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    構(gòu)建氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測食品中蘇丹紅

    2022-12-22 09:09:02盧春霞閆圣坤劉成江林祥群王雙慧馮曉汀
    食品科學 2022年22期
    關(guān)鍵詞:蘇丹紅血紅素比色

    盧春霞,閆圣坤,劉成江,林祥群,王雙慧,馮曉汀

    (1.長江師范學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院,重慶 408100;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)機械化研究所,新疆 烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,新疆 石河子 832000;4.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學院,新疆 石河子 832000)

    蘇丹紅是一種人工合成的親脂類偶氮染料,主要包括蘇丹紅I、II、III、IV 4種類型。由于其增色效應(yīng)顯著,常被作為非法添加劑用于改良番茄、辣椒等產(chǎn)品外觀,直接或間接危害人體健康。蘇丹紅被國際癌癥研究機構(gòu)列為三類致癌物,其中蘇丹紅III的初級代謝產(chǎn)物4-氨基偶氮苯被列為二類致癌物[1]。我國及歐盟嚴禁將蘇丹紅作為色素添加劑在食品和飼料中使用。除了人為添加,一些農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中由于環(huán)境污染、肥料、農(nóng)藥和塑料包裝等不規(guī)范使用以及一些不明因素,導(dǎo)致其一定程度上受到蘇丹紅交叉污染[2]。因此,準確、靈敏、快速地檢測食品中蘇丹紅染料的方法對食品安全監(jiān)管有著十分重要意義。

    目前,蘇丹紅檢測方法主要包括儀器分析方法,如高效液相色譜法[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)[4]。色譜與質(zhì)譜技術(shù)靈敏度較高、結(jié)果可靠,但樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測成本高、有機溶劑用量大、且儀器設(shè)備昂貴,需要專業(yè)的操作人員。免疫分析方法[5]是應(yīng)用較為廣泛的快篩檢測方法,與儀器分析法相比具有特異性強、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點,但抗體制備周期長,成本較高。

    核酸適配體是與靶分子特異性結(jié)合的一段單鏈DNA或RNA,由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選獲得。適配體與靶標結(jié)合時可折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)體及G-四鏈體等結(jié)構(gòu),通過氫鍵、范德華力和堿基堆積等作用進行分子識別?;陔S機文庫的龐大庫容和單鏈核苷酸空間結(jié)構(gòu)的多樣性,適配體幾乎可以與所有種類的靶標[6-12]發(fā)生結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比,核酸適配體具有不受免疫原限制、可人工合成、成本低廉、應(yīng)用范圍廣、易于標記和保存等優(yōu)點。因此,適配體作為新型識別探針在食品分析領(lǐng)域得到廣泛研究和應(yīng)用[13-15]。

    在常規(guī)比色檢測中,納米材料和生物酶常作為發(fā)光信號標記在識別探針上。但是這種標記方法耗時耗力,且天然酶成本高,對保存環(huán)境要求高。血紅素/G-四鏈體DNA酶則是近年來迅速發(fā)展起來的一種人工合成的DNA酶。富含鳥嘌呤堿基(G)的DNA序列通過氫鍵作用折疊成特殊的G-四鏈體結(jié)構(gòu),當與氯化血紅素結(jié)合后,形成一種具有過氧化物酶活性的DNA酶,能催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)或2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺鹽(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt,ABTS),生成藍色TMB+或綠色ABTS陽離子自由基。與天然酶相比,該酶熱穩(wěn)定性高、價格便宜、合成簡單、易于標記,被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域[16]。由于食品樣品成分復(fù)雜、干擾大,基質(zhì)效應(yīng)可能影響檢測靈敏度。為實現(xiàn)對靶標的高靈敏檢,有研究者將G-四鏈體DNA酶與雜交鏈式反應(yīng)(hybridization chain reaction,HCR)相結(jié)合,構(gòu)建生物傳感器應(yīng)用于生物標記物、微生物、毒素、金屬離子等檢測[17-18]。但目前尚未見到基于適配體識別-氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶檢測蘇丹紅的研究報道。

