原花青素調控抑癌基因 p53/AMP 活化蛋白激酶通路抑制多囊卵巢綜合征大鼠顆粒細胞自噬的實驗研究

王漫麗

作者單位：洛陽市婦幼保健院產(chǎn)科一區(qū)，河南 洛陽 471000

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科臨床常見的內(nèi)分泌功能紊亂疾病，也是育齡期女性繼發(fā)不孕癥的常見病因。據(jù)統(tǒng)計，我國育齡期女性中 PCOS 的發(fā)病率約為 5%～10%，且隨著女性生活壓力的劇增呈增長趨勢，可并發(fā)不孕癥、糖尿病、高血壓、甚至是子宮內(nèi)膜癌等 ，危害甚重 。 目前臨床上常用的PCOS 療法有藥物調節(jié)內(nèi)分泌、改善胰島素抵抗等，對有強烈生育愿望者給予來曲唑或克羅米芬等促排卵，有一定作用，但臨床效果有限。既往報道顯示，卵巢顆粒細胞自噬可維持卵巢生殖功能，正常情況下卵巢細胞增殖和自噬、凋 亡處于平衡狀態(tài)，而卵巢顆粒細胞自噬異常激活可能是 PCOS 發(fā)生的重要機制。而抑癌基因 p53（p53）∕AMP 活化蛋白激酶（AMPK）信號轉導通路可參與調控卵巢顆粒細胞自噬 ，可作為 PCOS 治療藥物開發(fā)的新靶點。原花青素是一種生物類黃酮混合物，具有特殊的分子結構，可從藍莓葉、葡萄籽等中提取，屬于一種強效抗氧化劑。有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可調控惡性腫瘤細胞的自噬，還可減輕 PCOS 并動脈粥樣硬化模型大鼠的病理改變。但原花青素是否可通過調控 p53∕AMPK 通路抑制 PCOS 大鼠卵巢顆粒細胞自噬仍需深入研究，而探討該課題可為此類病人新藥的研究與開發(fā)提供方向，故于 2018年 4月至 2019年 6月開展如下動物實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只雌性 SD 大鼠，無特定病原體（SPF）級，7～9周齡，體質量范圍為 200～260 g，購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心［SCXK（豫）-20180001］，衛(wèi)生檢疫合格，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 原花青素（沈陽中科藥業(yè)有限責任公司 ，國食健字 G20041220，批 次180415A，提純后純度≥98%）；來曲唑（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號 H20084597，批次 1805116）；羧甲基纖維素（CMC）（南京道斯夫生物科技有限公司）；枸櫞酸氯米芬（廣州康和制藥有限公司，批號H44021970，批次 201804102）；睪酮檢測試劑盒、促黃體生成素（FSH）檢測試劑盒、雌二醇檢測試劑盒（均購自南京建成生物研究所）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒 、單丹磺酰尸胺（MDC）染色試劑盒 、Trizol 試劑盒、蛋白提取試劑盒（均購自法國生物梅里埃公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（購自深圳晶美生物科技有限公司）；兔抗鼠 p53、微管相關蛋白 1 輕鏈 3Ⅱ（LC3Ⅱ）、AMPK、p-AMPK 單克隆抗體、酶標記的山羊抗兔 p53、LC3 Ⅱ、AMPK、p-AMPK 多克隆抗體（均購自美國 Santa Cruz 公司）。

RT-6000 型酶標儀（購自美國 Rayto 公司）；DSZ-70PHC 型光學顯微鏡（購自日本 Carton 公司）；5084R 型臺式離心機（購自德國 Eppendorf 公司）；Cytomics ? FC 500 型流式細胞儀（購自美國 Beckman Coulter 公司）；2720 型聚合酶鏈擴增反應儀（購自美國 ABI 公司）；PowerPac Basic 型電泳儀（購自美國 Bio-Rad 公司）；EPS300 型蛋白質電泳儀（購自美國 Thermo 公司）；Trans-Blot SD 型轉膜儀（購自美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及干預 60 只成年雌性 SD 大鼠按照 1～60 自然數(shù)進行編號，以計算機生成隨機數(shù)字表，按照隨機、均等原則分為 N 組、M 組、P 組、LD 組、MD 組 和 HD組 ，每組各10只 。 除N組外均建立PCOS 模型。建模方法：來曲唑灌服，劑量為 1 mg∕kg，溶于 1% CMC 中，連續(xù) 21 d；N 組同時灌服等容積、等濃度的基質羧甲基纖維素，共 21 d。參照文獻方法驗證模型。然后 P 組給予枸櫞酸氯米芬溶液5.21 mg∕kg 灌服，LD 組、MD 組和 HD 組分別給予 25、50、100 mg∕kg 原花青素灌服，N 組和 M 組均給予等量生理鹽水灌服，均每天 1 次，連續(xù) 24 d。

