-918、Asp-934、Thr-948、Glu-950、Lys-951與C3G共形成10個氫鍵。與疏水相互作用類似，這些氫鍵也加強了非共價作用的強度，使二者結合更加穩(wěn)固；此外，C3G中的二羥基苯環(huán)與Lys-951帶正電的氨基形成π-陽離子作用力。

圖8E和F顯示大豆球蛋白共有6個氨基酸殘基參與了C3G的結合。其中Arg-522、Val-523和Glu-533參與形成疏水相互作用；Arg-522、Val-523、Asp-531、Glu-533、Thr-537、Gly-542參與形成氫鍵，C3G的二羥基苯環(huán)與Arg-522具有正電性的胍基形成π-陽離子作用力。因此，在C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子對接過程中，疏水作用力起重要作用。并且，由于C3G是一種被廣泛認同的良好氫供體，其與蛋白質基團形成的氫鍵對維持復合物穩(wěn)定性也起決定性作用。此外，還兼具π-陽離子結合力的作用。不僅如此，大豆蛋白與C3G的芳香環(huán)結合，大部分酚羥基參與成鍵；因此β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能對C3G形成保護，進而提升C3G的穩(wěn)定性[45]。玉米醇溶蛋白以相似的模式與EGCG結合，其已被證實可成為有效的茶多酚遞送系統(tǒng)[46]。然而，由于C3G的B環(huán)上酚羥基全部參與成鍵，因此在一定程度上導致其抗氧化能力下降，這可能與蛋白質的屏蔽作用有關[47]。

3 結 論

通過多重光譜技術及分子對接等手段研究了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G的相互作用，主要結論如下：1）C3G可以通過靜態(tài)和動態(tài)兼具的猝滅方式猝滅的大豆蛋白內(nèi)源熒光。C3G主要通過范德華力、氫鍵或疏水作用分別與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白形成復合物；2）C3G可以結合至大豆蛋白的疏水空腔中，依靠多種作用力共同維持復合物的穩(wěn)定性；C3G誘導部分蛋白質二級結構α-螺旋向β-折疊轉變，多肽鏈發(fā)生解折疊。此外，還引起了β-伴大豆球蛋白的Try殘基微環(huán)境的變化；3）C3G與大豆球蛋白的親和力強于β-伴大豆球蛋白。C3G與大豆蛋白的結合可能有利于C3G的遞送，但一定程度上減弱C3G的利用度和生理活性。