一株牦牛源糞腸球菌的分離鑒定及安全性評價

■鐘 浪 孫金梅 張振偉 吳慶俠 董海龍 楊 飛* 曾江勇 馬宏財

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩850000）

牦牛有著“高原之舟”之稱，是西藏高原地區(qū)最具特色的經(jīng)濟動物之一，而犢牦牛腹瀉病是牦牛養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的疾病之一[1]，其輕度癥狀表現(xiàn)為腹瀉、食欲不振、精神萎靡、高熱、咳嗽等[2]；重度癥狀表現(xiàn)為機體脫水、便血、電解質(zhì)平衡紊亂，甚至引起犢牦牛死亡，對養(yǎng)殖業(yè)影響較大。由于藏區(qū)牧民養(yǎng)殖技術(shù)整體落后，對該病的治療多以抗生素為主，這導(dǎo)致該病的耐藥性十分嚴重[3]。因此，尋找抗生素的替代藥物十分迫切。

糞腸球菌（Enterococcus faecalis)為芽孢桿菌綱(Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)腸球菌科(Enterococ?caceae)腸球菌屬（Enterococcus)的兼性厭氧菌，是一種廣泛存在于動物腸道內(nèi)的益生菌群，對調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境具有重要作用[4]。其調(diào)節(jié)腸道菌群的功能主要體現(xiàn)在可調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)，提高家畜抗病性、生產(chǎn)性能[5]等，同時具有無殘留、無污染和無耐藥性等優(yōu)點[6]。目前被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療健康[6]、食品安全[7]等方面，分別于2008、2013、2018年被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部收錄在《飼料添加劑品種目錄》內(nèi)。有研究表明，優(yōu)良的糞腸球菌菌株主要來源于動物機體內(nèi)[8]，能快速定植并耐受胃腸道的復(fù)雜環(huán)境以發(fā)揮益生作用[9]。

本研究擬從健康牦牛的腸道內(nèi)容物中分離純化、篩選出具有防治犢牦牛腹瀉病的糞腸球菌菌株，對其安全性進行評價，并通過抑菌試驗、動物回歸實驗驗證分離株對犢牦牛腹瀉性疾病的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

糞腸球菌（E.faecalis）S-5：由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)重點臨床實驗室分離自健康牦牛糞便，現(xiàn)保存于-80℃冰箱中。

抑菌試驗指示菌株：大腸桿菌O111菌株、大腸桿菌O78菌株購自西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防實驗室；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；表皮葡萄球菌由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)重點臨床實驗室分離所得。

1.1.2 試驗動物健康犢牦牛4頭，4～6月齡購自西藏林芝市巴宜區(qū)百巴鎮(zhèn)色貢村永珠羅布藏牦牛養(yǎng)殖合作社。

1.1.3 培養(yǎng)基

糞腸球菌固體培養(yǎng)基（規(guī)格250 g/瓶）、糞腸球菌液體培養(yǎng)基（規(guī)格250 g/瓶），購自凡科維(上海)科技有限公司。

1.1.4 藥品試劑

成套糞腸球菌生化鑒定管，購自青島海博生物有限公司；胰蛋白酶，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；牛膽鹽，購自杭州寶積生物科技有限公司。

1.1.5 設(shè)備

BAC-GZT-B01超凈工作臺購自廣州佰倫凈化設(shè)備制造有限公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱購自金壇市盛藍儀器制造有限公司；BXM-30R高壓蒸汽滅菌器購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-230SDCY超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司；TDZ5-WS高速冷凍離心機購自金壇市鴻科儀器廠；AZ-8685 pH計購自臺灣衡欣有限公司；Thermo Sci?entific?Multiskan?FC酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將凍存于-80℃冰箱的糞腸球菌S-5的凍存管取出，凍存管恢復(fù)室溫后接種于糞腸球菌固體培養(yǎng)基活化24 h后，轉(zhuǎn)接于糞腸球菌液體培養(yǎng)基，接種后總體積為10 mL(1 mL+9 mL)，于37℃下培養(yǎng)24 h獲得活化菌株，最后使用平板稀釋計數(shù)法記錄細菌活化數(shù)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定及溶血性分析

