硫酸軟骨素類可注射水凝膠體系及其凝膠化機(jī)制

王 芹， 邱鈺智， 喬韡華， 董念國(guó)， 楊亞江

（1. 華中科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，武漢 430074；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 430022）

可注射水凝膠，也常稱為原位形成的水凝膠。這類材料在室溫下和注射到體內(nèi)前為流體、注射入體內(nèi)后經(jīng)物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)原位形成親水性的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的半固體凝膠。作為一類新型生物材料，該凝膠已被廣泛用于藥物遞送[1-3]、傷口修復(fù)[4, 5]和組織工程[6, 7]等醫(yī)用領(lǐng)域，具有易操作、微創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)（通過(guò)注射進(jìn)入某些難以經(jīng)手術(shù)到達(dá)的部位）、能形成與缺損部位一致的形狀、易于包封細(xì)胞和藥物且載藥量高等優(yōu)點(diǎn)[8,9]。這類材料通常是由合成聚合物[10,11]、天然聚合物[12,13]和兩者的雜化材料[14, 15]構(gòu)成。本課題組發(fā)展了多種合成的溫敏納米凝膠類可注射水凝膠，用于腫瘤的介入栓塞治療[16,17]。天然聚合物類可注射水凝膠與合成聚合物類的相比，具有更好的生物相容性和生物可降解性，而更適宜用于組織工程等醫(yī)用領(lǐng)域[5]。目前用于構(gòu)建可注射水凝膠的天然多糖材料有殼聚糖、肝素、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、明膠和硫酸軟骨素等[5,18-20]。

以上提到的多糖類可注射水凝膠體系中的硫酸軟骨素（ChS）是一種硫酸化糖胺聚糖的異聚體，由交替的1，4-連接的N-乙酰-β-D-半乳糖胺（β-D-GalNAc）和1，3-連接的β-D-葡萄糖醛酸（β-D-GlcA）二糖單元組成。根據(jù)硫酸根在乙酰GalNAc和GlcA中取代的數(shù)目和位置的不同，ChS可分為多種類型，典型的ChS-O、ChS-A、ChS-B、ChS-C、ChS-D和ChS-E的結(jié)構(gòu)式如圖1所示[21]。作為人體內(nèi)最豐富的糖胺聚糖和軟骨及細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，ChS大量存在于皮膚、軟骨、肌腱、心臟瓣膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織中，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用，如參與軟骨和骨的形成、調(diào)控生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β[22]、促進(jìn)傷口愈合[23]、抗炎[24]、抗凝血[25]、抗氧化[26]、抗腫瘤[27]以及增強(qiáng)免疫反應(yīng)[28]等。正是基于ChS的這些生理活性，其在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其中之一就是與氨基葡萄糖聯(lián)用治療骨關(guān)節(jié)炎，另外還可用于治療視疲勞、神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛和抗炎等[29-32]。也正因?yàn)镃hS的多種生理功能，以及其優(yōu)良的水溶性和帶負(fù)電荷、結(jié)構(gòu)中存在易于修飾改性的羧基和羥基，ChS可用于構(gòu)建多種生物材料，如用于腫瘤的診斷和治療的納米藥物載體[33,34]以及組織工程支架材料等[35]，尤其是基于ChS的可注射水凝膠已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

除具有前述的多糖類可注射水凝膠的生物安全性好、可降解等優(yōu)點(diǎn)外，ChS類可注射水凝膠還可同時(shí)發(fā)揮多種生理功能和藥效，比如前述的促進(jìn)軟骨和骨的形成、加快傷口愈合、抗炎和抗凝血等，而在骨關(guān)節(jié)炎治療[36-38]、關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)[39,40]、顱骨修復(fù)[41]和髓核變性修復(fù)[42,43]等方面具有良好的應(yīng)用前景。此外也可用于生物黏合劑[44]、藥物輸送[45]和細(xì)胞治療[46]等領(lǐng)域。然而，目前尚未見(jiàn)基于ChS的可注射水凝膠研究進(jìn)展的綜述性報(bào)道。為此，本文對(duì)ChS類可注射水凝膠的前體聚合物、凝膠化機(jī)理、性能特征及其改性方法等進(jìn)行了較為全面的綜述，為構(gòu)建新的ChS類可注射水凝膠并拓展其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為發(fā)展更適于臨床轉(zhuǎn)化的ChS可注射水凝膠類功能材料提供思路。

