復(fù)合酶制劑對新疆伊犁鵝產(chǎn)蛋性能和盲腸微生物菌群的影響

■趙曉鈺 王俊花 高 雨 李海英楊 敏 馬超宇 張九龍

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

腸道微生物系統(tǒng)作為動物腸道內(nèi)最復(fù)雜的系統(tǒng)，其中的大量微生物參與養(yǎng)分的吸收和代謝，并影響動物生產(chǎn)性能和腸道健康[1]。動物腸道微生物可以產(chǎn)生大量益生菌，且腸道中的有益菌群在提高營養(yǎng)物質(zhì)利用以及維護(hù)動物機體健康等方面起了很大的作用。程志斌等[2]研究表明，在蛋雞日糧中添加1 g/kg非淀粉多糖酶（葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶和纖維素酶）和0.4 g/kg植酸酶，均可顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率，降低料蛋比。譚子超等[3]研究表明，在肉雞小麥-豆粕型飼糧中添加3 g/kg復(fù)合酶制劑（木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶和植酸酶），可以顯著提高21日齡和42日齡肉雞腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量。以上研究說明，在家禽飼糧中添加一定比例的酶制劑，使可溶性非淀粉多糖（NSP），如纖維素、半纖維素、果膠等分解成可利用的糖類[4]，并能有效破壞細(xì)胞壁中非水溶性抗?fàn)I養(yǎng)因子，進(jìn)而有利于細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放，同時有效緩解水溶性NSP導(dǎo)致的食糜黏度過大，從而提高飼料利用率，提高家禽的生產(chǎn)性能。另外，酶制劑還可以促進(jìn)家禽腸道內(nèi)有益菌的增殖，減少有害菌的增殖[5-6]。伊犁鵝是我國唯一由灰雁馴化而來的家鵝品種，是優(yōu)質(zhì)的地方遺傳資源[7]。因其產(chǎn)蛋性能較低，且就巢性強，遠(yuǎn)不能滿足規(guī)?；a(chǎn)及市場的需求[8]。本試驗旨在探究飼糧中添加復(fù)合酶制劑對伊犁鵝產(chǎn)蛋性能及腸道菌群的影響，為復(fù)合酶制劑在伊犁鵝生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用復(fù)合酶制劑由深圳綠微康生物科技有限公司提供，主要成分為蛋白酶（3 000 U/g）、木聚糖酶（2 000 U/g）、纖維素酶（1 000 U/g）、甘露聚糖酶（800 U/g）、α-淀粉酶（500 U/g）、普羅蘭酶（300 U/g）。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗采用單因素試驗設(shè)計，以健康狀況良好、體重相近、飼養(yǎng)管理水平一致，并處于產(chǎn)蛋期的200只4歲伊犁鵝為試驗對象，由新疆額敏縣恒鑫實業(yè)有限公司國家級伊犁鵝保種場提供。隨機分為4組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)5只鵝（公母比例1∶4）。各組間正試鵝初始產(chǎn)蛋率均無顯著差異（P＞0.05）。對照組飼喂玉米-豆粕型飼糧，試驗組在對照組的基礎(chǔ)上分別添加0.2、0.3、0.4 g/kg的復(fù)合酶制劑。預(yù)試期7 d，試驗期為35 d。試驗分組見表1，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗設(shè)計與分組

1.3 試驗動物飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在新疆額敏縣恒鑫實業(yè)有限公司國家級伊犁鵝保種場進(jìn)行，試驗鵝采用單圈常規(guī)飼養(yǎng)方式，種鵝舍內(nèi)有產(chǎn)蛋窩、食槽、地面運動場和水面運動場。試驗期間，試驗鵝自由采食和飲水，分2次投喂（每天08:00和16:00各喂料1次），投料后撿蛋并記錄。

1.4 產(chǎn)蛋性能測定

每日準(zhǔn)確記錄各重復(fù)組試驗鵝的飼料消耗量、總蛋重、總產(chǎn)蛋個數(shù)、不合格蛋數(shù)，根據(jù)飼養(yǎng)記錄計算第2周（1～14 d）、第4周（1～28 d）及全期（1～35 d）的平均日采食量、平均日產(chǎn)蛋量、平均蛋重、產(chǎn)蛋率、料蛋比和商品蛋合格率。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

平均日采食量[g/(只·d)]=總耗料量（g）/（飼養(yǎng)天數(shù)×總鵝數(shù)）

平均日產(chǎn)蛋量（g/d）=總產(chǎn)蛋量（g）/飼養(yǎng)天數(shù)（d）

平均蛋重（g）=總產(chǎn)蛋量（g）/總產(chǎn)蛋數(shù)

