日糧中添加亞硒酸鈉對綿羊精液品質、線粒體活性和葡萄糖轉運蛋白的影響

■靳天宇 牛宏澤 胡 宇 任有蛇 石 磊

（山西農業(yè)大學動物科學學院，山西太谷030801）

硒（Se）是人和動物體所必需的微量元素之一，主要經胃腸道吸收后廣泛分布于體內各處，參與動物體內各種代謝反應，具有抗氧化應激、增強免疫力、保護心血管的作用[1]。除此之外，硒與雄性動物繁殖機能，尤其是精子的產生也有著密切聯系[2]。Song等[3]研究表明，硒能通過調節(jié)細胞凋亡關鍵基因的表達量來調節(jié)生精細胞的增殖與凋亡。睪丸和附睪中高濃度的硒通過參與合成各種硒蛋白，直接參與睪酮的合成以及精子的發(fā)生。而缺硒不但會引發(fā)各種疾病，還會嚴重影響動物的生長性能，導致精子質量變差，造成繁殖能力的下降[4]。金海峰等[5]研究表明，在羔羊日糧中添加納米硒能顯著提高精子的頂體完整率，增強精漿中抗氧化酶的活性，從而提高精液品質；閆治川等[6]則發(fā)現，在養(yǎng)殖過程中補硒，能顯著提高波爾山羊的血清硒含量，精子活力也有顯著性提高；施力光等[7]研究發(fā)現，日糧中添加0.5 mg/kg酵母硒，能顯著提高海南黑山羊的精子密度和精子活力，這充分說明了硒對精子的產生和精液的品質具有十分重要的調節(jié)作用。

線粒體是精子最重要的細胞器，位于精子中段，通過復雜的氧化磷酸化生成ATP為精子供能。在線粒體呼吸氧化過程中，電子經過呼吸鏈的傳遞，在內膜兩側造成了其他離子濃度的傳遞，從而形成了線粒體膜電位，膜電位的高低決定著線粒體的活性，也與精子活力與受精能力密切相關。但一直以來線粒體在精子生理和病理中的作用卻被忽視。最近的研究指出，線粒體正常的能量代謝是支持精子多種功能的關鍵因素[8]，而葡萄糖和果糖是其主要的代謝底物和燃料分子。葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)是一類調控胞外葡萄糖進入胞內的跨膜蛋白，參與精子能量代謝，在調節(jié)精子能量代謝過程中發(fā)揮著關鍵作用[9]。已知的GLUTs由500個左右的氨基酸殘基組成[10]，其結構共有14種。GLUTs家族中大部分蛋白都可以轉運葡萄糖，已有研究報道，一些糖轉運蛋白如GLUT 3、GLUT 8的分布和表達與精子活力和線粒體功能有關[11]。因此，本試驗通過在綿羊日糧中添加適宜水平的亞硒酸鈉，研究硒對綿羊精液品質的影響，并通過檢測精子的線粒體活性和GLUT 3、GLUT 8蛋白的表達豐度探究硒是否通過調節(jié)精子能量代謝影響精子活力。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與日糧組成

試驗在山西省太谷縣保森畜牧有限公司的養(yǎng)殖場內進行。選取24只（3±0.5）歲，體重相近（38.5±7.5）kg的成年杜泊公羊，隨機分成2組。對照組飼喂基礎日糧（對照組），試驗組飼喂基礎日糧+0.5 mg/kg亞硒酸鈉的日糧（硒處理組）?；A日糧按照NRC（1985）山羊飼養(yǎng)標準的營養(yǎng)水平設計配方，由苜蓿干草、秸稈和精飼料（玉米、豆粕等）組成，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗用羊單欄飼養(yǎng)，每日8：00與16：00各飼喂一次，自由飲水。試驗期90 d，預試期15 d，正試期75 d。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結束前兩周，使用假陰道法每周采精2次（隔2 d采精）。采集精液后用保溫箱帶回實驗室，取少量樣品檢測精子活力、精子直線運動速度（Velocity of Straight-line，VSL）、精子曲線運動速度（Velocity of Curvilinear，VCL）、精子平均運動速度（Velocity of Av?erage path，VAP）、精子質膜完整性和線粒體完整性，剩余樣品2 200 r/min離心10 min，保留沉淀用于GLUTs的豐度檢測與免疫熒光試驗。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 精子活力與運動參數

采集精液后立即進行精子品質檢測，使用預熱的磷酸鹽緩沖液（PBS）調節(jié)精子濃度至6.0×107個/mL，取精液10μL滴在預熱的載玻片上觀察，通過計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）分析精子活力與運動參數。

1.3.2 精子質膜完整性

通過低滲腫脹法（HOST）檢測精子質膜是否完整。低滲溶液由1.35 g果糖和0.735 g檸檬酸鈉加入100 mL純化水中配制而成。將精液樣品放入37℃水浴鍋中孵育3 min，吸取10μL精液加入提前預熱好的離心管中，再加入100μL預熱好的低滲溶液，水浴鍋中孵育30 min。取10μL混合液涂片，風干后于400×顯微鏡下觀察，隨機計數500個以上精子。質膜完整率（%）=質膜完整的精子/總精子數×100。

