• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    構(gòu)建氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測食品中蘇丹紅

    2022-12-22 09:09:02盧春霞閆圣坤劉成江林祥群王雙慧馮曉汀
    食品科學 2022年22期
    關(guān)鍵詞:蘇丹紅血紅素比色

    盧春霞,閆圣坤,劉成江,林祥群,王雙慧,馮曉汀

    (1.長江師范學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院,重慶 408100;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)機械化研究所,新疆 烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,新疆 石河子 832000;4.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學院,新疆 石河子 832000)

    蘇丹紅是一種人工合成的親脂類偶氮染料,主要包括蘇丹紅I、II、III、IV 4種類型。由于其增色效應(yīng)顯著,常被作為非法添加劑用于改良番茄、辣椒等產(chǎn)品外觀,直接或間接危害人體健康。蘇丹紅被國際癌癥研究機構(gòu)列為三類致癌物,其中蘇丹紅III的初級代謝產(chǎn)物4-氨基偶氮苯被列為二類致癌物[1]。我國及歐盟嚴禁將蘇丹紅作為色素添加劑在食品和飼料中使用。除了人為添加,一些農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中由于環(huán)境污染、肥料、農(nóng)藥和塑料包裝等不規(guī)范使用以及一些不明因素,導(dǎo)致其一定程度上受到蘇丹紅交叉污染[2]。因此,準確、靈敏、快速地檢測食品中蘇丹紅染料的方法對食品安全監(jiān)管有著十分重要意義。

    目前,蘇丹紅檢測方法主要包括儀器分析方法,如高效液相色譜法[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)[4]。色譜與質(zhì)譜技術(shù)靈敏度較高、結(jié)果可靠,但樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測成本高、有機溶劑用量大、且儀器設(shè)備昂貴,需要專業(yè)的操作人員。免疫分析方法[5]是應(yīng)用較為廣泛的快篩檢測方法,與儀器分析法相比具有特異性強、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點,但抗體制備周期長,成本較高。

    核酸適配體是與靶分子特異性結(jié)合的一段單鏈DNA或RNA,由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選獲得。適配體與靶標結(jié)合時可折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)體及G-四鏈體等結(jié)構(gòu),通過氫鍵、范德華力和堿基堆積等作用進行分子識別?;陔S機文庫的龐大庫容和單鏈核苷酸空間結(jié)構(gòu)的多樣性,適配體幾乎可以與所有種類的靶標[6-12]發(fā)生結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比,核酸適配體具有不受免疫原限制、可人工合成、成本低廉、應(yīng)用范圍廣、易于標記和保存等優(yōu)點。因此,適配體作為新型識別探針在食品分析領(lǐng)域得到廣泛研究和應(yīng)用[13-15]。

    在常規(guī)比色檢測中,納米材料和生物酶常作為發(fā)光信號標記在識別探針上。但是這種標記方法耗時耗力,且天然酶成本高,對保存環(huán)境要求高。血紅素/G-四鏈體DNA酶則是近年來迅速發(fā)展起來的一種人工合成的DNA酶。富含鳥嘌呤堿基(G)的DNA序列通過氫鍵作用折疊成特殊的G-四鏈體結(jié)構(gòu),當與氯化血紅素結(jié)合后,形成一種具有過氧化物酶活性的DNA酶,能催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)或2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺鹽(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt,ABTS),生成藍色TMB+或綠色ABTS陽離子自由基。與天然酶相比,該酶熱穩(wěn)定性高、價格便宜、合成簡單、易于標記,被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域[16]。由于食品樣品成分復(fù)雜、干擾大,基質(zhì)效應(yīng)可能影響檢測靈敏度。為實現(xiàn)對靶標的高靈敏檢,有研究者將G-四鏈體DNA酶與雜交鏈式反應(yīng)(hybridization chain reaction,HCR)相結(jié)合,構(gòu)建生物傳感器應(yīng)用于生物標記物、微生物、毒素、金屬離子等檢測[17-18]。但目前尚未見到基于適配體識別-氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶檢測蘇丹紅的研究報道。