產(chǎn)蛋率（%）=總產(chǎn)蛋數(shù)/（飼養(yǎng)天數(shù)×總鵝數(shù)）×100

料蛋比=總耗料量（kg）/總產(chǎn)蛋重（kg）

商品蛋合格率（%）=合格蛋數(shù)/總產(chǎn)蛋數(shù)×100

1.5 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束的當(dāng)天，從對照組和試驗Ⅱ組（由前期試驗產(chǎn)蛋數(shù)據(jù)可得，試驗Ⅱ組為產(chǎn)蛋性能最佳組）中各隨機選取8只體重接近的伊犁鵝，屠宰后迅速采集盲腸內(nèi)容物，置于液氮中保存。對照組盲腸內(nèi)容物樣品分別命名為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7及A8，試驗Ⅱ組盲腸內(nèi)容物樣品分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7及B8。

1.6 DNA提取與高通量測序

使用CTAB法對伊犁鵝盲腸內(nèi)容物的DNA進(jìn)行提取。使用細(xì)菌16S rRNA通用序列擴(kuò)增16S rRNA V3～V4可變區(qū)。引物序列為341F：CCTAYGGGRBG?CASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性1 min；30個循環(huán)包括（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。純化PCR產(chǎn)物，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后使用NovaSeq6000進(jìn)行上機測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量過濾，對通過質(zhì)量過濾的序列進(jìn)行連接，得到每個樣品的有效序列。對有效序列進(jìn)行進(jìn)一步過濾和去除嵌合體處理，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。16SrRNA V3～V4可變區(qū)擴(kuò)增和測序工作由諾禾致源生物技術(shù)有限公司完成。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010軟件、SPSS 20.0軟件進(jìn)行產(chǎn)蛋數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。采用Uparse7.0.1001軟件、R2.15.3軟件及Qiime 1.9.1軟件等進(jìn)行盲腸內(nèi)容物菌群數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶制劑對伊犁鵝產(chǎn)蛋性能的影響

表3 復(fù)合酶制劑對伊犁鵝產(chǎn)蛋性能的影響

由表3可知，在試驗的第2周，試驗各組之間在產(chǎn)蛋性能方面均差異不顯著（P＞0.05）。在試驗的第4周，與對照組相比，試驗Ⅱ組產(chǎn)蛋率極顯著提高81.37%（P＜0.01），與試驗Ⅰ、Ⅲ組相比，試驗Ⅱ組產(chǎn)蛋率分別顯著提高33.80%（P＜0.05）、30.01%（P＜0.05）；與對照組相比，試驗Ⅱ組料蛋比顯著降低41.31%（P＜0.05）。綜合全期，與對照組和試驗Ⅰ組相比，試驗Ⅱ組產(chǎn)蛋率分別顯著提高33.33%（P＜0.05）和31.82%（P＜0.05）；與對照組相比，試驗Ⅱ組料蛋比顯著降低23.67%（P＜0.05）。其余各組各指標(biāo)間均差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 復(fù)合酶制劑對伊犁鵝盲腸微生物菌群的影響2.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)控

通過對reads剪切過濾，每個樣品平均測得9.23×104條raw reads，并通過質(zhì)量控制每個樣品平均獲得8.58×104條clean reads，序列的平均長度在418 bp，Q20均在97.83%以上，說明所得數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，能保證后續(xù)試驗分析的可靠性。

2.2.2 盲腸微生物的OTUs注釋結(jié)果(見圖1)

圖1 韋恩圖

由圖1韋恩圖可知，對照組共獲得2 133個操作分類單元（OTUs），復(fù)合酶制劑組共獲得2 111個OTUs，分別占總OTUs個數(shù)的90.77%和89.83%。其中，對照組特有239個OTUs，復(fù)合酶制劑組特有217個OTUs，共有的操作分類單元(OTUs)有1 894個，占總OTUs個數(shù)的80.60%，說明兩組伊犁鵝盲腸結(jié)構(gòu)具有很高的相似性。

2.2.3 稀釋曲線

由圖2可知，在測序量達(dá)到49 000時，細(xì)菌稀釋曲線接近平臺期，即使有再多的數(shù)據(jù)量也只能產(chǎn)生很少的OTUs，表明當(dāng)前的測序量能夠很好地反映出樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

2.2.4 腸道菌群Alpha多樣性分析

將對照組和0.3 g/kg酶制劑組(試驗Ⅱ組)樣品所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTUs聚類，利用程序運算得到評價樣品中群落豐富度和多樣性的Alpha多樣性指數(shù)(見表4)，Alpha多樣性指數(shù)包括Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods coverage指數(shù)。由表4可知，對照組和0.3 g/kg酶制劑組間Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods coverage指數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 稀釋曲線

