兩性離子多肽改善GLP-1生物活性的粗粒化分子模擬

滕家曼， 劉玉婷， 朱國梁， 諶莊琳， 陳彥濤

（深圳大學化學與環(huán)境工程學院，深圳市環(huán)境化學與生態(tài)修復重點實驗室，廣東 深圳 518071）

蛋白藥物具有生物活性高、特異性強及毒副作用小等優(yōu)點，但在臨床應用過程中也遇到了一系列問題[1]。比如蛋白藥物通常熱穩(wěn)定性差，需要同時面對腎臟過濾及蛋白酶解作用，導致藥代動力學嚴重低于預期。作為一種提升蛋白藥物體內半衰期的修飾方法，利用共價鍵在蛋白質表面綴合高分子長鏈，有效推動了醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展[2]。蛋白質-聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)物是目前最成功的偶聯(lián)物形式，其PEG長鏈以無規(guī)線團的形式把目標蛋白包覆、保護起來，將其體內循環(huán)半衰期成功延長10～100倍[3]。目前已有十幾種蛋白-PEG偶聯(lián)物作為長效藥物獲得了上市批準，被應用于糖尿病、肝炎等重大惡疾的臨床治療[4]。然而，PEG自身不可生物降解，易在腎臟中聚集，長期給藥易導致免疫應答甚至較高的肝臟脂肪含量[5]。利用化學或生物手段，尋找具有低免疫原性、可生物降解的PEG替代物是目前該領域亟待解決的難點[6,7]。

作為一種潛在的PEG替代物，兩性離子多肽（ZIPP）近年來獲得了極大關注。ZIPP保持了多肽鏈的先天優(yōu)勢，如可生物降解、可序列設計等。另一方面，與兩性離子聚合物類似[8]，ZIPP在序列中含有等物質的量之比的陽離子殘基（如賴氨酸）和陰離子殘基（如谷氨酸），空間上近鄰的正負電荷賦予ZIPP優(yōu)良的親水性、抗吸附特性及“隱身”能力，有效延長了在血漿中的停留時間[9]。Jiang課題組首先揭示了以賴氨酸和谷氨酸為重復單元的聚多肽poly（KE）有著最強的抗吸附能力[10]；poly（KE）與內酰胺酶形成偶聯(lián)物后，環(huán)境耐受性及催化活性都得到大幅度提高[11,12]。2019年，Chilkoti課題組[13]利用類彈性蛋白聚多肽（ELP）修飾胰高血糖素樣肽GLP-1后，體內半衰期延長了71倍；對ELP序列進行突變，獲得兩性離子多肽ZIPP，其偶聯(lián)物生物活性再次提高1.7倍，體內半衰期由5～6 h延長到12 h[13]?，F(xiàn)有的偶聯(lián)物構效關系認為[3]，長鏈高分子具有無規(guī)線團構象，其把目標蛋白包覆起來后，有效避免了腎臟清除和酶解作用，但也阻礙了目標蛋白與其受體的有效結合。Chilkoti課題組[13]的實驗研究說明，在相同分子量或類似空間尺寸情況下，兩性離子特性也能夠提高偶聯(lián)物藥效動力學特性。受限于儀器分辨率，相關實驗研究仍然停留在宏觀或介觀層面，尚不能在分子層面上給出結構與功能的關系。

本文借助于分子模擬手段，以GLP-1蛋白為研究對象，試圖在微觀層面揭示出兩性離子多肽與GLP-1蛋白的相互作用模式，探究ZIPP與普通多肽（如ELP）在物理化學性質上的差異。一般來說，蛋白偶聯(lián)物的藥代動力學行為受到多重因素的影響，如高分子鏈的鏈長、序列差異及接枝位點等。已有模擬研究中，乙二醇寡聚物，而非長鏈高分子，被成功用來探究PEG與目標蛋白的相互作用模式[14,15]，這有效避免了其他因素對研究對象的干擾?？紤]到兩性離子長鏈多肽也呈無規(guī)線團狀構象[13]，本文采取了類似的策略，利用五肽與GLP-1蛋白的混合體系，試圖研究ZIPP五肽與GLP-1的相互作用模式。研究結果顯示，3種五肽都能夠有效穩(wěn)定GLP-1蛋白的螺旋構象；尤其是含有賴氨酸和谷氨酸的ZIPP五肽，其適當?shù)氖杷院挽o電相互作用，既能夠有效保護GLP-1蛋白，也不易被其他物質識別而表現(xiàn)出“隱身”特性。