將所得疑似菌株做革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡100×油鏡下檢查并拍照記錄。使用新鮮綿羊血液制作哥倫比亞血平板，并接種所得疑似菌株，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察并拍照記錄。

1.2.3 生化鑒定

生化鑒定使用青島海博生物有限公司所生產(chǎn)的糞腸球菌生化鑒定管進行生化鑒定。參照其使用說明書對照鑒定結(jié)果。

1.2.4 耐受性試驗

耐膽鹽試驗：取復(fù)蘇菌株0.1 mL，分別接種至已滅菌的含有牛膽鹽溶液（0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/100 mL）的選擇培養(yǎng)基中，37℃、無氧條件下培養(yǎng)24 h，24 h后使用平板稀釋計數(shù)法記錄細菌存活數(shù)并以不加膽鹽培養(yǎng)的細菌活菌數(shù)為指標(biāo)計算各膽鹽濃度下細菌的活菌率。計算公式如下：細菌存活率（%）=（不同膽鹽濃度下的細菌存活數(shù)/空白對照組細菌存活數(shù)）×100。

胰蛋白酶的耐受性試驗：將復(fù)蘇細菌離心以收集菌體，用糞腸球菌液體培養(yǎng)基重懸至108CFU/mL，加入0.5%、1.0%、1.3%、1.6%、1.9%不同濃度的胰蛋白酶溶液中，37℃無氧條件下培養(yǎng)24 h；24 h后使用平板稀釋計數(shù)法記錄細菌存活數(shù)，并計算細菌存活率，計算公式如下：細菌存活率（%）=（不同胰蛋白酶濃度下的細菌存活數(shù)/108CFU/mL）×100。

耐酸試驗：將復(fù)蘇細菌離心以收集菌體，將滅菌后的糞腸球菌液體培養(yǎng)基pH調(diào)成(4.3、5.2、6.5、8.2和8.7)，37℃培養(yǎng)1 h后涂布于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基于37℃無氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 h，記錄生長狀況。

1.2.5 體外抑菌試驗

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別涂布20μL大腸桿菌O111、O78標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，后將已滅菌的牛津杯置于各培養(yǎng)基表面。最后抽取糞腸球菌純化液200μL轉(zhuǎn)移至牛津杯內(nèi)，37℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，測量其抑菌圈直徑。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定

PCR凝膠電泳試驗：選取耐受性及抑菌效果最好的一株分離菌使用EZUP DNA抽提取試劑盒提取純化菌株DNA并利用引物對DNA模板進行擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL，模板DNA（20～50 ng/μL）0.5μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5μL，Dntp(各2.5 mmoL/L)1μL，酶0.2μL；F(10 Um)0.5μL，R(10 Um)0.2μL，ddH2O 25μL。熱循環(huán)儀中，反應(yīng)按94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。

配置1.7%的凝膠塊，使用PCR擴增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測。將上述所得疑似糞腸球菌菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行16SrDNA測序。

16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析：利用BLAST網(wǎng)站、Gen Bank數(shù)據(jù)庫對所得測序結(jié)果進行同源性分析，運用MEGA 7軟件進行發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析。

1.2.7 動物回歸試驗

將4頭犢牦牛隨機分為2組，第一組標(biāo)記為1、2號，第二組標(biāo)記為3、4號，并分別使用大腸桿菌O111、O78標(biāo)準(zhǔn)株以含量為1×1010CFU/mL[10]每日灌服犢牦牛3次攻毒，灌服5～7日，直至出現(xiàn)典型的腹瀉癥狀后，使用含量為1×1010CFU/mL的糞腸球菌進行灌服治療，觀察并記錄犢牦牛臨床癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株活化

分離株S-5成功活化，該活化濃度為6.65×1010CFU/mL。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定及溶血性分析結(jié)果

由圖1～圖3可知，該分離株在普通糞腸球菌固體培養(yǎng)基上該菌落呈圓形、白色，菌落表面濕潤有光澤，其革蘭氏染色100×油鏡鏡檢呈紫色陽性球菌，菌落直徑為1.28～2.21μm，見圖1、圖2。將5株菌株接種于哥倫比亞血平板，菌落呈圓形、白色，菌落表面濕潤有光澤，S-5無明顯溶血環(huán)，但其菌落周圍變?yōu)楹谏?/p>