圖1 幾種典型ChS的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[20]Fig. 1 Chemical structure of typical ChS[20]

1 硫酸軟骨素類可注射水凝膠體系及其凝膠化機(jī)制

具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是可注射水凝膠凝膠化后的基本結(jié)構(gòu)特征。這種三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)通常由前體聚合物經(jīng)物理交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)和生物交聯(lián)等形成[8,47,48]。物理交聯(lián)亦稱為非共價(jià)交聯(lián)，一般由氫鍵、疏水作用、靜電作用和主客體識(shí)別等弱相互作用形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)；化學(xué)交聯(lián)又稱共價(jià)交聯(lián)，是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成新的化學(xué)鍵而形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。這些反應(yīng)包括經(jīng)典的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)、Diels-Alder（DA）加成反應(yīng)、邁克爾加成、以及形成席夫堿、二硫鍵、硼酸酯鍵和配位鍵等[7,47,49]。生物交聯(lián)主要是酶參與的交聯(lián)反應(yīng)。硫酸軟骨素糖鏈上存在大量羧基、硫酸根和相鄰的羥基，不僅為化學(xué)改性提供了豐富的反應(yīng)位點(diǎn)，也為物理交聯(lián)和酶交聯(lián)提供了可能的活性基團(tuán)。表1列出了ChS類可注射水凝膠的前體聚合物體系、凝膠化機(jī)制、凝膠化時(shí)間和凝膠的應(yīng)用。

表1 ChS類可注射水凝膠體系、凝膠化機(jī)制、凝膠化時(shí)間和凝膠的應(yīng)用Table 1 Precursor polymers, gelation mechanism, gelation time and applications of ChS-based injectable hydrogels

上述這些ChS類可注射水凝膠的前體聚合物主要有：

（1）含ChS結(jié)構(gòu)的溫敏共聚物：將ChS與溫敏性單體或溫敏聚合物接枝共聚，得到的溫敏性共聚物在熱誘導(dǎo)下通過(guò)增強(qiáng)的鏈間疏水作用形成三維網(wǎng)絡(luò)。

（2）氧化的ChS（OChS）： ChS通過(guò)圖2（a）所示的路徑，經(jīng)強(qiáng)氧化劑如NaIO4氧化，得到含醛基的OChS，其生成的醛基與含有二氨或多氨基的聚合物或生物分子形成席夫堿而形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖2中的路線1）。

（3）羧基活化的ChS：如圖2（b）所示，利用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）反應(yīng)活化ChS的羧基，得到羧基活化的ChS（ChS-NHS），ChS-NHS可通過(guò)多種化學(xué)交聯(lián)途徑形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如：ChS-NHS上活化的羧基與己二酰肼（ADH）的氨基反應(yīng)，得到己二酰肼修飾的ChS（ChS-ADH），ChS-ADH上的氨基再和其他含醛基的物質(zhì)發(fā)生席夫堿反應(yīng)生成酰腙鍵（圖2（b）中的路線2）；ChS-NHS上活化的羧基與糠胺反應(yīng)，得到富電子的含有共軛雙烯呋喃結(jié)構(gòu)的ChS（ChS-F），與親雙烯體如含馬來(lái)酰亞胺結(jié)構(gòu)的聚合物通過(guò)DA加成反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)（圖2（b）中的路線3）；直接與含氨基的聚合物反應(yīng)形成酰胺鍵交聯(lián)的水凝膠（圖2（b）中的路線4）；另外，ChS-NHS還可與酪胺反應(yīng)，形成酪胺修飾的含酚羥基的ChS（ChS-TA），在辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和過(guò)氧化氫（H2O2）的作用下與其自身或其他酪胺修飾的聚合物反應(yīng)，在苯酚鄰位C–C和鄰位C–苯氧之間形成共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)（圖2（b）中的路線5）。