    本研究以蘇丹紅III適配體為識別元件,以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針,結(jié)合HCR信號放大策略構(gòu)建一種比色生物傳感器。檢測原理如圖1所示,該傳感器由一個檢測探針和兩個發(fā)夾DNA探針(H1和H2)組成,檢測探針由蘇丹紅III適配體序列、觸發(fā)HCR反應(yīng)的啟動序列,以及與適配體互補的序列組成,H1和H2包括非活性構(gòu)型的G-四鏈體序列作為功能元件。無靶標時,檢測探針形成發(fā)夾折疊結(jié)構(gòu),無法引發(fā)HCR反應(yīng),當靶標結(jié)合適配體后打開檢測探針引發(fā)HCR反應(yīng),生成大量富G-四鏈體的雙鏈DNA納米線,加入血紅素后,形成具有過氧化物酶活性的氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶,催化H2O2氧化底物并顯色。構(gòu)建的傳感器可用于簡單、靈敏、快速地進行蘇丹紅比色檢測,為食品中蘇丹紅的檢測提供一定的技術(shù)支撐。

    圖1 基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色測定蘇丹紅示意圖Fig. 1 Schematic illustration of colorimetric detection of Sudan based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    火鍋料、辣椒醬、辣椒粉均購于本地超市。

    蘇丹紅I(CAS號842-07-9)、蘇丹紅II(CAS號3118-97-6)、蘇丹紅III(CAS號85-86-9)、蘇丹紅IV(CAS號85-83-6)、對位紅(CAS號6410-10-2)、日落黃(CAS號2783-94-0)標準品 上海安譜實驗科技股份有限公司;牛血清白蛋白、二甲基亞砜、氯化血紅素、吐溫-20、TMB顯色試劑盒、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、AgNO3生工生物工程(上海)股份有限公司;鏈霉親和素包被的酶標板 蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司;其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

    用乙腈將蘇丹紅配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的蘇丹紅原液,置于-20 ℃避光保存。使用時用pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(含8 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO)稀釋蘇丹紅原液至所需的質(zhì)量濃度。

    將氯化血紅素溶于二甲基亞砜中配制成5 mmol/L的氯化血紅素原液,置于4 ℃避光保存。使用時用PBS稀釋至所需濃度。

    生物素化檢測探針由蘇丹紅III核酸適配體[19]和觸發(fā)HCR反應(yīng)的啟動序列組成;發(fā)夾DNA探針在5'(或3')和3'(或5')端分別含有3/4和1/4的G-四鏈體序列[20];探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其堿基序列見表1。

    表1 檢測探針及發(fā)夾DNA探針序列Table 1 Sequences of the detection probe and hairpin DNA probes

    1.2 儀器與設(shè)備

    5MX 96 孔板混勻儀 美國賽洛捷克公司;Mk3酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;MS3 basic渦旋混合器德國IKA公司;Milli-QReference超純水系統(tǒng) 美國密理博公司;5424R臺式冷凍離心機 德國艾本德公司。

    1.3 方法

    1.3.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器測定蘇丹紅III

    鏈霉親和素包被的酶標板使用前用PBST溶液(0.05%吐溫-20+PBS)洗滌3次,加入100 μL 80 nmol/L生物素化檢測探針,室溫孵育20 min。PBST溶液洗滌3次,加入質(zhì)量分數(shù)為5%的牛血清白蛋白溶液,封閉2 h,PBST洗滌后備用。將100 μL一定質(zhì)量濃度的蘇丹紅III標準品加入到酶標板,室溫孵育30 min,PBST洗滌。H1和H2使用前于95 ℃加熱5 min,然后緩慢冷卻至室溫。分別向酶標板中加入50 μL 400 nmol/L的H1和H2,37 ℃孵育60 min。PBST洗滌后加入100 μL 0.8 μmol/L氯化血紅素,室溫孵育30 min。PBST洗滌,加入100 μL TMB底物(含H2O2),室溫孵育5~8 min后,加入100 μL 1 mol/L HCl溶液停止反應(yīng)。通過顏色變化定性檢測蘇丹紅,用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。pH 7.4 PBS設(shè)置為空白對照。

    1.3.2 檢測條件優(yōu)化

    采用單因素優(yōu)化試驗分別優(yōu)化檢測探針濃度、靶標與適配體結(jié)合時間、H1和H2濃度、HCR反應(yīng)時間、氯化血紅素濃度、氯化血紅素/G-四鏈體反應(yīng)時間的實驗條件。均以蘇丹紅III為待測靶標,固定其質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

    1.3.2.1 檢測探針濃度優(yōu)化

    固定適配體與靶標結(jié)合時間50 min,發(fā)夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應(yīng)時間2 h,氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置檢測探針濃度分別為20、40、80、100、150、200 nmol/L,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測,考察檢測探針濃度對檢測性能的影響。