    本研究以蘇丹紅III適配體為識別元件,以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針,結(jié)合HCR信號放大策略構(gòu)建一種比色生物傳感器。檢測原理如圖1所示,該傳感器由一個檢測探針和兩個發(fā)夾DNA探針(H1和H2)組成,檢測探針由蘇丹紅III適配體序列、觸發(fā)HCR反應(yīng)的啟動序列,以及與適配體互補的序列組成,H1和H2包括非活性構(gòu)型的G-四鏈體序列作為功能元件。無靶標時,檢測探針形成發(fā)夾折疊結(jié)構(gòu),無法引發(fā)HCR反應(yīng),當靶標結(jié)合適配體后打開檢測探針引發(fā)HCR反應(yīng),生成大量富G-四鏈體的雙鏈DNA納米線,加入血紅素后,形成具有過氧化物酶活性的氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶,催化H2O2氧化底物并顯色。構(gòu)建的傳感器可用于簡單、靈敏、快速地進行蘇丹紅比色檢測,為食品中蘇丹紅的檢測提供一定的技術(shù)支撐。

    圖1 基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色測定蘇丹紅示意圖Fig. 1 Schematic illustration of colorimetric detection of Sudan based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    火鍋料、辣椒醬、辣椒粉均購于本地超市。

    蘇丹紅I(CAS號842-07-9)、蘇丹紅II(CAS號3118-97-6)、蘇丹紅III(CAS號85-86-9)、蘇丹紅IV(CAS號85-83-6)、對位紅(CAS號6410-10-2)、日落黃(CAS號2783-94-0)標準品 上海安譜實驗科技股份有限公司;牛血清白蛋白、二甲基亞砜、氯化血紅素、吐溫-20、TMB顯色試劑盒、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、AgNO3生工生物工程(上海)股份有限公司;鏈霉親和素包被的酶標板 蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司;其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

    用乙腈將蘇丹紅配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的蘇丹紅原液,置于-20 ℃避光保存。使用時用pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(含8 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO)稀釋蘇丹紅原液至所需的質(zhì)量濃度。

    將氯化血紅素溶于二甲基亞砜中配制成5 mmol/L的氯化血紅素原液,置于4 ℃避光保存。使用時用PBS稀釋至所需濃度。

    生物素化檢測探針由蘇丹紅III核酸適配體[19]和觸發(fā)HCR反應(yīng)的啟動序列組成;發(fā)夾DNA探針在5'(或3')和3'(或5')端分別含有3/4和1/4的G-四鏈體序列[20];探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其堿基序列見表1。

    表1 檢測探針及發(fā)夾DNA探針序列Table 1 Sequences of the detection probe and hairpin DNA probes

    1.2 儀器與設(shè)備

    5MX 96 孔板混勻儀 美國賽洛捷克公司;Mk3酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;MS3 basic渦旋混合器德國IKA公司;Milli-QReference超純水系統(tǒng) 美國密理博公司;5424R臺式冷凍離心機 德國艾本德公司。

    1.3 方法

    1.3.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器測定蘇丹紅III

    鏈霉親和素包被的酶標板使用前用PBST溶液(0.05%吐溫-20+PBS)洗滌3次,加入100 μL 80 nmol/L生物素化檢測探針,室溫孵育20 min。PBST溶液洗滌3次,加入質(zhì)量分數(shù)為5%的牛血清白蛋白溶液,封閉2 h,PBST洗滌后備用。將100 μL一定質(zhì)量濃度的蘇丹紅III標準品加入到酶標板,室溫孵育30 min,PBST洗滌。H1和H2使用前于95 ℃加熱5 min,然后緩慢冷卻至室溫。分別向酶標板中加入50 μL 400 nmol/L的H1和H2,37 ℃孵育60 min。PBST洗滌后加入100 μL 0.8 μmol/L氯化血紅素,室溫孵育30 min。PBST洗滌,加入100 μL TMB底物(含H2O2),室溫孵育5~8 min后,加入100 μL 1 mol/L HCl溶液停止反應(yīng)。通過顏色變化定性檢測蘇丹紅,用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。pH 7.4 PBS設(shè)置為空白對照。

    1.3.2 檢測條件優(yōu)化

    采用單因素優(yōu)化試驗分別優(yōu)化檢測探針濃度、靶標與適配體結(jié)合時間、H1和H2濃度、HCR反應(yīng)時間、氯化血紅素濃度、氯化血紅素/G-四鏈體反應(yīng)時間的實驗條件。均以蘇丹紅III為待測靶標,固定其質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