1.3.3 精子的線粒體活性檢測

線粒體活性用線粒體膜電位表示，通過JC-1與PI雙熒光染色法進行檢測。從樣品中吸取80μL精液加入提前預熱好的離心管中后，加入4μL JC-1以及2μL PI染液。避光條件下孵育30 min，然后加入總體積10%的Hancock’s solution溶液，吹打混勻后取3.5μL的混合液于載玻片上，壓片后在400×熒光顯微鏡下觀察，隨機計數500個以上精子。JC-1/PI熒光染色的結果為：尾部呈橙色熒光的精子為高線粒體膜電位精子；尾部呈綠色熒光的精子為低線粒體膜電位精子。精子線粒體活性（%）=高線粒體活性的精子/精子總數×100。

1.3.4 GLUTs的表達檢測

將對照組與硒處理組樣品用生理鹽水2 000 r/min離心清洗3次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)置于冰上裂解30 min，超聲波破碎，4℃、13 000 r/min條件下離心15 min，保留上清蛋白溶液。使用核酸蛋白儀測定蛋白濃度。采用常規(guī)Western Blot方法測定提取蛋白樣品中GLUTs的表達量水平。取保存的蛋白每管加入20μL樣品緩沖液（精子蛋白∶蛋白樣品緩沖液=4∶1），在100℃條件下變性10 min，每個樣品的總蛋白上樣量為50μg。經SDS-PAGE凝膠電泳轉至NC膜，使用5%的山羊血清室溫封閉1 h，分別加入GLUT3、GLUT8（1∶500）和β-actin（1∶10 000）一抗，4℃孵育過夜。用Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)洗膜3次，每次10 min。加入熒光二抗，避光孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min。用Odyssey?CLX雙色近紅外成像系統(tǒng)拍照。使用Image J圖像分析軟件掃描測定灰度值，重復三次。GLUTs相對豐度=GLUTs灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3.5 免疫熒光檢測GLUTs定位

取適量精液涂抹于黏附性載玻片上自然風干，4%多聚甲醛固定20 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，自然風干。樣品處滴加5%山羊血清封閉3 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加一抗（1∶150）于4℃濕盒中孵育過夜，PBS清洗3次；樣品處滴加FITC熒光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，封片并在熒光顯微鏡下觀察拍照，每張涂片隨機選取5個視野。

1.4 數據分析

試驗所得數據均以“平均值±標準誤”來表示，用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的one-way ANOVA方差分析，用LSD法進行多重比較。每個處理3個重復，差異顯著性水平為P＜0.05。用GraphPad Prism 6.0軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 日糧中添加硒對綿羊精液品質的影響（見表2）

表2 日糧中添加硒對綿羊精子活力、運動參數的影響

由表2可知，硒處理組綿羊精子的活力和活率均顯著高于對照組（P＜0.05）。經由CASA系統(tǒng)分析后，發(fā)現硒處理組精子的VSL、VCL與VAP都顯著高于對照組（P＜0.05）。表明日糧中添加硒能顯著增加綿羊精液的活力與活率，且顯著提高了精子運動速度。

2.2 日糧中添加硒對綿羊精子質膜完整性及線粒體活性的影響（見圖1）

由圖1可知，硒處理組的質膜完整性以及線粒體活性均高于對照組，且差異顯著（P＜0.05）。表明日糧中添加硒有助于提高精子的質膜完整性，也有利于增強精子線粒體的活性。

2.3 日糧中添加硒對綿羊精子GLUTs表達的影響

通過Western Blot分析對照組與硒處理組綿羊精子中GLUT3、GLUT8蛋白的相對表達豐度（見圖2），結果可知，硒處理組與對照組相比，GLUT3、GLUT8蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。

圖1 日糧中添加亞硒酸鈉對綿羊精子質膜完整性（a）及線粒體活性(b)的影響

圖2 日糧中添加硒對綿羊精子GLUTs表達的影響

2.4 綿羊精子GLUTs的定位

免疫熒光檢測結果如圖3所示，GLUT3與GLUT8兩種蛋白表達位置不同。GLUT3的陽性區(qū)域主要在精子的頭部、精子中段及尾段；GLUT8蛋白主要定位于精子頂體、頭部以及精子中段。