    1.3.2.2 靶標與適配體結(jié)合時間優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,固定發(fā)夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應(yīng)時間為2 h,氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置適配體與靶標結(jié)合時間分別為10、20、30、60、100 min,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.3 發(fā)夾探針濃度優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,固定HCR反應(yīng)時間2 h,氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置發(fā)夾探針H1和H2濃度分別為50、100、200、400、600、800 nmol/L,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.4 HCR反應(yīng)時間

    采用上述優(yōu)化條件,固定氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置HCR反應(yīng)時間分別為30、60、90、120、150 min,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.5 氯化血紅素濃度優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,固定氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間為60 min,設(shè)置氯化血紅素濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μmol/L,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.2.6 氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間優(yōu)化

    采用上述優(yōu)化條件,設(shè)置氯化血紅素和G-四鏈體反應(yīng)時間分別為10、30、60、90、120 min,采用1.3.1節(jié)方法進行檢測。

    1.3.3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾測定

    采用1.3.2節(jié)中優(yōu)化的實驗條件,將相同濃度(1 μmol/L)的Hg2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Cu2+分別添加到蘇丹紅III溶液中,按照1.3.1節(jié)方法進行檢測,測定重金屬離子對該方法的干擾程度。

    1.3.4 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能測定

    1.3.4.1 靈敏度測定

    在優(yōu)化條件下,用pH 7.4 PBS將蘇丹紅III標準溶液稀釋系列梯度質(zhì)量濃度(0、0.1、0.5、1、5、10、50、250 ng/mL),用1.3.1節(jié)方法進行檢測,觀察溶液顏色變化,在450 nm波長處測定吸光度。以蘇丹紅III質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,進行線性擬合,得到線性方程和相關(guān)系數(shù),計算方法的檢測限(limits of detection,LOD):

    式中:σ為空白對照檢測10次的平均標準偏差;S為斜率。

    1.3.4.2 特異性測定

    采用1.3.1節(jié)的方法檢測相同質(zhì)量濃度(100 ng/mL)的蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅IV、對位紅、日落黃標準品,同時設(shè)PBS為空白對照。觀察溶液顏色變化,在450 nm波長處測定吸光度。

    1.3.4.3 實際樣品測定

    參考GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[21]對樣品進行前處理,稱取2 g辣椒醬、辣醬粉、番茄醬樣品(精確到0.001 g),分別添加高、中、低3種水平的蘇丹紅III標準溶液,使加標含量分別為5、50、200 ng/g。然后加入10 mL正己烷,振蕩混勻,超聲提取10 min,以5 000 r/min離心5 min。移取正己烷層,殘渣用正己烷重復(fù)提取1次,合并兩次上清液。氮吹儀濃縮上清液,乙腈定容至1 mL,用PBS稀釋5 倍后采用1.3.1節(jié)的方法進行檢測,計算加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。同時采用GB/T 19681—2005[21]對樣品進行檢測,并對兩種方法的檢測結(jié)果進行比較。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測條件優(yōu)化

    如圖2A所示,吸光度隨著檢測探針濃度的增加而增加,當濃度超過80 nmol/L后,吸光度無顯著變化(P>0.05),故檢測探針最佳濃度為80 nmol/L。如圖2B所示,吸光度隨著結(jié)合時間的延長而增大,當結(jié)合時間大于30 min后,吸光度無顯著變化(P>0.05),意味著反應(yīng)基本達到飽和狀態(tài)。因此,后續(xù)實驗選擇靶標與適配體的結(jié)合時間為30 min。如圖2C所示,當H1和H2濃度均達到400 nmol/L后,吸光度無顯著變化(P>0.05),可能是由于H1和H2濃度過大產(chǎn)生了空間位阻,影響了雜交鏈的進一步形成。HCR反應(yīng)時間過短會影響檢測靈敏度,但時間過長則會影響檢測效率,圖2D表明,當時間超過60 min后,吸光度無顯著變化(P>0.05),說明反應(yīng)達到飽和狀態(tài),故HCR反應(yīng)時間選擇60 min。由圖2E和F可知,氯化血紅素最佳濃度為0.8 μmol/L,氯化血紅素和G-四鏈體最佳反應(yīng)時間為30 min。

    圖2 不同實驗條件對蘇丹紅III檢測的影響Fig. 2 Effects of different experimental conditions on the detection of Sudan III