1.2.2 血清性激素水平檢測 包括睪酮、FSH、雌二醇。分別于治療前后抽取尾靜脈血 5 mL，3 500 r∕min 離心 15 min 取血清，采用化學發(fā)光法（睪酮）、酶聯(lián)免疫吸附測定（FSH、雌二醇）檢測，需按照對應試劑盒說明書操作。

1.2.3 卵 巢組 織 病理 觀察 取 0.4% 戊巴比妥 0.1 mL∕kg 腹腔注射，大鼠昏迷后取 75% 乙醇對腹部皮膚常規(guī)消毒，將腹腔打開并取出新鮮的卵巢組織。中性福爾馬林浸泡固定，梯度濃度乙醇溶液脫水，包埋并切片，HE 染色試劑盒處理，封片并以光學顯微鏡放大觀察。

1.2.4 卵巢顆粒細胞自噬率檢測 將卵巢組織取出后以生理鹽水沖洗，5 min×3 遍。將脂肪組織剔除，刺破卵泡，磷酸鹽緩沖液沖洗，200 目篩過濾。離心處理，參數(shù)：800 r∕min，5 min。取沉渣，調整細胞濃度 ，至 1×10個∕毫 升 。 MDC 染色 ，濃度 0.05 mmol∕L，37 ℃溫育 60 min 并以磷酸鹽緩沖液清洗。以流式細胞儀術檢測卵巢顆粒細胞自噬率。

1.2.5 卵巢組織 p53、AMPK mRNA 表達檢測 取卵巢組織，勻漿研磨，以試劑盒提取總核糖核酸，反轉錄。配置反應體系，其中 p53 正向引物：5’-ACTGCTAGATTAGAGCTAGATCGA-3’，反向引物 ：5’-CTGCTAGATCGATATTAGCTATAGCGAT-3’；AMPK 正向引物：5’-CTCGATAGGATCGATAGATCGAAC-3’，反向引物 ：5’-CTCGATATGATCTAGTATAGATCAGA-3’；β 肌動蛋白（β -actin）：正向引物 ：5’-CTGCTCGATAGATCGATAGCTAGC-3’，反向引物：5’-CTGCTGATAGCTAGCTAGGGATTC-3’。 以 PCR 儀反應，條件：95 ℃、10 min，40 個循環(huán)：95 ℃、10 s→60 ℃、20 s→72 ℃、20 s，60 ℃、5 min。取產(chǎn)物電泳，分析并計算目的基因的表達量，即 2。

1.2.6 卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK 蛋白表達及 p-AMPK 檢測 采用蛋白質印跡法，取卵巢組織勻漿研磨，滅活并以磷酸鹽緩沖液沖洗。提取總蛋白，定量后上樣電泳，脫脂奶粉封閉，室溫下孵育 1 h。滴加一抗，4 ℃下孵育過夜；磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加二抗，37 ℃下孵育 2 h，再次以磷酸鹽緩沖液沖洗。以 DAB 顯色，以蒸餾水終止顯色反應，暗室曝光、顯影和定影。拍照掃描，計算蛋白相對表達量，即目的蛋白與內(nèi)參（β-actin）的比值。

2 結果

2.1 治療前后血清性激素水平對比

N 組、M 組、P組、LD 組、MD 組和 HD 組分別有 1 只、3 只、2 只、1只、1 只和 1 只大鼠非正常原因死亡，均剔除。各組治療前后血清睪酮、雌二醇和 FSH 對比差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.001），治療后 N 組血清性激素水平與治療前差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05），M 組血清睪酮、FSH 水平均升高，雌二醇水平下降（