3 討論

圖3 綿羊精子GLUT3、GLUT8蛋白的定位

硒對動物精液品質提高的研究已經日趨完善，缺硒動物日糧中添加硒元素能提高動物的精液品質。金海峰等[5]研究發(fā)現，日糧添加硒能提高羔羊的精子活力。王海娜等[12]研究發(fā)現日糧添加有機硒，可不同程度地提高小鼠精子的質量。然而，不同種類動物中硒的添加量不同，而且由于不同地域硒水平不同，硒的添加效果差異很大。根據課題組多年的研究，初步確定了山西綿羊和山羊日糧中硒的適宜添加量[13-15]。本試驗公羊日糧中亞硒酸鈉的添加量為0.5 mg/kg。結果發(fā)現，硒處理組的公羊精子活力有了顯著提高。此外，本試驗還通過CASA系統(tǒng)分析了精子的運動參數，發(fā)現與對照組相比，硒處理組的精子的VSL、VCL與VAP都顯著提高，表明硒的添加有效地提高了精子的運動能力。硒提高動物精子運動能力的原因可能是多方面的。首先，雄性動物的精子發(fā)生主要依賴于睪酮，硒通過促進間質細胞睪酮的合成為正常的精子發(fā)生和精子運動提供適宜的內分泌環(huán)境[16]；其次，硒作為一種抗氧化劑可以提高機體和精清的抗氧化酶活性[14]，減少了氧自由基對精子線粒體和膜結構的損傷，保障精子尾部結構和功能的完整性，從而維持精子正常的結構和運動能力。而本試驗中對照組與硒處理組精子質量差異顯著，可能的原因是山西地處我國嚴重缺硒地區(qū)，飼草料中的硒嚴重不足，因此在日糧中添加硒可以增強精子品質的效果異常顯著。精子質量是評價公畜繁殖性能的重要指標，精子活力則是精子質量評估中最基本，也是最重要的指標之一，它最直觀地反映了精子的受精能力[17]，只有高活力的精子才能經由直線運動完成受精過程。雖然在公畜日糧中添加硒元素能有效提高精液品質，但需要根據該區(qū)域的硒狀況確定適宜的添硒量。

線粒體是能量代謝中最重要的細胞器，主要分布于精子的中段和尾段，它的功能是否正常直接決定了精子的活力和運動參數，尤其是精子的直線前進的能力。白修云等[18]研究表明，線粒體活性低的精子不具備受精的功能。而硒在精子中主要分布于精子頭部以及中段的線粒體膜中，可以選擇性地結合于精子尾部中段，缺硒會造成精子中段的膜結構破裂，軸絲外露，從而導致精子線粒體活性異常，造成精子的活力下降[19]；張明等[20]研究表明，低硒可降低大鼠心肌線粒體的活性,使心肌細胞損傷；高良才等[21]則發(fā)現，硒能拮抗氧自由基引起的線粒體活性異常。在本研究中，日糧中添加0.5 mg/kg的硒不但提高了線粒體的活性，而且保護了精子質膜結構的完整性，與上述研究結果一致。說明硒的添加有效地提高了線粒體的活性，還保護了精子質膜的完整性，使精子保持正常的結構功能，從而提高了精子質量，這也是硒處理組精子活力更高的原因。

GLUTs是精子能量代謝相關蛋白，主要負責糖類的攝取，其表達量高低直接影響精子從環(huán)境中攝取糖類的效率，進而影響到精子活力與線粒體活性[22-23]。本研究采用Western Blot與免疫熒光方法分別確定硒處理組與對照組GLUT3、GLUT8的表達量差異與陽性定位。結果顯示，GLUT3主要表達于精子的頭部、精子中段及尾段，且硒處理組的GLUT3蛋白表達量顯著高于對照組，這可能是由于活性氧（Reactive oxygen species，ROS）會與精子質膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，造成精子質膜受損，從而導致膜結構蛋白的重新定位與丟失，造成GLUT3的表達下降，而硒處理組提高了精子的質膜完整性，從而導致其表達量高于對照組。GLUT8蛋白的陽性區(qū)域主要存在于精子頂體、頭部以及精子中段線粒體密集部位。硒處理組的表達量顯著高于對照組，推測可能是由于GLUT8主要位于精子頂體和線粒體密集部位，隨著精子代謝產生ROS導致精子線粒體膜發(fā)生脂質過氧化反應，促使線粒體膜通透性改變，最終導致線粒體腫脹，外膜漲破，從而造成GLUT8蛋白表達下降，而對照組線粒體活性更低，也印證了這個觀點，這與Sancho等[24]的研究結果相似。在本研究中，GLUT3、GLUT8蛋白的表達量與精子的質量成正比，且都廣泛地存在于線粒體密集部位，推測可能是GLUT3、GLUT8蛋白與精子線粒體的能源供應密切相關，GLUT3、GLUT8蛋白的豐度變化可能直接導致精子細胞能量供應不足或營養(yǎng)利用能力下降，這也可能是精子活力和運動參數下降的主要原因。Gawlik等[25]發(fā)現，敲除SLC2A8的小鼠不僅精子活力下降了50%，其線粒體膜電位和精子細胞中ATP水平也表現出不同程度的降低，這也與本試驗結果一致，印證了上述可能。因此，日糧中添加硒能顯著提高GLUT3、GLUT8蛋白的表達，從而有助于增強精子細胞的能量代謝或增加精子細胞的能量供應。同時，GLUTs可能是維持精子活力的最重要的轉運體之一，并在精子細胞的能量代謝中發(fā)揮重要作用。

4 結論

日糧中添加0.5 mg/kg亞硒酸鈉可顯著提高精子線粒體活性，保護精子質膜完整性，提高Glut3、Glut8蛋白的表達量，增強精子細胞的能量代謝，從而提高精子的活力與運動參數，改善精液品質。