    2.2 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾分析

    一些金屬離子可選擇性地與DNA雙鏈中的堿基結(jié)合,形成金屬介導(dǎo)的堿基對。研究證明一些金屬離子能促進或阻礙氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶的形成,進而影響DNA酶活性[22-27]。從圖3可以看出,金屬離子對溶液的吸光度無顯著影響,主要原因可能與設(shè)計的探針序列及功能不同有關(guān),基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶測定重金屬離子的傳感器,大都依賴于設(shè)計富含特定堿基的功能序列識別重金屬離子來完成檢測[22-26]。比如,利用Ag+通過C-Ag+-C配位鍵促進氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶活性以實現(xiàn)Ag+檢測[22]。利用Hg2+與T堿基特異性結(jié)合原理,通過形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)抑制或促進該DNA酶活性實現(xiàn)Hg2+的檢測[23-25]。而本實驗所用探針(H1和H2)并不是針對重金屬離子設(shè)計的功能探針,在形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)時,無法形成錯配的雙鏈結(jié)構(gòu)。所以,重金屬離子對DNA酶的活性影響不大。

    圖3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器的影響Fig. 3 Effect of heavy metal ions on the colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

    2.3 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能分析

    2.3.1 靈敏度分析

    如圖4A所示,當蘇丹紅III質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時,肉眼可見明顯的顏色變化,因此,該方法可視化LOD為0.5 ng/mL。由圖4B可知,吸光度隨著蘇丹紅III質(zhì)量濃度的增加而增加,蘇丹紅III在0.5~250 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R=0.995),LOD為0.09 ng/mL。由表2可知,與GB/T 19681—2005方法[21]和文獻的蘇丹紅檢測方法相比,本研究建立的方法具有高靈敏度。

    圖4 不同蘇丹紅III質(zhì)量濃度下的檢測體系顏色(A)與吸光度(B)變化Fig. 4 Changes in the detection system’s color (A) and absorbance value (B) versus concentrations of Sudan III

    表2 蘇丹紅檢測方法比較Table 2 Comparison of reported methods for the detection of Sudan dyes

    2.3.2 特異性分析

    如圖5所示,當檢測體系中含有質(zhì)量濃度為100 ng/mL的蘇丹紅I~IV時,溶液在450 nm波長處的吸光度達到0.47~0.62,而對位紅和日落黃并未引起反應(yīng)溶液顏色明顯變化,其吸光度與空白樣品差異不顯著(P>0.05)。表明該適配體對蘇丹紅I~IV具有類選擇性,可能是由于蘇丹紅I~IV結(jié)構(gòu)高度相似,這對檢測一類結(jié)構(gòu)相似的靶標時可能更有應(yīng)用意義。然而Wang Ying等[19]的特異性分析結(jié)果顯示,蘇丹紅III適配體與蘇丹紅I、II和IV沒有明顯交叉反應(yīng),具體原因有待進一步研究。

    圖5 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測蘇丹紅特異性評估Fig. 5 Specificity analysis of colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes for Sudan detection

    2.3.3 實際樣品分析

    如表3所示,本方法的加標回收率為84.3%~101.6%,RSD為4.13%~8.36%。本方法的加標回收率與GB/T 19681—2005法相比差異不顯著(P>0.05),表明本方法結(jié)果準確可靠。

    表3 氯化血紅素/G四鏈體DNA酶比色生物傳感器法與GB/T 19681—2005高效液相色譜法加標回收對比(n =3)Table 3 Comparison of spiked recoveries between colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes and HPLC (n = 3)

    3 結(jié) 論

    以蘇丹紅III適配體為識別分子,以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針,結(jié)合HCR信號放大策略,構(gòu)建了一種簡單、新穎、高靈敏的比色生物傳感器,用于檢測食品中蘇丹紅。在優(yōu)化條件下,該比色傳感器方法LOD為0.09 ng/mL,加標回收率為84.3%~101.6%,RSD為4.13%~8.36%,可特異性識別蘇丹紅I、II、III、IV,檢測結(jié)果準確可靠。與GB/T 19681—2005方法相比,本方法樣品前處理簡單、不需要大型儀器;與傳統(tǒng)的免疫方法相比,不需要制備抗體,檢測成本低廉,同時也可實現(xiàn)高通量檢測;可為批量實現(xiàn)食品中蘇丹紅的快速檢測提供一定技術(shù)支撐。

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