1 模型及方法

1.1 序列及結構信息

本文研究對象GLP-1及五肽的序列信息參考了Chilkoti課題組[13]的相關實驗研究。GLP-1的氨基酸序列為AAHGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGAG，是內源性GLP-1的突變體，在體內有著更高的穩(wěn)定性。3種五肽序列為：VPGAG、VPKEG和VPREG，文中分別簡寫為GA-pep、KE-pep和RE-pep。其中，GA-pep可以認為是類彈性蛋白多肽（ELP）的充分單元，而KE-pep和RE-pep是兩性離子多肽（ZIPP）。

研究對象GLP-1及五肽的初始結構由Chimera軟件[16]生成。GLP-1被設置為α-螺旋結構，肽平面二面角夾角分別為：Φ= 57°,Ψ= 47°；3種五肽被設置為β-片層結構，肽平面二面角夾角分別為：Φ= 139°,Ψ= 135°。為避免鏈末端的電荷影響，五肽N端和C端分別被乙?；王０坊舛恕?/p>

本文以GLP-1與五肽的混合體系為主要研究對象，分別稱為GLP@GA、GLP@KE、GLP@RE。體系中GLP-1的濃度為7.9 mol/L，GLP-1與五肽的物質的量之比為1∶40。作為對照組，本文也對不含五肽的GLP-1水溶液進行了模擬，該體系簡稱為GLP@WAT。

1.2 粗?；?/h3>

考慮到GLP-1與五肽的混合物體系較為龐大，本文使用粗?；鯬ACE（ver 1.3）[17,18]加速模擬進程。PACE力場由吳云東院士及韓偉教授主導開發(fā)，其忽略了蛋白質中的非極性氫，但是保留了蛋白質的大部分原子細節(jié)，同時對水分子進行了粗?；幚?。其勢能函數(shù)（E）表示如下：

式中的能量項既考慮了殘基間的近程相互作用（Ebond表 示與鍵長有關的能量，Eangle表示與鍵角有關的能量，Edihedral和Eimproper表示與二面角有關的能量，E?,ψ,χ1表示與旋轉偏差有關的能量）；同時也包含了殘基間遠程相互作用，如Epolar表 示的極性庫侖相互作用和Enon?polar表 示的非極性范德華相互作用；此外，還囊括了ECGW?CGW表示的粗?；肿樱–GW）之間的非共價相互作用，以及ECGW?UA表示的水與殘基之間的非共價相互作用。到目前為止，PACE粗?；Ｐ鸵驯怀晒糜趯Φ鞍踪|折疊、多肽自組裝、蛋白-多肽相互作用的研究[19]。

1.3 分子模擬流程

本工作的所有模擬都基于GROMACS軟件包（ver 2018.1）[20]來進行。在210 nm3的立方盒子內，先把GLP-1蛋白放置于中央，將40條五肽隨機插入到盒子內，繼續(xù)加入鈉離子和氯離子使得體系整體呈電中性，并設置NaCl最終濃度為0.1 mol/L。盒子中充滿水分子，且所有原子的運動符合周期性邊界條件。

正式的分子模擬可分為3個階段：能量最小化、熱力學弛豫及成品模擬。在能量最小化階段，利用最速下降法對模擬體系進行5000步的能量優(yōu)化。在熱力學弛豫階段，將模擬體系溫度從100 K緩慢升到310 K，模擬步長設置為2 fs，該過程持續(xù)500 ps，并對蛋白質進行位置限制，力常數(shù)設置為1000 kJ/nm，且體系體積保持不變。在成品模擬階段，將體系放置在恒溫恒壓系綜中進行模擬，系統(tǒng)溫度和壓力分別保持在310 K和0.1 MPa，模擬步長為5 fs，該過程持續(xù)1000 ns。

在模擬運行過程中，每10步更新一次近鄰列表，短程近鄰列表的閾值為1.2 nm。非鍵范德華相互作用及長程靜電相互作用的閾值為1.2 nm，相對介電常數(shù)設為15。利用Nose-Hoover方法及Parrinello-Rahman方法維持體系的溫度和壓力在設定值，耦合時間常數(shù)分別為1.0 ps和2.0 ps。