（4）甲基丙烯酸酯化的ChS（mChS）：如圖2（c）所示，ChS與甲基丙烯酸酐（圖2（c）左）或甲基丙烯酸縮水甘油酯（圖2（c）右）反應(yīng)得到甲基丙烯酸酯化的ChS（mChS或ChS-GMA），得到的mChS或ChS-GMA本身或與其他單體發(fā)生自由基共聚形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。

（5）丙烯酸修飾的ChS（ChS-acrylate）：上述ChS-ADH的氨基與丙烯酸反應(yīng)，得到含α，β-不飽和羰基的ChS-acrylate（圖2（d）），其與親電試劑發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。

可以看出，雖然氫鍵、疏水作用、靜電作用等物理交聯(lián)方式均可用來(lái)形成水凝膠，但目前報(bào)道的ChS類可注射水凝膠的物理交聯(lián)方式主要是基于溫敏型聚合物隨溫度變化疏水作用的增強(qiáng)而進(jìn)行的熱膠凝，其他物理交聯(lián)方式形成的水凝膠有待于進(jìn)一步發(fā)展。下面將從熱膠凝型、化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)（形成席夫堿、點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)包括DA加成反應(yīng)、邁克爾加成反應(yīng)和光化學(xué)交聯(lián)）型，以及生物交聯(lián)（酶催化）型的ChS類可注射水凝膠3個(gè)方面對(duì)上述前體聚合物體系的組成及其凝膠化機(jī)制進(jìn)行分述。

1.1 熱膠凝的ChS類可注射水凝膠

熱膠凝可注射水凝膠的凝膠化僅以溫度為促發(fā)因素，不需額外添加交聯(lián)試劑或特別的條件，具有安全、簡(jiǎn)便、易操作等優(yōu)點(diǎn)[65]。聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）是典型的合成類溫敏聚合物，其水溶液具有低臨界溶液溫度（LCST）特征。較高濃度的PNIPAM水溶液在LCST之上時(shí)，因其大分子鏈的異丙基間疏水作用增強(qiáng)，從而形成由疏水微區(qū)交聯(lián)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，體系發(fā)生溶膠-凝膠（sol-gel）轉(zhuǎn)變。因此，熱膠凝本質(zhì)上屬于一種物理交聯(lián)。PNIPAM均聚物的LCST在32 ℃左右，接近人體溫度。PNIPAM類共聚物的LCST與共聚單體的親疏水性和用量有關(guān)，與親水單體共聚升高，與疏水單體共聚則降低[66]。常見(jiàn)的溫敏聚合物還有兩親性嵌段聚合物如環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷組成的三嵌段共聚物以及一些生物大分子如瓊脂糖等。

已見(jiàn)報(bào)道的溫敏型ChS類可注射水凝膠主要是通過(guò)將溫敏性聚合物與ChS共聚或共混，來(lái)賦予體系溫敏特性，從而實(shí)現(xiàn)溫度誘導(dǎo)的凝膠化[36,46,50]。具體制備方法包括：ChS與溫敏PNIPAM通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)接枝共聚[46]、甲基丙烯酸酯修飾的ChS與NIPAM自由基共聚[50]、與溫敏聚合物Pluronic F127共混[36]等。其中，ChS的含量、溫敏聚合物的分子量等將影響體系的sol-gel轉(zhuǎn)變溫度、凝膠化時(shí)間、凝膠的強(qiáng)度和黏附性等。

Liu課題組[46]基于ChS的可降解性，制備了用于細(xì)胞治療的可降解溫敏型可注射水凝膠。他們首先采用可逆加成鏈轉(zhuǎn)移聚合法合成了分子量小于5.0×104（可通過(guò)腎臟排除體外）的帶羧基的PNIPAM（PNIPAMCOOH）；然后在EDC存在下，PNIPAM-COOH上的羧基與圖2（b）中路線2得到的ChS-ADH中的肼基發(fā)生縮合反應(yīng)，得到PNIPAM接枝的ChS共聚物（ChS-ADH-g-PNIPAM）（圖3）。研究表明該共聚物的LCST、凝膠化時(shí)間和降解速率與PNIPAM的分子量有關(guān)。PNIPAM的分子量越小，共聚物的LCST越低，在37 ℃下凝膠化時(shí)間越長(zhǎng)、降解越快。ChS-ADH-g-PNIPAM50、ChS-ADH-g-PNIPAM100、ChS-ADH-g-PNIPAM200的LCST分別為26.3、28.1、31.2 ℃；37 ℃下凝膠化時(shí)間分別為89、80、71 s；在透明質(zhì)酸酶作用28 d后，降解率分別為73.6%、54.7% 和 44.0%。