P

＜0.05）；治療前后 M 組、P 組、LD 組、MD 組和 HD 組血清睪酮、FSH水平均高于 N 組，雌二醇水平均低于 N 組（

P

＜0.05）；治療后 P 組、LD 組、MD 組和 HD 組血清睪酮、FSH 水平均低于 M 組，雌二醇水平均高于 M 組（

P

＜0.05）；治療后 LD 組血清睪酮、FSH 水平均高于 P組，雌二醇水平低于 P 組（

P

＜0.05）；MD 組血清性激素水平與P 組差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）；HD 組血清睪酮、FSH 水平均低于P組 ，雌二醇水平高于P組（

P

＜0.05）；LD 組、MD 組和 HD 組血清性激素水平均呈劑量依賴性，每兩組間差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。見表1。

2.2 卵巢組織病理學變化觀察

N 組卵泡排列整齊，大小均勻，結構清晰，顆粒細胞規(guī)整，可達 8～9層，大多均可見卵丘；M 組卵泡排列嚴重紊亂，大小明顯不一，結構極度混亂，顆粒細胞紊亂且排列稀疏，細胞層僅 1～2 層，僅有極少量黃體組織；P 組卵泡排列稍顯紊亂，大小不均，結構輕微混亂，顆粒細胞排列紊亂且輕微稀疏，顆粒細胞 5～6 層，有黃體組織；LD 組卵泡排列紊亂，大小不均，結構混亂，顆粒細胞排列明顯紊亂且排列稀疏，顆粒細胞僅 3～4 層，有少量黃體組織；MD 組與 P 組相近；HD 組卵泡排列稍顯紊亂，基本均勻，少部分結構不清，顆粒細胞大多相對規(guī)整，可達 7～8 層，可見卵丘。

表1 各組大鼠治療前后血清性激素水平對比

2.3 卵巢顆粒細胞自噬率對比

N 組、M 組、P 組、LD 組、MD 組、HD組卵巢顆粒細胞自噬率分別為（7.12±0.56）% 、（18.93±3.12）% 、（11.20±1.82）% 、（13.45±2.10）% 、（11.08±1.79）% 、（9.86±1.05）%（

F

=41.368，

P

＜0.001）。與 N 組比較其余五組均升高，與M 組比較，P 組、LD 組、MD 組和 HD 組均下降，與 P 組卵巢顆粒細胞自噬率比較，LD 組升高、LD 組下降，與 LD 組比較，MD 組、HD 組卵巢顆粒細胞自噬率均下降，且 HD 組低于 MD 組（

P

＜0.05）。

2.4 卵巢組織 p53、AMPK mRNA 表達對比

各組卵巢組織 p53 mRNA 表達對比，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.001）；各組卵巢組織 AMPK mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表2。

2.5 卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK 蛋白表達及 p-AMPK 對比

各組卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ蛋白表達及 p-AMPK 對比差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.001）；各組卵巢組織 AMPK 蛋白表 達差異 無 統(tǒng)計學 意義（

P

＞0.05）。見表3、圖1。

3 討論

PCOS 常見的病因有下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常、代謝紊亂、腎上腺功能失常及遺傳等，可引起被膜纖維化增厚，導致卵巢囊性增大、影響正常排卵。目前人們對該病的具體機制認識尚淺，且臨床治療方案多缺乏特異性，而新藥研究也缺乏治療靶點，因此采用新的藥物通過已知的途徑發(fā)揮治療作用是目前重要課題。卵巢顆粒細胞自噬與卵細胞的發(fā)育、排出等生理過程均有密切關聯(lián)，細胞自噬與細胞生物學改變有密切關系。而抑制卵巢顆粒細胞自噬是當前針對 PCOS 新藥研究的熱點。

表2 各組大鼠卵巢組織 p53、AMPK mRNA 表達對比

圖1 蛋白質印跡法檢測各組大鼠卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK蛋白表達及 p-AMPK