本研究中的4個模擬體系各進行了2次分子動力學模擬，總模擬時間超過8000 ns。

1.4 數(shù)據(jù)分析

成品模擬的最后200 ns的模擬被用來開展數(shù)據(jù)分析。利用VMD軟件[21]的Timeline模塊獲得蛋白質二級結構的時間演化趨勢；利用GROMACS的聚類函數(shù)獲取模擬體系的典型構象，進一步使用PyMol軟件[22]對構象進行渲染；利用GROMACS軟件自帶的分析模塊獲取體系的徑向分布函數(shù)（RDF）、原子接觸（Atomic contact）、GLP-1蛋白的位置漲落（RMSF）、均方位移（MSD）及末端距（Distance）。GLP-1蛋白的末端距定義為N端α碳與C端α碳之間的距離。參考文獻[19]，當氨基N原子與羰基O原子之間距離小于0.32 nm時，定義為發(fā)生靜電相互作用；當殘基原子與水原子之間的距離小于0.5 nm時，定義為發(fā)生了原子接觸。

2 結果與討論

2.1 GLP-1蛋白的二級結構演化情況

已有研究顯示，游離態(tài)的GLP-1蛋白不具有穩(wěn)定的二級結構[23]；而GLP-1蛋白與受體結合后，以長螺旋的形式存在[24]。在五肽存在的情況下，GLP-1蛋白空間構象如何變化，至今未有相關的實驗研究。本研究中，GLP-1蛋白和五肽的初始構象分別被設定為α-螺旋和β-片層結構。由圖1（a）可知，模擬開始后，游離GLP-1的構象變得非常不穩(wěn)定，初始螺旋結構被分子熱運行迅速破壞。由圖1（b, c, d）可知，體系中引入40條五肽后，GLP-1蛋白的螺旋結構得以穩(wěn)定；尤其在GLP@RE體系中，除2個末端外，GLP-1整體呈現(xiàn)長螺旋結構。

圖1 各模擬體系中GLP-1蛋白的二級結構隨時間的變化情況Fig. 1 Time evaluation of the secondary structures for GLP-1 protein in different simulated systems

為定量觀察體系的演化情況，本研究統(tǒng)計了混合體系中五肽與水的接觸數(shù)。如圖2（a）所示，接觸數(shù)在前100 ns內快速下降，這說明五肽分子能夠在短時間內調整空間分布。五肽與GLP-1的接觸數(shù)（見圖2（b））呈現(xiàn)出較大的漲落，但250 ns以后圍繞平均值周期性變動，說明整個模擬體系基本到達熱力學平衡態(tài)。在3個混合物體系中，GA-pep與水形成了最少的接觸數(shù)，這說明GA-pep具有較強的疏水性，形成了較為致密的聚集體，同時與GLP-1蛋白形成了最多的接觸數(shù)。KE-pep和RE-pep等兩性離子多肽具有一定的親水性，形成了的聚集體較為疏松；相較而言，KE-pep形成的聚集體最為疏松，與GLP-1蛋白形成了最少的接觸數(shù)。

圖2 各模擬體系中五肽的原子接觸數(shù)（Atomic contact）隨時間的變化情況：（a）五肽與水溶劑的接觸數(shù)；（b）五肽與GLP-1蛋白的接觸數(shù)Fig. 2 Time evaluation of the atomic contacts for pentapeptides with （a） water and （b） GLP-1 protein in different simulated systems

2.2 GLP-1蛋白在室溫下的典型構象

模擬體系進入平衡態(tài)后，本研究進一步統(tǒng)計了GLP-1蛋白的末端距及二級結構分布。如圖3所示，游離GLP-1蛋白的螺旋比例僅為30.8%，其末端距也最小（0.67 nm）；在得到五肽保護后，其螺旋比例則明顯提高。相比GA-pep，ZIPP更有利于GLP-1形成螺旋構象；特別是在GLP@KE體系中，螺旋比例增加到60.4%，近乎是GLP@WAT體系的2倍。圖4給出了GLP-1在不同體系中的典型構象。游離GLP-1蛋白的整體構象呈現(xiàn)為無規(guī)線團，N端與C端相互靠攏，呈閉環(huán)狀，并形成少量β-片（見圖1（a））。引入五肽后，GLP-1蛋白的兩個末端被迫分開，增強了形成螺旋的概率；尤其是在GLP@RE體系中，GLP-1形成了單根長螺旋。而在GLP@GA和GLP@KE體系中，GLP-1蛋白形成了多個短螺旋。