圖1 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基

圖2 革蘭氏100×油鏡

圖3 哥倫比亞血平板

2.3 生化鑒定（見表1）

由表1可知，在生化鑒定中，分離株S-5革蘭氏染色呈陽性，能分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖等、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解甘露醇、棉籽糖，在硫化氫、硝酸鹽、吲哚試驗中呈陰性，且血凝試驗中不發(fā)生凝血反應(yīng)，見表1。

2.4 耐受性試驗

2.4.1 耐膽鹽試驗（見表2）

由表2可知，在耐膽鹽試驗中，S-5菌株隨膽鹽濃度上升存活率不斷下降，經(jīng)F檢驗分析顯示，當(dāng)膽鹽濃度為0.03～0.15 g/100 mL時，分離株S-5耐受性呈顯著(P＜0.05)差異，當(dāng)膽鹽濃度為0.20～0.30 g/100 mL時，分離株S-5耐受性呈極顯著(P＜0.01)差異。

表1 分離株生理生化鑒定結(jié)果

表2 分離株在不同濃度的牛膽鹽溶液中的存活率（%）

2.4.2 耐胰蛋白酶液的試驗（見表3）

由表3可知，當(dāng)胰蛋白酶濃度為0.5%～1.3%時，S-5耐受性具佳，經(jīng)F檢驗分析顯示呈極顯著性(P＜0.01)差異；當(dāng)胰蛋白酶濃度為1.6%～1.9%時，S-5耐受性較佳，經(jīng)F檢驗分析顯示呈顯著性(P＜0.05)差異。2.4.3 耐酸試驗（見圖4）

表3 分離株在不同濃度的胰蛋白酶液下的存活率（%）

圖4 S-5在不同pH培養(yǎng)基中的生長情況

由圖4可知，S-5在pH為4.3、5.2、6.5時生長性能具佳。

2.5 體外抑菌試驗（見圖5和表4）

圖5 部分體外抑菌試驗結(jié)果

由圖5、表4可知，體外抑菌試驗證明，糞腸球菌S-5對大腸桿菌O111、O78皆有較好的抑菌效果，抑菌圈平均直徑分別為(17.00±1.00)、(20.00±1.00)mm；經(jīng)F檢驗分析數(shù)據(jù)表明，糞腸球菌S-5對大腸桿菌O111、O78抑菌效果呈顯著性（P＜0.05）差異；對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌皆無抑菌性，呈極顯著性（P＜0.01）差異。

表4 抑菌試驗結(jié)果（mm）

2.6 分子生物學(xué)鑒定

2.6.1 PCR凝膠電泳試驗（見圖6）

圖6可知，本次凝膠電泳所使用的為細菌鑒定通用引物，長度為1 500 bp左右，分離株S-5在凝膠成像分析儀上觀察位置，目的條帶處于Marker的1 500 bp左右，符合預(yù)期設(shè)定。

2.6.2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析（見圖7、圖8）

由圖7、圖8可知，經(jīng)16SrDNA測序后利用NCBI在線軟件對16SrDNA序列進行BLAST同源性比對，結(jié)果顯示該分離株S-5 16S測序長度為1 427 bp，經(jīng)同源性對比知其與糞腸球菌gp117、M-26染色體基因組有98.8%的相似；與糞腸球菌TBT2 SRLFDA 2016染色體基因組有98.3%的相似，即確定該分離株S-5為糞腸球菌菌屬，見圖7。經(jīng)計算，本試驗所得S-5序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中已知桿菌屬序列的種內(nèi)遺傳距離為0，分離株S-5與糞腸球菌KM495947.1、KY348704.1劃為同一分支。

圖6 S-5凝膠電泳圖（1.7%）

圖7 S-5菌株同源性比對分析

2.7 動物回歸試驗

攻毒第一日，4頭牦牛均正常；攻毒第二日，1、3、4號牦牛正常，2號有初期腹瀉表現(xiàn)；攻毒第3 d，4頭犢牦牛均出現(xiàn)水樣腹瀉癥狀；攻毒第4日，4頭犢牦牛依舊呈水樣腹瀉癥狀；攻毒第五日，4頭犢牦牛穩(wěn)定在水樣腹瀉狀態(tài)，并于攻毒第五日開始轉(zhuǎn)用糞腸球菌進行治療試驗。