表4 盲腸微生物多樣性指數(shù)分析

2.2.5 微生物豐富度和多樣性的分析

2.2.5.1 復(fù)合酶制劑對盲腸內(nèi)容物門水平菌群豐度的影響(見表5、圖3)

表5 復(fù)合酶制劑對盲腸內(nèi)容物門水平菌群豐度的影響(門水平%)

由表5和圖3可知，在微生物分類門水平上，通過NovaSeq測序，檢測到的前10個菌門中，對照組有6個優(yōu)勢菌群（豐度＞1%為優(yōu)勢菌群），分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Pro?teobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verru?comicrobia）和放線菌門（Actinobacteria），其占比分別為45.20%、32.26%、11.17%、3.61%、1.11%和3.64%。復(fù)合酶制劑組有4個優(yōu)勢菌群，分別是擬桿菌門（Bac?teroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteo?bacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其占比分別為54.76%、29.87%、10.14%和2.61%。以上結(jié)果表明，盲腸菌群中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為主要菌門，復(fù)合酶制劑組擬桿菌門相對豐度極顯著升高（P＜0.01），而梭桿菌門相對豐度極顯著降低（P＜0.01）。

圖3 對照組和0.3 g/kg酶制劑組在門水平上的相對豐度

2.2.5.2 復(fù)合酶制劑對盲腸內(nèi)容物屬水平菌群豐度的影響(見表6、圖4)

表6 復(fù)合酶制劑對盲腸內(nèi)容物屬水平菌群豐度的影響(屬水平%)

圖4 對照組和0.3 g/kg酶制劑組在屬水平上的相對豐度

由表6和圖4可知，在微生物分類屬水平上，檢測到的前10個屬中，對照組有9個優(yōu)勢菌群，分別是擬桿菌屬（Bacteroides）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、Peptoclostridium、unidentified_Ru?minococcaceae、Subdoligranulum、消化球菌屬（Peptococ?cus）、Fournierella和Akkermansia。其 占 比 分 別 為22.10%、3.63%、3.61%、3.40%、3.14%、2.46%、1.65%、1.41%和1.09%。復(fù)合酶制劑組有6個優(yōu)勢菌群，分別是擬桿菌屬（Bacteroidetes）、脫硫弧菌屬（Desulfovi?brio）、unidentified_Ruminococcaceae、Fournierella、Sub?doligranulum和巨單胞菌屬（Megamonas），其占比分別為32.00%、5.95%、3.50%、1.95%、1.82%和1.72%。以上結(jié)果表明，盲腸菌群中擬桿菌屬為主要菌屬，復(fù)合酶制劑組擬桿菌屬相對豐度極顯著升高（P＜0.01），而梭桿菌屬相對豐度極顯著降低（P＜0.01），脫硫弧菌屬相對豐度顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)合酶制劑對伊犁鵝產(chǎn)蛋性能的影響

飼料酶制劑主要是降解類的酶制劑，把抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)[非淀粉多糖(NSP)和植酸鹽]或營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)和淀粉）降解為無抗?fàn)I養(yǎng)特性的成分或容易吸收的營養(yǎng)成分[9]。玉米和豆粕中含有大量的NSP，添加酶制劑可去除飼料中的NSP，釋放更多的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高動物的生產(chǎn)性能。孫旺斌等[10]研究表明，在海蘭褐蛋雞日糧中添加0.4%的復(fù)合酶制劑（α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等）可顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比。宋連喜等[11]在蛋雞日糧中添加0.1%的復(fù)合酶制劑（酸性蛋白酶、木聚糖酶、果膠酶等）可以使產(chǎn)蛋率顯著提高，料蛋比顯著降低。本試驗結(jié)果表明，添加0.3 g/kg復(fù)合酶制劑可顯著提高產(chǎn)蛋期伊犁鵝的產(chǎn)蛋率（P＜0.05），顯著降低料蛋比，與上述孫旺斌[10]、宋連喜等[11]研究結(jié)果基本一致。可能的原因是在產(chǎn)蛋期伊犁鵝飼糧中添加復(fù)合酶制劑，可去除玉米-豆粕型飼糧中的NSP，釋放更多的營養(yǎng)物質(zhì)，維持腸道健康，從而提高動物的產(chǎn)蛋性能[12]。