圖3 熱力學平衡后，各模擬體系中GLP-1蛋白的（a）二級結構分布及（b）末端距Fig. 3 （a） Distribution of secondary structures and （b） end-to-end distance of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

圖4 熱力學平衡后，各模擬體系中GLP-1蛋白的典型構象Fig. 4 Typical conformation of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

綜合圖1及圖3，GLP-1蛋白N端片段傾向于形成線團（coil）或轉折（turn）等結構，而多肽片段Asp15-Val33是否形成螺旋則依賴于微環(huán)境。相關實驗也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律，如Thornton等[25]發(fā)現(xiàn)十二烷基磷膽堿（DPC）膠束有助于GLP-1形成含有兩個螺旋片段的構象，而Chang等[26]發(fā)現(xiàn)三氟乙醇水溶液有助于GLP-1形成單個長螺旋構象。

2.3 五肽在GLP-1蛋白周圍的分布情況

本研究利用徑向分布函數(shù)（g（r））探討了五肽在GLP-1蛋白周圍的分布情況（圖5（a））。GA-pep在形成致密聚集體的同時，也傾向于緊緊包圍在GLP-1蛋白表面，因而在r= 0.5 nm附近呈現(xiàn)最高峰；KE-pep傾向于分散在水溶液中，從而遠離GLP-1蛋白表面。圖5（b）顯示，五肽主要與GLP-1的10-12位殘基和C端螺旋發(fā)生接觸，而很少能接觸到GLP-1蛋白的中間序列部分，這也說明五肽聚集體并沒有完全把GLP-1蛋白包埋。

圖6（a～c）給出了3個混合體系的模擬快照（snapshot），更直觀地顯示出五肽在GLP-1蛋白周圍的分布情況。GA-pep形成了較為致密的聚集體，只對GLP-1蛋白的兩個末端形成了局部包覆，混合體系整體呈現(xiàn)左右結構；KE-pep形成的聚集體非常疏松，均勻分布在GLP-1蛋白周圍，但是只與兩個末端形成原子接觸，混合體系整體呈現(xiàn)核殼結構；RE-pep聚集體介乎其間，更接近GA-pep情形，只與GLP-1蛋白兩個末端形成原子接觸。本研究還對五肽分子單獨存在的溶液體系進行了粗?；M。經(jīng)過500 ns的熱力學松弛，3種五肽分子在水溶液中呈現(xiàn)出了不同的聚集狀態(tài)，如圖6（e～f）所示。與混合體系模擬結果，可見3種五肽分子的不同聚集行為與是否引入GLP-1蛋白無關；換言之，五肽分子的內在特性決定了五肽與目標蛋白之間的相互作用模式。

圖5 （a）五肽在GLP-1周圍的徑向分布情況；（b）GLP-1各個殘基與多肽的原子接觸情況Fig. 5 （a） Radial distribution functions （RDF） of around GLP-1; （b） Atomic contacts with pentapeptides for each residue of GLP-1

圖6 各模擬體系中多肽在GLP-1蛋白周圍的典型分布Fig. 6 Typical distribution of pentapeptides around GLP-1 protein in different simulated systems

2.4 五肽包埋GLP-1蛋白的驅動力分析

為繼續(xù)探究五肽形成聚集體及包覆GLP-1蛋白的驅動力，本文統(tǒng)計了混合體系內的靜電相互作用情況。由圖7可見，KE-pep與GLP-1蛋白形成了最少的靜電作用，同時KE-pep聚集體內部也形成最少的靜電作用，這充分說明KE-pep具有最高的親水性，傾向于均勻分散在水溶液中。RE-pep聚集體內部形成了最多的靜電作用，但與GLP-1的靜電作用稍微低于GLP@GA體系，這體現(xiàn)了驅動力的差異：RE-pep以靜電作用作為形成聚集體的主要驅動力，而GA-pep同時利用靜電及疏水作用形成致密聚集體，并以此與GLP-1形成最多的原子接觸。相比游離GLP-1蛋白，與五肽混合后，其兩個末端被迫分開，內部靜電作用稍有減少。

