含二硒聚碳酸酯自組裝膠束的制備及其性能

馬曉寧， 周 沉， 郎美東

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200237）

聚碳酸酯由于其生物相容性、低毒性和可生物降解性在生物材料中應(yīng)用廣泛[1,2]。通過將含有不同官能團(tuán)單體的碳酸酯聚合，可以得到滿足不同需求的各種功能化聚碳酸酯[3]。為了獲得刺激響應(yīng)型聚碳酸酯，許多刺激響應(yīng)基團(tuán)，如pH[4]、溫度[5]、光[6,7]、電子[8]、氧化還原響應(yīng)等[9,10]被引入到聚合物鏈中。

硒元素（Se）最早發(fā)現(xiàn)于1817年[1]，是14種機(jī)體必需的微量元素之一。硒的化學(xué)活性和物理性質(zhì)類似于同族的硫和碲[2]，但與同族的硫族元素（S）相比，硒元素原子半徑更大、電負(fù)性更低。二硒醚鍵是一種低結(jié)合能（172 kJ/mol）的動態(tài)化學(xué)鍵，在外界刺激下會發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)或斷裂。含二硒醚的聚合物因其在溫和的氧化還原、光照和輻照下的特異性刺激響應(yīng)性而在納米技術(shù)和生物化學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[11,12]，將二硒的響應(yīng)氧化-還原特性與可降解聚合物相結(jié)合，通過控制二硒鍵的含量調(diào)整材料的刺激響應(yīng)能力，可開發(fā)新的刺激響應(yīng)材料。含二硒的生物聚合物材料由于缺乏有效的合成策略，一直發(fā)展緩慢[13]，直到2010年，Xu等[14,15]報告了一種含有二硒醚的聚氨酯及其在藥物載體上的應(yīng)用，隨后Ma等[16]也報道了二硒嵌段共聚物在溫和還原條件下的反應(yīng)。目前大多數(shù)硒聚合物是通過逐步聚合和自由基聚合的方法合成的，逐步聚合反應(yīng)可控性較差，得到的硒聚合物往往呈寬分子量分布，若硒或二硒鍵不存在于聚合物重復(fù)單元內(nèi)則硒含量難以提高；而自由基聚合以引發(fā)劑或偶聯(lián)劑的方式將硒引入聚合物鏈，且硒多以單硒鍵形式存在，因而難以調(diào)節(jié)硒含量，并且限制了以二硒鍵形式發(fā)揮化學(xué)特性的可能，所用單體多為乙烯基類，在單體的選擇上也受很大的限制。開環(huán)聚合（ROP）合成的聚合物通常結(jié)構(gòu)清晰、相對分子質(zhì)量可控、分散性低，通過調(diào)節(jié)單體能夠控制硒含量，可以克服自由基聚合和逐步聚合的弱點(diǎn)[17,18]，為合成二硒醚聚合物提供了一種可靠的策略。

本文利用實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的可用于ROP的含硒環(huán)狀碳酸酯單體，與普通碳酸酯單體進(jìn)行“一鍋法”投料，通過調(diào)整配比進(jìn)行聚合，得到了分子量適宜、分子量分布窄、硒含量可調(diào)、結(jié)構(gòu)明確的兩親性功能化含二硒聚碳酸酯（mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC））。使用透析法、薄膜分散法、超聲乳化法制備了含二硒聚碳酸酯的膠束，從粒徑及粒徑分布和藥物包載等方面考察這3種膠束制備方法的優(yōu)劣，并通過藥物釋放實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了含二硒聚碳酸酯膠束的刺激響應(yīng)性釋藥能力。這些研究為含二硒聚合物的合成以及膠束制備的方法累積了經(jīng)驗(yàn)，也為其后續(xù)作為藥物載體的研發(fā)奠定了扎實(shí)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

溴乙醇、硼氫化鈉（NaBH4）、硒粉、四氫呋喃（THF）、二氯甲烷、氘代二氯甲烷（CDCl3）、碳酸二苯酯、三亞甲基碳酸酯（TMC）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、芘、谷胱甘肽（GSH）、5-氟尿嘧啶（5-FU，w=99%）：分析純，上海泰坦科技有限公司；聚乙二醇單甲醚（mPEG）：Mn=2 000，Sigma Aldrich；甲苯（鈉回流蒸餾干燥后使用）和乙醚：分析純，國藥試劑有限公司；脂肪酶（Lipase CA）：Novozym435，南京誠納化工有限公司，真空干燥48 h。