    1.3.2.1 檢測探針濃度優(yōu)化

    固定適配體與靶標結(jié)合時間50 min,發(fā)夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應(yīng)時間2 h,氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置檢測探針濃度分別為20、40、80、100、150、200 nmol/L,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測,考察檢測探針濃度對檢測性能的影響。

    1.3.2.2 靶標與適配體結(jié)合時間優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,固定發(fā)夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應(yīng)時間為2 h,氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置適配體與靶標結(jié)合時間分別為10、20、30、60、100 min,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.3 發(fā)夾探針濃度優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,固定HCR反應(yīng)時間2 h,氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置發(fā)夾探針H1和H2濃度分別為50、100、200、400、600、800 nmol/L,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.4 HCR反應(yīng)時間

    采用上述優(yōu)化條件,固定氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置HCR反應(yīng)時間分別為30、60、90、120、150 min,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.5 氯化血紅素濃度優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,固定氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置氯化血紅素濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μmol/L,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.6 氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,設(shè)置氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間分別為10、30、60、90、120 min,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾測定

    采用1.3.2節(jié)中優(yōu)化的實驗條件,將相同濃度(1 μmol/L)的Hg2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Cu2+分別添加到蘇丹紅III溶液中,按照1.3.1節(jié)方法進行檢測,測定重金屬離子對該方法的干擾程度。

    1.3.4 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能測定

    1.3.4.1 靈敏度測定

    在優(yōu)化條件下,用pH 7.4 PBS將蘇丹紅III標準溶液稀釋系列梯度質(zhì)量濃度(0、0.1、0.5、1、5、10、50、250 ng/mL),用1.3.1節(jié)方法進行檢測,觀察溶液顏色變化,在450 nm波長處測定吸光度。以蘇丹紅III質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,進行線性擬合,得到線性方程和相關(guān)系數(shù),計算方法的檢測限(limits of detection,LOD):

    式中:σ為空白對照檢測10次的平均標準偏差;S為斜率。

    1.3.4.2 特異性測定

    采用1.3.1節(jié)的方法檢測相同質(zhì)量濃度(100 ng/mL)的蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅IV、對位紅、日落黃標準品,同時設(shè)PBS為空白對照。觀察溶液顏色變化,在450 nm波長處測定吸光度。

    1.3.4.3 實際樣品測定

    參考GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[21]對樣品進行前處理,稱取2 g辣椒醬、辣醬粉、番茄醬樣品(精確到0.001 g),分別添加高、中、低3種水平的蘇丹紅III標準溶液,使加標含量分別為5、50、200 ng/g。然后加入10 mL正己烷,振蕩混勻,超聲提取10 min,以5 000 r/min離心5 min。移取正己烷層,殘渣用正己烷重復(fù)提取1次,合并兩次上清液。氮吹儀濃縮上清液,乙腈定容至1 mL,用PBS稀釋5 倍后采用1.3.1節(jié)的方法進行檢測,計算加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。同時采用GB/T 19681—2005[21]對樣品進行檢測,并對兩種方法的檢測結(jié)果進行比較。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測條件優(yōu)化

    如圖2A所示,吸光度隨著檢測探針濃度的增加而增加,當濃度超過80 nmol/L后,吸光度無顯著變化(P>0.05),故檢測探針最佳濃度為80 nmol/L。如圖2B所示,吸光度隨著結(jié)合時間的延長而增大,當結(jié)合時間大于30 min后,吸光度無顯著變化(P>0.05),意味著反應(yīng)基本達到飽和狀態(tài)。因此,后續(xù)實驗選擇靶標與適配體的結(jié)合時間為30 min。如圖2C所示,當H1和H2濃度均達到400 nmol/L后,吸光度無顯著變化(P>0.05),可能是由于H1和H2濃度過大產(chǎn)生了空間位阻,影響了雜交鏈的進一步形成。HCR反應(yīng)時間過短會影響檢測靈敏度,但時間過長則會影響檢測效率,圖2D表明,當時間超過60 min后,吸光度無顯著變化(P>0.05),說明反應(yīng)達到飽和狀態(tài),故HCR反應(yīng)時間選擇60 min。由圖2E和F可知,氯化血紅素最佳濃度為0.8 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體最佳反應(yīng)時間為30 min。