3.2 復(fù)合酶制劑對伊犁鵝盲腸微生物菌群的影響

3.2.1 復(fù)合酶制劑對盲腸微生物菌群Alpha多樣性的影響

腸道菌群多樣性是促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機體免疫等生命活動的基礎(chǔ)，多樣性的增加有利于機體新陳代謝和免疫防御，進(jìn)而有益于宿主健康[13]。Alpha多樣性分析反映微生物群落的多樣性和豐度[14]，Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)用于評估菌群的豐度[15]。Shannon多樣性指數(shù)越大，說明群落多樣性越高[16]。Simpson指數(shù)越小說明樣品中物種越豐富[17]，Goods coverage指數(shù)表示各樣品文庫的覆蓋率，實際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況[18]，Goods coverage指數(shù)均大于0.99，說明了該測序結(jié)果已基本覆蓋樣本的多樣性[19]。本試驗結(jié)果顯示，對照組和0.3 g/kg酶制劑組間豐度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和覆蓋度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），說明添加復(fù)合酶制劑未改變伊犁鵝盲腸內(nèi)容物的多樣性。

3.2.2 復(fù)合酶制劑對盲腸微生物菌群門水平的影響

盲腸在家禽糖類代謝和氮代謝的過程中起重要的作用，盲腸內(nèi)的擬桿菌在幫助分解多糖、提高多糖利用率[20]、加快黏膜發(fā)育[21]及維持腸道微生態(tài)平衡[22]方面起到了積極的作用，較高豐度的擬桿菌有利于腸道中營養(yǎng)物質(zhì)吸收[23]。梭桿菌包含壞死梭桿菌和核梭桿菌等多種致病菌，對動物具有毒害作用[17]。本試驗通過盲腸微生物門水平的組成分析發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是盲腸微生物的主要組成部分，這與鵝[24]和雞[19]盲腸中的微生物組成的報道相一致。Yan等[25]在揚州鵝飼糧中添加不同比例的發(fā)酵飼料，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門豐度顯著增加，可能與鵝的生產(chǎn)性能呈正相關(guān)。陳繼發(fā)等[17]研究表明，在蛋雞飼糧中添加0.9 g/kg蒙脫石可顯著提高產(chǎn)蛋雞日產(chǎn)蛋量（P＜0.05），同時盲腸中梭桿菌門的相對豐度也有一定程度降低。本試驗在產(chǎn)蛋期伊犁鵝的日糧中添加復(fù)合酶制劑，極顯著增加了伊犁鵝盲腸門水平上擬桿菌門的相對豐度（P＜0.01），極顯著降低了梭桿菌門的相對豐度（P＜0.01）。飼糧中復(fù)合酶制劑的添加改善了產(chǎn)蛋期伊犁鵝的盲腸菌群結(jié)構(gòu)，增加了有益菌的豐度，降低了有害菌的豐度，提高了營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，維持腸道健康。

3.2.3 復(fù)合酶制劑對盲腸微生物菌群屬水平的影響

鵝消化纖維素的主要場所在盲腸，盲腸中含有大量降解纖維素的微生物，將纖維素分解為可被吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌屬具有很高的纖維降解能力[26]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)添加0.3 g/kg復(fù)合酶制劑顯著增加了脫硫弧菌屬的豐度（P＜0.05），提示添加復(fù)合酶制劑可提高伊犁鵝盲腸纖維素的降解能力。龍建華等[27]研究表明，擬桿菌屬豐度的顯著增加，提高了五龍鵝對糖類物質(zhì)的分解和利用，進(jìn)而提高五龍鵝的生長性能。蒲翠敏[28]在正常櫻桃谷鴨與患鴨瘟病的櫻桃谷鴨腸道微生物比較研究中，發(fā)現(xiàn)患病組較正常組梭桿菌屬豐度顯著增加（P＜0.05）。本試驗添加0.3 g/kg復(fù)合酶制劑，試驗鵝盲腸擬桿菌屬的相對豐度得到了極顯著增加（P＜0.01），而梭桿菌屬的相對豐度極顯著降低（P＜0.01），這與本試驗盲腸微生物菌群在門水平上的結(jié)果相一致，表明添加復(fù)合酶制劑增加了產(chǎn)蛋期伊犁鵝盲腸內(nèi)的有益菌的數(shù)量，降低了盲腸內(nèi)有害菌的數(shù)量，有利于維持機體腸道的健康和營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用，這與本試驗中伊犁鵝產(chǎn)蛋率的提高相印證。

4 結(jié)論

本試驗條件下，在飼糧中添加0.3 g/kg復(fù)合酶制劑可顯著提高伊犁鵝產(chǎn)蛋率，顯著降低料蛋比，顯著或極顯著增加盲腸有益菌（擬桿菌門、擬桿菌屬、脫硫弧菌屬）的相對豐度，極顯著減少有害菌（梭桿菌門、梭桿菌屬）的相對豐度，有助于提高伊犁鵝腸道的消化吸收功能和預(yù)防腸道疾病，從而提高伊犁鵝的產(chǎn)蛋性能。