1.2 測試與表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）：德國Bruker AV400，氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)；凝膠滲透色譜（GPC）：美國Varian PL-GPC 50 Plus，流動相為含0.01 mol/L溴化鋰的N,N-二甲基甲酰胺，檢測器溫度35 ℃，流速1 mL/min，標(biāo)樣為聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀：美國Thermo Scientific Nicolet is50，溴化鉀壓片法制樣，波長范圍400～4 000 cm?1；動態(tài)光散射（DLS）儀：英國Malvern ZEN 3700，測試溫度25 ℃，波長設(shè)定633 nm；透射電子顯微鏡（TEM）：日本JEM 1400；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立S4800；熒光分光光度計(jì)：美國 Perkin Elmer LS-55 Lumine；紫外分光光度計(jì)：上海精科UV-Vis 765，測試溫度25 ℃，測定5-FU的吸光度，建立樣品濃度與吸光度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得樣品的吸光度換算藥品濃度，波長為0～600 nm，測得5-FU的DMF溶液吸收波長為275 nm。載藥量（DL）和包封率（EE）按式（1）、（2）進(jìn)行計(jì)算。

其中：m0為聚合物載體的質(zhì)量；m1為包載藥物的質(zhì)量；m2為投入藥物的總質(zhì)量。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的合成含二硒聚碳酸酯的合成路線如圖1所示。將2.0 g硼氫化鈉溶解于100 mL水中，加入4.0 g硒粉充分溶解后加熱至80 ℃反應(yīng)2 h，將6.3 g溴乙醇溶解于80 mL THF后加入到體系中，50 ℃下反應(yīng)6 h后，所得溶液用二氯甲烷萃取有機(jī)相，通過柱層析法提純后得到2,2′-二硒二乙醇。取合成的2,2′-二硒二乙醇1.7 g、碳酸二苯酯1.5 g及脂肪酶1.1 g于500 mL反應(yīng)瓶中，加入400 mL新鮮無水甲苯于70 ℃下反應(yīng)12 h后過濾除去脂肪酶，旋蒸除甲苯溶劑，所得固體產(chǎn)物通過柱層析法提純得到大環(huán)二硒乙醇碳酸酯單體MSeSe。將10 mL反應(yīng)瓶抽烤3次后，在氬氣保護(hù)下加入mPEG 20 mg，MSeSe單體27.5 mg和TMC 61.2 mg，加入脂肪酶8.9 mg催化反應(yīng)，以2 mL新鮮無水甲苯為溶劑，70 ℃反應(yīng)24 h后過濾除去酶，由二氯甲烷稀釋并在乙醚中沉降獲得共聚物。不同嵌段組分共聚物的合成通過改變mPEG、MSeSe和TMC的投料摩爾比來調(diào)整。

mPEG用量為1 mol，投料比n (MSeSe)∶n(TMC)=1∶55、3∶44、5∶33的聚合物分別記作P1、P2、P3。

圖1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的合成路徑Fig. 1 Synthesis routine of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

1.3.2 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）膠束的制備（1） 透析法：稱取聚合物25.5 mg和適量5-FU充分溶解于2.5 mL DMF中，將溶液緩慢滴入15 mL蒸餾水中，在800 r/min下攪拌3 h使有機(jī)相充分分散于水相，然后轉(zhuǎn)移入截留分子量3 500的透析膜中以去離子水為外液相進(jìn)行透析[19]。定時更換外液相的水，更換次數(shù)不少于6次，每次間隔時間不低于6 h。透析完成后收集全部內(nèi)液相并定容，得到mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的5-FU載藥膠束?？瞻啄z束不加藥物以同樣方法制得。

（2） 薄膜分散法：稱取聚合物 25.5 mg溶解于2.5 mL二氯甲烷中，充分溶解后裝進(jìn)圓底瓶，中速旋蒸使有機(jī)溶劑二氯甲烷完全揮發(fā)，聚合物在燒瓶底均勻鋪開形成聚合物薄膜。加入蒸餾水25 mL，在 50 ℃水浴中速攪拌5 h使聚合物薄膜充分分散到水相中[20]，形成的水溶液質(zhì)地均勻并散發(fā)標(biāo)志性藍(lán)光，定容后得mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的空白膠束。

（3） 超聲乳化法：稱取聚合物 25.5 mg溶解于2.5 mL二氯甲烷中，充分溶解后加入20 mL蒸餾水，將超聲探頭置于水油分界面進(jìn)行超聲，功率250 W，每超聲60 s間歇15 s為1周期，進(jìn)行4周期。過程中適當(dāng)調(diào)整探頭位置使有機(jī)相充分被超聲分散于水相[21]。超聲后混合液從水油分界的體系變?yōu)榫坏娜橐后w系，旋蒸去除有機(jī)溶劑后體系變?yōu)樯l(fā)標(biāo)志性藍(lán)光的膠束溶液，定容后得mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的空白膠束。