    圖2 不同實驗條件對蘇丹紅III檢測的影響Fig. 2 Effects of different experimental conditions on the detection of Sudan III

    2.2 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾分析

    一些金屬離子可選擇性地與DNA雙鏈中的堿基結(jié)合,形成金屬介導(dǎo)的堿基對。研究證明一些金屬離子能促進或阻礙氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶的形成,進而影響DNA酶活性[22-27]。從圖3可以看出,金屬離子對溶液的吸光度無顯著影響,主要原因可能與設(shè)計的探針序列及功能不同有關(guān),基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶測定重金屬離子的傳感器,大都依賴于設(shè)計富含特定堿基的功能序列識別重金屬離子來完成檢測[22-26]。比如,利用Ag+通過C-Ag+-C配位鍵促進氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶活性以實現(xiàn)Ag+檢測[22]。利用Hg2+與T堿基特異性結(jié)合原理,通過形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)抑制或促進該DNA酶活性實現(xiàn)Hg2+的檢測[23-25]。而本實驗所用探針(H1和H2)并不是針對重金屬離子設(shè)計的功能探針,在形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)時,無法形成錯配的雙鏈結(jié)構(gòu)。所以,重金屬離子對DNA酶的活性影響不大。

    圖3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器的影響Fig. 3 Effect of heavy metal ions on the colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

    2.3 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能分析

    2.3.1 靈敏度分析

    如圖4A所示,當蘇丹紅III質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時,肉眼可見明顯的顏色變化,因此,該方法可視化LOD為0.5 ng/mL。由圖4B可知,吸光度隨著蘇丹紅III質(zhì)量濃度的增加而增加,蘇丹紅III在0.5~250 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R=0.995),LOD為0.09 ng/mL。由表2可知,與GB/T 19681—2005方法[21]和文獻的蘇丹紅檢測方法相比,本研究建立的方法具有高靈敏度。

    圖4 不同蘇丹紅III質(zhì)量濃度下的檢測體系顏色(A)與吸光度(B)變化Fig. 4 Changes in the detection system’s color (A) and absorbance value (B) versus concentrations of Sudan III

    表2 蘇丹紅檢測方法比較Table 2 Comparison of reported methods for the detection of Sudan dyes

    2.3.2 特異性分析

    如圖5所示,當檢測體系中含有質(zhì)量濃度為100 ng/mL的蘇丹紅I~IV時,溶液在450 nm波長處的吸光度達到0.47~0.62,而對位紅和日落黃并未引起反應(yīng)溶液顏色明顯變化,其吸光度與空白樣品差異不顯著(P>0.05)。表明該適配體對蘇丹紅I~IV具有類選擇性,可能是由于蘇丹紅I~IV結(jié)構(gòu)高度相似,這對檢測一類結(jié)構(gòu)相似的靶標時可能更有應(yīng)用意義。然而Wang Ying等[19]的特異性分析結(jié)果顯示,蘇丹紅III適配體與蘇丹紅I、II和IV沒有明顯交叉反應(yīng),具體原因有待進一步研究。

    圖5 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測蘇丹紅特異性評估Fig. 5 Specificity analysis of colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes for Sudan detection

    2.3.3 實際樣品分析

    如表3所示,本方法的加標回收率為84.3%~101.6%,RSD為4.13%~8.36%。本方法的加標回收率與GB/T 19681—2005法相比差異不顯著(P>0.05),表明本方法結(jié)果準確可靠。

    表3 氯化血紅素/G四鏈體DNA酶比色生物傳感器法與GB/T 19681—2005高效液相色譜法加標回收對比(n =3)Table 3 Comparison of spiked recoveries between colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes and HPLC (n = 3)

    3 結(jié) 論

    以蘇丹紅III適配體為識別分子,以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針,結(jié)合HCR信號放大策略,構(gòu)建了一種簡單、新穎、高靈敏的比色生物傳感器,用于檢測食品中蘇丹紅。在優(yōu)化條件下,該比色傳感器方法LOD為0.09 ng/mL,加標回收率為84.3%~101.6%,RSD為4.13%~8.36%,可特異性識別蘇丹紅I、II、III、IV,檢測結(jié)果準確可靠。與GB/T 19681—2005方法相比,本方法樣品前處理簡單、不需要大型儀器;與傳統(tǒng)的免疫方法相比,不需要制備抗體,檢測成本低廉,同時也可實現(xiàn)高通量檢測;可為批量實現(xiàn)食品中蘇丹紅的快速檢測提供一定技術(shù)支撐。