為了探究五肽中各殘基對驅動力的貢獻，本文進一步統(tǒng)計了各殘基與GLP-1的原子接觸數(shù)。如圖8所示，GA-pep中Gly3和Ala4與GLP-1形成了最多的接觸，而Val1和Pro2與GLP-1形成了最少的接觸，這說明疏水性強的Val1和Pro2相互靠攏，驅動GA-pep形成致密聚集體；其C端朝外，與GLP-1蛋白形成接觸。相比KE-pep，RE-pep的Val1和Arg3與GLP-1蛋白形成了最多的接觸，且明顯高于KE-pep對應的殘基；這說明，RE-pep的Arg3不但有利于自身形成聚集體，也促進了其與GLP-1蛋白形成局部包覆。

圖7 各模擬體系中靜電相互作用情況Fig. 7 The electrostatic interactions among GLP-1 protein and pentapeptides in different simulated systems

相較GA-pep，兩性離子多肽KE-pep和RE-pep都顯示了親水性。本文統(tǒng)計了水分子在ZIPP關鍵殘基周圍的徑向分布函數(shù)。如圖9所示，Glu4側基氧原子周圍的水分子密度基本相似，但Lys3側基氮原子周圍的水分子密度明顯高于Arg3。這表明KEpep喜歡分散在水環(huán)境中，而富含精氨酸的RE-pep更喜歡與其他殘基形成靜電作用。

圖8 各模擬體系中五肽各殘基與GLP-1蛋白的原子接觸數(shù)Fig. 8 Atomic contacts with GLP-1 for each residue of pentapeptide

2.5 GLP-1蛋白的動力學性質

本研究使用兩個序參量刻畫GLP-1蛋白的動力學性質。圖10顯示，各殘基在其位置附近的漲落明顯受到了五肽的影響。引入五肽后，GLP-1蛋白序列的中間部分形成了螺旋結構，其位置漲落受到抑制；但其N末端相關殘基的位置漲落變動更強烈，尤其是GLP@GA體系，這表明GA-pep聚集體與GLP-1蛋白N端的相互作用稍弱。

圖9 水分子在兩性離子多肽特定殘基周圍的徑向分布：（a）賴氨酸及精氨酸側基N原子周圍的水分子分布；（b）谷氨酸側基O原子周圍的水分子分布Fig. 9 Radial distribution of water molecules around some specific residues of zwitterionic pentapeptides: （a） The distribution of water molecules around N atoms of the side groups of LYS and ARG; （b） The distribution of water molecules around the O atom of the side groups of GLU

圖10 各模擬體系中GLP-1蛋白的動力學性質：（a）各殘基的根均方（RMSF）漲落情況；（b）GLP-1均方位移（MSD）隨時間變化情況Fig. 10 Kinetic properties of GLP-1 protein in different simulated systems: （a） The root-mean-squared fluctuation （RMSF） of each residue；（b） The mean-squared displacement （MSD） of GLP-1 as functions time

水溶液中，GLP-1蛋白與五肽混合后，其擴散能力也必然受到影響。圖10計算了不同模擬體系中GLP-1蛋白的均方位移?；趷垡蛩固箶U散理論，游離GLP-1的擴散系數(shù)為0.13 nm2/ns，與GA-pep、KE-pep或REpep混合后，其擴散系數(shù)分別降低至0.036 s、0.047 s、0.014 nm2/ns?？梢娢咫木奂w明顯阻礙了GLP-1在溶液中的擴散，尤其是RE-pep，其聚集體密度低于GA-pep，但最強烈地影響了GLP-1的擴散能力；相比而言，由KE-pep組成的松散外殼對GLP-1的擴散阻力最小。

3 結 論

（1）游離GLP-1的兩末端相互靠近，形成環(huán)狀構象，螺旋比例僅為30%；而與五肽混合后，GLP-1兩末端傾向于與五肽形成相互作用，中間片段形成較為規(guī)整的螺旋結構。

（2）兩性離子五肽VPKEG具有較高的親水性，傾向于均勻分散在水溶液中，在GLP-1周圍形成疏松的保護層。兩性離子五肽VPREG以靜電作用為主，傾向于相互靠攏形成聚集體，也穩(wěn)定了GLP-1的長螺旋結構。對照組VPGAG具有較高的疏水性，傾向于形成致密的聚集體，雖然與GLP-1形成了最多的原子接觸，但未能充分包埋GLP-1并提供足夠的保護。

（3）賴氨酸、谷氨酸組合讓兩性離子五肽VPKEG具備了恰當?shù)挠H疏水性和靜電作用，既能維持GLP-1螺旋構象，也避免了被免疫蛋白識別，賦予其“隱身”特性。