表3 各組大鼠卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK 蛋白表達及 p-AMPK 對比

本研究中，P 組、LD 組、MD 組和 HD 組治療后血清性激素水平均顯著改善，M 組治療后血清性激素水平均顯著惡化，N 組均無明顯變化，且治療后 HD組血清性激素水平改善最理想，可知原花青素和枸櫞酸氯米芬均有助于改善 PCOS 大鼠血清性激素水平。睪酮主要由卵巢、腺外組織、腎上腺皮質轉化，在 PCOS 發(fā)病過程中，睪酮顯著升高，主要原因是卵泡雄激素濃度過高，可促進黃體細胞內(nèi)雄激素轉化為雙氫睪酮，抑制卵巢的正常發(fā)育；雌二醇主要來源是卵巢，在 PCOS 發(fā)生過程中可導致雌激素不足，抑制黃體細胞內(nèi)雄激素向雌激素的轉化，因而其水平較低；FSH 主要由垂體前葉促性腺激素細胞分泌，可刺激顆粒細胞增生和卵泡生長發(fā)育，在PCOS 中 FSH 的水平顯著升高，且對 PCOS 病情有評估作用。因此在 PCOS 治療中應積極調控血清性激素水平。原花青素是目前公認的高效自由基清除劑和天然抗氧化劑，常用于抗氧 化應激損傷治療，在 PCOS 中的作用報道尚少。結合上述分析和本研究結果，推測原花青素可調控 PCOS 大鼠血清性激素水平，且高濃度的原花青素對其調控作用明顯優(yōu)于枸櫞酸氯米芬，顯示出良好的挖掘價值。在本研究 HE 病理學變化觀察中顯示，M 組卵巢組織有嚴重的病理改變，P 組、LD 組、MD 組和 HD 組均有所減輕，且 HD 組與 N 組最為接近，提示原花青素可減輕 PCOS 大鼠卵巢組織的病理學改變，且呈劑量依賴性。因此原花青素不僅可調控 PCOS 大鼠血清性激素水平，還可減輕卵巢組織病理改變。

此外，本研究關于卵巢顆粒細胞自噬率的對比結果中顯示，N 組＜HD 組＜MD 組∕P 組＜LD 組＜M 組，表明原花青素可抑制 PCOS 大 鼠卵巢顆粒細胞自噬，且其作用呈劑量依賴性。在基因及蛋白表達檢測結果中顯示，原花青素可上調 p53 基因及蛋白表達，抑制 AMPK的磷酸化 ，控 制 LC3 I 向 LC3 Ⅱ 轉化，推 測該藥物很可能是通過上述 途徑實現(xiàn)抑制PCOS 大鼠卵巢顆粒細胞自噬的。成熟卵泡的顆粒細胞是卵泡最重要的單元，顆粒細胞增殖、分化在卵泡發(fā)育過程中均有參與，且可促進卵母細胞的發(fā)育與成熟。顆粒細胞是否凋亡可直接影響卵母細胞的發(fā)育潛能，而自噬與凋亡關系密切，有研究表明自噬是凋亡的引導機制，而 LC3 I 向 LC3 Ⅱ轉化是卵巢顆粒細胞發(fā)生自噬的重要表現(xiàn)。 p53∕AMPK 信號通路在自噬過程中也有調控作用，其中p53 基因與蛋白可負性調節(jié)細胞自噬，還可通過轉錄依賴性途徑增加 AMPK 蛋白的磷酸化水平進而促進細胞自噬。研究顯示，卵巢顆粒細胞自噬過程中，p53∕AMPK 通路不僅可參與直接調控，還可調控 LC3 I 向 LC3 Ⅱ的轉化間接影響細胞自噬。根據(jù)本研究結果和上述分析，推測原花青素可通過調控 p53∕AMPK 通路，上調 p53.基因及蛋白表達，抑制AMPK 的磷酸化，控制 LC3 I 向 LC3 Ⅱ轉化進而抑制卵巢顆粒顆粒細胞自噬的。

綜上所述，在 PCOS 大鼠中給予原花青素灌服可改善血清性激素水平，減輕卵巢病理改變，抑制卵巢顆粒細胞自噬，且呈劑量依賴性，中劑量原花青素的效果與枸櫞酸氯米芬均相近，而高劑量原花青素的效果均最佳，推測很可能與調控 p53∕AMPK通路，上調 p53 基因及蛋白表達，抑制 AMPK 的磷酸化，控制 LC3 I 向 LC3 Ⅱ轉化有關。但其具體作用機制及在臨床治療中應用的可行性仍需要進一步探討，可作為進一步的研究方向。