    猜你喜歡
    蘇丹紅血紅素比色
    分析高效液相色譜儀測定食品中蘇丹紅
    高效液相色譜法測定禽蛋中蘇丹紅殘留量
    鴨蛋黃越紅越好嗎
    健康博覽(2017年12期)2018-02-06 21:30:06
    基于HPLC的蘇丹紅檢測中光學誘導(dǎo)異構(gòu)現(xiàn)象的探究
    血紅素氧合酶-1與急性腎損傷研究新進展
    血紅素加氧酶-1對TNF-α引起內(nèi)皮細胞炎癥損傷的保護作用
    ??诘貐^(qū)牙齒修復(fù)比色技術(shù)應(yīng)用的現(xiàn)狀調(diào)查
    珠??谇会t(yī)生比色現(xiàn)狀調(diào)查
    富血紅素多肽研究進展
    數(shù)碼攝影在口腔科比色中的運用
    狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产国语露脸激情在线看| 精品午夜福利在线看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成人综合一区亚洲| 国产熟女欧美一区二区| 久久精品国产自在天天线| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲成人手机| 如何舔出高潮| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲国产精品国产精品| 两个人的视频大全免费| 日韩亚洲欧美综合| av视频免费观看在线观看| 人妻系列 视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久精品免费免费高清| 黄色配什么色好看| 免费观看a级毛片全部| 精品久久蜜臀av无| 99久久精品国产国产毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品色激情综合| 国产免费又黄又爽又色| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 成人黄色视频免费在线看| 岛国毛片在线播放| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 中文字幕av电影在线播放| 桃花免费在线播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲成人一二三区av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美bdsm另类| 日本黄大片高清| 少妇的逼水好多| 青春草国产在线视频| 91精品国产国语对白视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲三级黄色毛片| 国产在视频线精品| 国产 精品1| 日韩一区二区三区影片| 欧美成人午夜免费资源| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 亚洲av.av天堂| 久久久久久久精品精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品99久久久久久久久| 国产 一区精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲av免费高清在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美日韩成人在线一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 最新的欧美精品一区二区| 久久久精品94久久精品| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品国产av在线观看| 中文天堂在线官网| 亚洲内射少妇av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 成人综合一区亚洲| 一区二区三区精品91| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲人与动物交配视频| 一个人看视频在线观看www免费| 男人操女人黄网站| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜影院在线不卡| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 免费看光身美女| 日韩伦理黄色片| 黄色怎么调成土黄色| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产免费现黄频在线看| 精品午夜福利在线看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品视频人人做人人爽| 在线观看免费日韩欧美大片 | 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产成人免费无遮挡视频| 免费黄网站久久成人精品| 国产免费现黄频在线看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美97在线视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久久久久久久久成人| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品国产av成人精品| videos熟女内射| 国产av精品麻豆| 成人国产av品久久久| 国产av精品麻豆| 久久久久视频综合| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲无线观看免费| 精品久久久久久久久亚洲| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美3d第一页| 欧美日韩综合久久久久久| 日日撸夜夜添| 久久人人爽人人片av| 赤兔流量卡办理| 只有这里有精品99| 天堂8中文在线网| 亚洲精品国产av蜜桃| 少妇高潮的动态图| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲av免费高清在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产极品天堂在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 男女啪啪激烈高潮av片| 国产免费视频播放在线视频| 老女人水多毛片| 两个人的视频大全免费| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品456在线播放app| 伊人久久精品亚洲午夜| 中国三级夫妇交换| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 母亲3免费完整高清在线观看 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久热这里只有精品99| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 9色porny在线观看| 在线观看人妻少妇| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩三级伦理在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| h视频一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲第一av免费看| 一区在线观看完整版| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 青春草国产在线视频| 国产精品99久久久久久久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产在线免费精品| 亚州av有码| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品色激情综合| 久久精品国产亚洲网站| 最近中文字幕2019免费版| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人妻系列 视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 中文字幕制服av| 亚洲不卡免费看| 