治療第一日，4頭牦牛未見恢復(fù)；治療第二日，4頭犢牦牛腹瀉癥狀逐漸變得良好；治療第三日，4頭犢牦牛腹瀉癥狀逐漸接近健康；治療第四日，4頭犢牦牛腹瀉癥狀已完全消失。

3 討論

牦牛源糞腸球菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，屬于乳酸菌屬[4]，是乳酸菌屬中為數(shù)不多的條件致病菌[11]。與常見只具備益生功能的乳酸菌不同，糞腸球菌可能同時具備“益生功能[12]”及“致病功能[13-14]”兩種。前者主要體現(xiàn)為調(diào)節(jié)機體腸道功能、治療腸道疾病、增加機體免疫力[15-16]等；后者主要體現(xiàn)在其可感染動物機體的泌尿道、生殖道、口腔、手術(shù)傷口等[17]。

圖8 S-5菌株與參考菌種16S rDNA基因序列系統(tǒng)進化樹

因此，本次分離疑似糞腸球菌菌株S-5首先進行安全性測評，利用哥倫比亞血平板檢測其是否有溶血功能，結(jié)果顯示S-5菌株不具備溶血性，因此不會引起菌血癥、敗血癥等疾病；生化試驗中甘露醇試驗、血凝試驗結(jié)果皆呈陰性，表明其不致病，對比魯旭等[18]的試驗結(jié)果，S-5菌株與其生化結(jié)果相似，側(cè)面驗證本試驗中糞腸球菌不具備致病功能。經(jīng)耐膽鹽、耐胰蛋白酶液及耐酸試驗表明S-5菌株耐受效果良好，其中S-5菌株隨其膽鹽濃度上升存活率不斷下降，在不同濃度的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶濃度為0.5%～1.3%時，S-5耐受性具佳，胰蛋白酶濃度為1.3%～1.9%時，S-5耐受性較佳；耐酸試驗中，pH值較低的情況下（4.3、5.2、6.5）S-5菌株生長性能未受太大影響，綜上所述表明S-5菌株能適應(yīng)胃部的復(fù)雜環(huán)境而進入腸道定植。體外抑菌試驗結(jié)果表明S-5菌株對大腸桿菌類菌株具有良好的抑制效果，但對葡萄球菌類菌株表現(xiàn)不佳，與陳春艷等[19]所分離的糞腸球菌HEWA223、HEW-A503和HEW-A219對大腸桿菌的抑菌效果相似；最后對S-5菌株提取DNA進行16SrDNA測序分析，在凝膠電泳試驗過程中，所使用的為糞腸球菌鑒定通用引物，長度為1 500 bp左右，該分離株S-5在凝膠成像分析儀上觀察位置，目的條帶處于Marker的1 500 bp左右，符合預(yù)期設(shè)定，初步斷定其為糞腸球菌屬，在同源性對比試驗中，S-5菌株與糞腸球gp117、M-26染色體基因組98.8%的相似；與糞腸球菌TBT2 SRLFDA 2016染色體基因組98.3%的相似，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上與糞腸球菌KM495947.1、KY348704.1劃為同一分支，其中糞腸球菌KM495947.1是Partovi等[20]于2014年在伊朗地區(qū)從奶酪中分離得到的腸道益生菌群，糞腸球菌KY348704.1是Khodaei等[21]于2017在伊朗地區(qū)從牛奶中分離得到的益生菌群，因此確定該分離株為益生性糞腸球菌。動物回歸試驗顯示分離株對大腸桿菌所導(dǎo)致的犢牦牛腹瀉疾病具有良好的治療效果，對牦牛并未造成致病作用，與Zyl等[22]的對糞腸球菌的評論一致，符合預(yù)期效果。

4 結(jié)論

綜上所述，本次分離的糞腸球菌對大腸桿菌所致的犢牦牛腹瀉疾病具有較強的防治功能，為防治犢牦牛腹瀉疾病所用益生菌制劑提供重要的參考菌源，也為防治犢牦牛腹瀉性疾病提供新思路。