圖2 ChS類可注射水凝膠前體材料及相關(guān)交聯(lián)反應(yīng)：（a）基于氧化硫酸軟骨素的形成席夫堿的反應(yīng)；（b）基于EDC/NHS活化的ChS相關(guān)化學(xué)交聯(lián)，包括邁克爾加成反應(yīng)、DA反應(yīng)和酶偶聯(lián)介導(dǎo)的交聯(lián)；（c）甲基丙烯酸酯化的ChS；（d）丙烯酸改性的ChSFig. 2 Pre-polymers and relative cross-linking reactions involved in ChS-based injectable hydrogels：（a）Schiff′s base formation based on OChS；（b）Relative cross-linking chemistry based on EDC/NHS-activated ChS, including Michael addition reaction, DA reaction, and enzymatic coupling mediated cross-linking；（c）Methacrylate modified ChS；（d）Acrylic modified ChS

圖3 制備ChS-ADH-g-PNIPAM的路線圖[46]Fig. 3 Scheme of the preparation of ChS-ADH-g-PNIPAM[46]

Wiltsey等[50]基于ChS的黏附性和可降解性，以圖2（c）所示路線得到的甲基丙烯酸酯化的ChS（mChS）和NIPAM為共聚單體，采用過(guò)硫酸銨/四甲基乙二胺氧化還原體系引發(fā)自由基聚合，制備了PNIPAM-g-ChS共聚物，該材料能有效促進(jìn)髓核再生，抑制椎間盤退變。由于交聯(lián)密度較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的共聚物水分散體在室溫時(shí)為黏性流體，易于推注，在人體生理溫度（37 ℃）下形成彈性凝膠。所形成的凝膠兼具PNIPAM的溫敏性和力學(xué)強(qiáng)度，以及ChS的生物可降解性、黏附性和高保水量。研究表明，水溶性ChS的加入使共聚物的LCST稍有升高；增加ChS在共聚物中的含量，可減少形成的水凝膠在體外的水分損失；ChS的摻入還顯著提高水凝膠的黏附強(qiáng)度；在軟骨素酶ABC的存在下，ChS含量高的凝膠降解更快。另外，增加mChS中甲基丙烯酸酯取代度會(huì)增加凝膠的失水量、壓縮硬度和剪切模量。

上述這些基于PNIPAM-g-ChS的共聚物水溶液在較高溫度下，主要通過(guò)PNIPAM的疏水主鏈以及側(cè)鏈上的異丙基之間的疏水相互作用形成物理交聯(lián)點(diǎn)而凝膠化。但這些水凝膠一般在高溫下會(huì)收縮脫水，影響凝膠性能。Kim等[51]在上述疏水作用形成的物理交聯(lián)基礎(chǔ)上，引入化學(xué)交聯(lián)，形成生物相容性好、不發(fā)生熱收縮的可降解溫敏型ChS類可注射水凝膠。該凝膠體系由帶有環(huán)氧基團(tuán)的PNIPAM熱凝大分子單體（TGM）、己二酰肼改性的含有酰肼的ChS（ChS-ADH）和N-羥基丁二酰亞胺活化的ChS（ChS-NHS）大分子組成。當(dāng)溫度從室溫升高到37 ℃時(shí)，如圖4所示，3種大分子的混合溶液形成的水凝膠既具有物理交聯(lián)（疏水作用）又有化學(xué)交聯(lián)（NHS活化的羧基和TGM上的環(huán)氧基團(tuán)分別與ChS-ADH上的肼基發(fā)生反應(yīng)）。同時(shí)還研究了TGM/ChS-ADH/ChS-NHS的組成比例以及ChS-ADH中己二酰肼取代度對(duì)凝膠化時(shí)間、凝膠溶脹率和力學(xué)強(qiáng)度等的影響。結(jié)果表明，凝膠化時(shí)間隨上述因素的改變而改變，但均在10 min以內(nèi)。通過(guò)調(diào)控上述因素，可得到較高溫度下不收縮脫水、具有不同組合的壓縮模量和降解速率的可注射水凝膠。