日韩欧美一区视频在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美精品一区二区大全| 99九九线精品视频在线观看视频| av黄色大香蕉| 亚洲美女黄色视频免费看| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 视频区图区小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 免费看不卡的av| 国产一区二区三区av在线| 黄色毛片三级朝国网站| kizo精华| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费看光身美女| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲成人一二三区av| 免费高清在线观看日韩| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 黄片无遮挡物在线观看| 高清欧美精品videossex| 久久久精品免费免费高清| 国产精品国产三级专区第一集| 久久人妻熟女aⅴ| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人一区二区在线| 久久99一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 一本久久精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久这里有精品视频免费| 成人免费观看视频高清| 日本与韩国留学比较| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 能在线免费看毛片的网站| 国产色婷婷99| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品一区www在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 丰满乱子伦码专区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成色77777| 久久人人爽人人爽人人片va| 涩涩av久久男人的天堂| 又大又黄又爽视频免费| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av二区三区四区| 久久久精品94久久精品| 老女人水多毛片| 国产精品一国产av| 欧美精品亚洲一区二区| 波野结衣二区三区在线| 少妇人妻久久综合中文| av卡一久久| av不卡在线播放| 中文字幕久久专区| 男女边摸边吃奶| 国产一区亚洲一区在线观看| 国内精品宾馆在线| 男女无遮挡免费网站观看| 全区人妻精品视频| 久久久久视频综合| 老司机影院成人| 成人综合一区亚洲| 久久久亚洲精品成人影院| √禁漫天堂资源中文www| 欧美精品亚洲一区二区| 岛国毛片在线播放| 99热国产这里只有精品6| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久久久人妻| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 美女主播在线视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美日韩视频精品一区| 久久人人爽人人片av| 老司机影院毛片| 青春草亚洲视频在线观看| av在线app专区| 欧美日韩在线观看h| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 天天影视国产精品| 久久久亚洲精品成人影院| 97超视频在线观看视频| 黄片无遮挡物在线观看| 在线观看三级黄色| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美性感艳星| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 成人手机av| 五月天丁香电影| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲第一av免费看| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品456在线播放app| 边亲边吃奶的免费视频| 美女福利国产在线| 亚洲中文av在线| 久久综合国产亚洲精品| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 多毛熟女@视频| 涩涩av久久男人的天堂| 精品国产乱码久久久久久小说| 99热全是精品| 边亲边吃奶的免费视频| 高清欧美精品videossex| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| av视频免费观看在线观看| 777米奇影视久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产免费一级a男人的天堂| 性色avwww在线观看| 看免费成人av毛片| 一区二区三区四区激情视频| 熟女av电影| 97在线视频观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩中字成人| 三上悠亚av全集在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲国产av影院在线观看| 性色av一级| 高清午夜精品一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 日韩一区二区视频免费看| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲无线观看免费| av播播在线观看一区| 人妻人人澡人人爽人人| 国产在线免费精品| 国产成人a∨麻豆精品| 热99久久久久精品小说推荐| 伦理电影免费视频| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美国产精品一级二级三级| 精品一品国产午夜福利视频| 夫妻午夜视频| 精品一品国产午夜福利视频| 免费av中文字幕在线| 国产色婷婷99| 久久久国产一区二区| videos熟女内射| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品第二区| 我的老师免费观看完整版| 国内精品宾馆在线| 人成视频在线观看免费观看| 免费日韩欧美在线观看| 91久久精品电影网| 简卡轻食公司| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲综合精品二区| 老司机影院毛片| 国产黄片视频在线免费观看| 一个人看视频在线观看www免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩成人伦理影院| 日韩强制内射视频| 伦精品一区二区三区| 免费大片18禁| 日本黄色日本黄色录像| 美女福利国产在线| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲天堂av无毛| 蜜桃国产av成人99| 久久久久精品久久久久真实原创| 晚上一个人看的免费电影| 久久99蜜桃精品久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 尾随美女入室| 国产一区二区在线观看日韩| 午夜福利视频精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 大码成人一级视频| 午夜免费观看性视频| 一级片'在线观看视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 午夜影院在线不卡| 有码 亚洲区| av视频免费观看在线观看| 伦理电影免费视频| 亚洲在久久综合| 成人漫画全彩无遮挡| 国产不卡av网站在线观看| av天堂久久9| 午夜福利,免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| www.av在线官网国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 麻豆成人av视频| 青春草亚洲视频在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲国产精品一区三区| 免费大片黄手机在线观看| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久久久久成人| 