1.3.3 臨界膠束濃度（CMC）的測定采用芘熒光探針法來測定CMC以判斷聚合物自組裝成膠束的能力，具體操作如下：配制濃度為6.0×10?6mol/L的芘的丙酮溶液，向每個10 mL規(guī)格的棕色容量瓶內(nèi)用移液槍加入1 mL溶液，將所有加入了溶液的棕色容量瓶置于 40 ℃烘箱中靜置過夜使丙酮完全揮發(fā)，芘留在瓶內(nèi)在底部形成薄膜。將配制好的濃度為0.1～1×10?4mg/mL的一系列空白膠束溶液分別加入到容量瓶中并定容。將裝有膠束溶液和芘的容量瓶密封好，置于恒溫振蕩箱內(nèi)在37 ℃下孵育12 h使芘充分分散并進(jìn)入膠束疏水內(nèi)核。使用熒光分光光度計(jì)測試配制好的系列膠束溶液，以熒光強(qiáng)度（I）的比值I337/I333對濃度作圖，突變點(diǎn)前后切線的交點(diǎn)對應(yīng)CMC。

1.3.4 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）@5-FU膠束的響應(yīng)性取一定量空白膠束溶液加入30 mmol/L GSH攪拌使其反應(yīng)，隔一定時間取膠束溶液測定粒徑表征形貌，反應(yīng)48 h后制樣通過透射電鏡觀察形貌。

1.3.5 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）@5-FU膠束的體外釋藥分別以pH=7.4的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、含濃度為2、10 mmol/L和30 mmol/L GSH的PBS緩沖液為外液相。取5 mL載藥膠束于截留分子量3 500的透析膜內(nèi)并封緊袋口，置于25 mL外液相中，在溫度為37 ℃、振蕩頻率為100 r/min的恒溫振蕩箱中持續(xù)48 h釋藥。每間距一定時間取出外液相3 mL并增補(bǔ)3 mL新鮮緩沖液。取出的溶液通過紫外分光光度計(jì)測定5-FU的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 共聚物的合成及表征

mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）是一種主鏈官能化的碳酸酯，它是先通過小分子與DPC的分子間成環(huán)反應(yīng)制備出大環(huán)的二硒碳酸酯單體MSeSe，再通過mPEG引發(fā)MSeSe與普通的非官能化碳酸酯TMC的開環(huán)共聚得到聚合產(chǎn)物，通過控制引發(fā)劑和兩種單體的投料比，可以在適合的分子量內(nèi)調(diào)整聚合物的官能化嵌段比例。mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的核磁共振氫譜和硒譜分別如圖2所示。由1H-NMR譜可見，PTMC鏈段在化學(xué)位移4.23和2.04處分別對應(yīng)兩種化學(xué)環(huán)境的氫出現(xiàn)了3重峰和5重峰；含硒鏈段則在4.41和3.16處出現(xiàn)了兩種氫的質(zhì)子信號峰。硒譜出現(xiàn)Se的單信號峰同樣證實(shí)了硒的化學(xué)環(huán)境[16]。

圖2 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的核磁共振譜圖Fig. 2 NMR spectra of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

通過調(diào)整投料比合成的不同官能化嵌段比例的共聚物的相對分子質(zhì)量表征如表1所示。從表中可以看出，設(shè)計(jì)的共聚物嵌段比（Designed）與實(shí)際得到的嵌段比（Composition）基本符合，表明通過控制MSeSe與TMC的投料比可以有效控制共聚物的組成與硒含量，且合成的共聚物具有1.2～1.3的窄分子量分布，共聚物相對分子質(zhì)量的均一性較好。

2.2 膠束的制備與表征

通過3種配比的mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的CMC來判斷其形成膠束的能力，結(jié)果示于圖3中，P1、P2、P3的CMC均較低，都在0.0045 mg/mL附近，這與含二硒聚碳酸酯無支鏈的直鏈結(jié)構(gòu)以及硒的強(qiáng)疏水性質(zhì)使共聚物嵌段的疏水性變強(qiáng)有關(guān)，反映了共聚物本身的性質(zhì)。