圖4 可注射的TGM/ChS-ADH/ChS-NHS在水凝膠中的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)[51]Fig. 4 Chemical cross-linking reactions in the injectable TGM/ChS-ADH/ChS-NHS hydrogel[51]

另外，ChS還可作為一種功能材料直接與其他溫敏性可注射水凝膠進(jìn)行物理混合。例如，Pluronic F127（F127）是一種由聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷組成的嵌段共聚物，是FDA批準(zhǔn)可醫(yī)用的合成聚合物，也具有溫敏性的sol-gel相轉(zhuǎn)變特性，可用做局部藥物輸送載體[67]。其凝膠化溫度與F127的分子量和濃度有關(guān)。為減少蛋白質(zhì)類藥物在凝膠中的快速釋放，Sun課題組[36]基于蛋白質(zhì)帶正電的氨基與帶負(fù)電的羧基或硫酸根之間的靜電相互作用，在F127水溶液中物理共混少量ChS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%），所得可注射溫敏復(fù)合水凝膠用以包封骨形態(tài)發(fā)生蛋白模擬細(xì)胞外基質(zhì)，用于關(guān)節(jié)內(nèi)注射修復(fù)軟骨損傷。研究表明，ChS的加入改善了凝膠中骨形態(tài)發(fā)生蛋白的早期暴釋，實(shí)現(xiàn)了持續(xù)釋放，有助于恢復(fù)因骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨損傷。

1.2 化學(xué)交聯(lián)的ChS類可注射水凝膠

盡管上述溫敏性可注射水凝膠不需要額外的交聯(lián)劑，具有操作簡(jiǎn)單、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在物理交聯(lián)固有的力學(xué)強(qiáng)度弱的缺陷。在體內(nèi)時(shí)，在外界力的作用或生理?xiàng)l件下水凝膠可能不穩(wěn)定，由此限制了其應(yīng)用。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)和酶交聯(lián)形成的水凝膠具有較高的力學(xué)強(qiáng)度和生理穩(wěn)定性，而且這種強(qiáng)度可通過(guò)凝膠組成和交聯(lián)密度等進(jìn)行調(diào)節(jié)。但化學(xué)交聯(lián)類可注射水凝膠也存在不足：需要特定的反應(yīng)條件和交聯(lián)試劑，存在不易操作和潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)。因此大多數(shù)研究集中于可在較溫和條件下發(fā)生反應(yīng)的綠色低毒反應(yīng)體系，這些反應(yīng)包括形成席夫堿的化學(xué)交聯(lián)、點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)（經(jīng)典點(diǎn)擊反應(yīng)、DA反應(yīng)、邁克爾加成反應(yīng)）和光交聯(lián)等，現(xiàn)分述如下。

1.2.1 形成席夫堿的化學(xué)交聯(lián)氨基或酰肼基與醛基之間的形成席夫堿的反應(yīng)具有反應(yīng)迅速、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物無(wú)害、無(wú)需其他化學(xué)交聯(lián)劑等優(yōu)點(diǎn)，在制備可注射水凝膠方面應(yīng)用廣泛[68-72]。目前，可以通過(guò)兩類席夫堿反應(yīng)得到的ChS類可注射水凝膠：一是用氧化劑如NaIO4將ChS糖環(huán)上的鄰羥基氧化為二醛，得到含醛基的氧化ChS（OChS），然后醛基與聚合物或生物分子中的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)生成亞胺交聯(lián)的凝膠（圖2（a）中路線1）；二是將羧基活化的ChS與己二酰肼反應(yīng)，得到含有酰肼的ChS（ChS-ADH），再與其他含醛基的物質(zhì)生成酰腙鍵而得到化學(xué)鍵交聯(lián)的水凝膠（圖2（b）中路線2）。