午夜福利视频精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 99久国产av精品国产电影| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 欧美日韩视频精品一区| 高清毛片免费看| 成人国产麻豆网| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲精品乱久久久久久| 精品一区二区三卡| 多毛熟女@视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 女性生殖器流出的白浆| 精品久久久精品久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品一区www在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 9色porny在线观看| 五月开心婷婷网| videossex国产| 免费观看在线日韩| 少妇 在线观看| 街头女战士在线观看网站| 亚洲成人一二三区av| 欧美日韩视频精品一区| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久久伊人网av| 国产日韩欧美在线精品| 色哟哟·www| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费大片18禁| 老司机影院毛片| 人妻人人澡人人爽人人| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品国产一区二区久久| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久ye,这里只有精品| 在线精品无人区一区二区三| 美女内射精品一级片tv| 免费观看在线日韩| 少妇熟女欧美另类| av免费观看日本| 99热这里只有精品一区| 少妇人妻久久综合中文| 午夜免费观看性视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 免费高清在线观看视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 边亲边吃奶的免费视频| 日韩免费高清中文字幕av| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲精品自拍成人| 免费黄色在线免费观看| 国产精品一国产av| 新久久久久国产一级毛片| 久久久国产一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 9色porny在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品无大码| 国产在线一区二区三区精| 最近最新中文字幕免费大全7| 少妇精品久久久久久久| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 色网站视频免费| 一本一本综合久久| av在线观看视频网站免费| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 国产精品人妻久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 下体分泌物呈黄色| 制服诱惑二区| 久久久a久久爽久久v久久| 九色成人免费人妻av| 伦精品一区二区三区| 99九九在线精品视频| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美变态另类bdsm刘玥| 综合色丁香网| 大陆偷拍与自拍| 成年人午夜在线观看视频| 成人手机av| 高清在线视频一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产伦理片在线播放av一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品一区www在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产精品三级大全| 久久久久久久久久成人| 一本大道久久a久久精品| 国产极品天堂在线| 久久久久久人妻| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲精品456在线播放app| 日本vs欧美在线观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 少妇熟女欧美另类| 视频区图区小说| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美3d第一页| 国产精品人妻久久久影院| 国产成人一区二区在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄片无遮挡物在线观看| av黄色大香蕉| 成人漫画全彩无遮挡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产片特级美女逼逼视频| 大香蕉久久成人网| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色视频在线播放观看不卡| 视频区图区小说| 久热这里只有精品99| 91精品伊人久久大香线蕉| 永久网站在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| av在线观看视频网站免费| 美女视频免费永久观看网站| av福利片在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜激情福利司机影院| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男人添女人高潮全过程视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 永久网站在线| 18禁动态无遮挡网站| 精品午夜福利在线看| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 观看av在线不卡| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜福利视频精品| 欧美精品一区二区大全| 欧美成人精品欧美一级黄| xxx大片免费视频| 麻豆成人av视频| 婷婷色综合www| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美精品一区二区大全| 三上悠亚av全集在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品一区二区在线观看99| 少妇熟女欧美另类| 久久久久久伊人网av| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 天堂中文最新版在线下载| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产片特级美女逼逼视频| 免费观看在线日韩| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本黄色片子视频| av福利片在线| 久久精品国产亚洲av天美| 十分钟在线观看高清视频www| 在线观看一区二区三区激情| 成人漫画全彩无遮挡| 一个人看视频在线观看www免费| 免费观看性生交大片5| 免费看光身美女| 国模一区二区三区四区视频| 大话2 男鬼变身卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲美女黄色视频免费看| 特大巨黑吊av在线直播| 777米奇影视久久| 日韩成人伦理影院| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品一区二区在线观看99| 春色校园在线视频观看| a级毛片在线看网站| 另类精品久久| 我的女老师完整版在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一个人看视频在线观看www免费| 久久午夜福利片| 国产成人精品无人区| 韩国高清视频一区二区三区| 久久99蜜桃精品久久| 中文字幕亚洲精品专区| 国产成人91sexporn| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 最新的欧美精品一区二区| 乱人伦中国视频| 久久久国产一区二区|