通過不同制備方法制得的共聚物膠束經(jīng)DLS測得的粒徑分布結(jié)果如圖4和表2所示。圖4（a）是透析法制備膠束的粒徑分布圖，可以看出膠束的粒徑整體上比另兩種方法更小，窄分布表明了粒徑良好的均勻性。隨著共聚物配比中硒含量的增加，膠束粒徑呈逐漸變小的趨勢，這可能與硒的強(qiáng)疏水性質(zhì)有關(guān)，疏水性越強(qiáng)，膠束內(nèi)核團(tuán)聚越緊密，粒徑越小。圖4（b）是薄膜分散法制得膠束的粒徑分布，該方法得到的粒徑小而均勻，隨著硒含量增加膠束粒徑變小，這與透析法展現(xiàn)出的規(guī)律一致，但不同配比共聚物間展現(xiàn)出了較大的粒徑差異。圖4（c）是超聲乳化法制備的膠束粒徑，粒徑更大、分布更寬，不同共聚物配比的膠束之間沒有明顯的粒徑差異和變化趨勢，制得的膠束水溶液更偏向于白色渾濁乳液狀，而透析法和薄膜分散法能夠制得散發(fā)標(biāo)志性“藍(lán)光”并有明顯丁達(dá)爾效應(yīng)的膠束溶液。這證明本文合成的含二硒聚合物不適合用超聲乳化法來制備結(jié)構(gòu)精確的膠束。

表1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的分子量表征Table 1 Molecular weight characterization of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

圖3 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）膠束的CMC測算譜圖Fig. 3 CMC spectra of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC） micelles

圖4 不同方法制備的膠束的粒徑Fig. 4 Particle size of micelles prepared from different methods

表2 DLS 測定不同方法制得膠束的粒徑數(shù)據(jù)Table 2 Particle size of micelles prepared from different methods by DLS

圖5為3種方法制備的膠束樣品的TEM照片。如圖所示，由含二硒共聚物P1制得的膠束均呈球狀形貌，粒徑為幾十至幾百納米，這與DLS測定的粒徑結(jié)果相符。值得注意的是，尺寸小于30 nm的簡單膠束是通過兩親性質(zhì)的自組裝形成的，而尺寸大于50 nm的聚合物球狀膠束被稱為“大型復(fù)合膠束”，這種膠束的形成機(jī)理目前被廣泛認(rèn)可的一種解釋為“膠束聚集體”（MMA）機(jī)制，即大的復(fù)雜膠束由小型簡單膠束進(jìn)行多步聚集而形成[22]。

圖5 P1膠束的TEM照片F(xiàn)ig. 5 TEM images of P1 micelles

表3為共聚物膠束的載藥量與包封率對比，總體來看膠束載藥量很低，這是因?yàn)?-FU是親水性藥物，而膠束內(nèi)核的碳酸酯為疏水性，藥物與核的相容性較弱，經(jīng)歷了長時間的透析后會增加5-FU的流失。3種方法中透析法制備的膠束載藥量最低，薄膜分散法最高，可見薄膜分散法制備的膠束適用于親水藥物包載。

表3 共聚物膠束的載藥量與包封率Table 3 Drug loading and encapsulate efficiency of copolymer micelles

2.3 膠束的響應(yīng)性與釋藥

圖6是聚合物膠束在不同環(huán)境下的釋藥過程。由圖可見P1、P2、P3膠束在10 mmol/L GSH條件下的藥物釋放行為，以及P2膠束在2 、10、30 mmol/L GSH條件下的藥物釋放行為。在10 mmol/L GSH中，隨著P1、P2、P3中硒含量的增加，膠束對GSH的響應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，藥物釋放量逐步增加；P2膠束在不同濃度條件下，隨著GSH濃度逐漸增加，膠束藥物釋放量逐步增加。表明了在GSH刺激條件下，膠束發(fā)生了響應(yīng)性釋藥行為，響應(yīng)性與硒含量和GSH的濃度有關(guān)。P1膠束與GSH反應(yīng)前后的膠束形貌經(jīng)TEM觀察如圖7所示。

圖6 共聚物膠束的藥物釋放行為Fig. 6 Drug release behavior of copolymer micelles

圖7 P1膠束經(jīng)GSH處理12 h前（a）后（b）的TEM照片F(xiàn)ig. 7 TEM images of P1 micelles before （a） and after （b） dealing with GSH for 12 h

3 結(jié) 論

（1）合成了含二硒聚碳酸酯，該共聚物分子量可控、分子量分布窄，可以通過控制投料比來控制共聚物中的硒含量。

（2）透析法和薄膜分散法是適合制備含二硒聚碳酸酯膠束的方法，制備的膠束粒徑在200 nm以內(nèi)，其中透析法制備的膠束粒徑小，而薄膜分散法操作簡單高效。

（3）含二硒聚碳酸酯載藥膠束能夠在GSH刺激下有效釋藥，硒含量越高響應(yīng)程度越高、谷胱甘肽濃度越高響應(yīng)程度越高。