殼聚糖含有豐富的氨基，可與OChS上的醛基形成席夫堿而用于制備ChS類可注射水凝膠。同時(shí)該體系中OChS上的醛基還可與體內(nèi)組織中的氨基反應(yīng)，增加ChS類水凝膠的組織黏附性，改善支架與宿主組織之間的結(jié)合力。由于殼聚糖在中性條件下水溶性較差，為解決這一問(wèn)題，Liu課題組[52]用丁二酸酐與殼聚糖上的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵，得到水溶性較好的N-琥珀?；臍ぞ厶牵⊿C）。在生理?xiàng)l件下，與用NaIO4氧化得到的含多醛基的OChS混合，兩者發(fā)生形成席夫堿的反應(yīng)（圖2（a）中路線1），得到的可注射、且有自愈合功能的水凝膠可用于包封細(xì)胞。除了醛基和氨基之間形成席夫堿外，該體系還存在物理交聯(lián)（如氫鍵和鏈纏結(jié)等）。發(fā)生反應(yīng)生成席夫堿的兩種物質(zhì)的用量比對(duì)形成水凝膠的交聯(lián)密度、凝膠化時(shí)間、含水量和力學(xué)性能等均有影響。例如當(dāng)n（OChS）/n（SC）=2/4、3/3、4/2時(shí)，相應(yīng)的凝膠化時(shí)間分別為（41±6）s、（29±4）s、（34±3）s。這些結(jié)果表明，等量的反應(yīng)物發(fā)生席夫堿反應(yīng)時(shí)凝膠化速率最快，交聯(lián)密度也最大。另外，經(jīng)席夫堿反應(yīng)形成的動(dòng)態(tài)亞胺鍵以及氫鍵等可使該水凝膠在2 h內(nèi)自愈合。該體系在大鼠皮下注射后在體內(nèi)酶的作用下可降解，是一種理想的細(xì)胞載體，可用于組織修復(fù)。

Wang課題組[39]在堿性條件下用環(huán)氧丁烷與殼聚糖反應(yīng)，得到水溶性的羥丁基殼聚糖（HBC），基于HBC與OChS間形成席夫堿的反應(yīng)，采用犧牲模具法的3D生物打印技術(shù)制備了多種結(jié)構(gòu)的HBC/OChS水凝膠，包封細(xì)胞后用于個(gè)性化的軟骨修復(fù)治療。該體系凝膠化時(shí)間隨HBC濃度的增加而縮短，例如當(dāng)ρ（OChS）=3 mg/mL時(shí)，ρ（HBC）=40 mg/mL的體系在1 min內(nèi)可完成凝膠化；而ρ(HBC)=20 mg/mL的體系則需要5 min完成凝膠化。對(duì)材料組成進(jìn)行優(yōu)化，可得到孔結(jié)構(gòu)均勻、平均孔徑為100 μm的HBC/OChS大孔水凝膠，由其包封的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的活力。

另外，F(xiàn)an等[53]用水溶性的羧甲基殼聚糖（CMC）與OChS混合，得到席夫堿交聯(lián)的CMC/OChS共價(jià)水凝膠，其可用于藥物輸送和軟骨組織工程。為防止藥物在水凝膠中暴釋，將模型藥物牛血清白蛋白包封于殼聚糖微球中，然后嵌合在CMC/OChS體系中，得到復(fù)合凝膠支架。結(jié)果表明，嵌入的包封藥物殼聚糖微球可作為填料，顯著提高CMC/OChS水凝膠支架的力學(xué)性能和生物活性，并降低凝膠的溶脹比和降解速率，減緩藥物釋放速率。

相比于圖2（a）中形成的單一C=N不飽和席夫堿，以酰肼代替氨基后與醛基形成的酰腙鍵更為穩(wěn)定。Li等[54]采用圖2（b）中路線2所示交聯(lián)方式，將含有酰肼鍵的ChS-ADH與含醛基的氧化普魯蘭（OXPL）混合，在生理?xiàng)l件下得到了酰腙鍵交聯(lián)的ChS-ADH/OXPL可注射水凝膠，以其包封細(xì)胞可用于軟骨修復(fù)。該體系凝膠化時(shí)間可通過(guò)改變兩者的質(zhì)量比和濃度來(lái)調(diào)控。結(jié)果顯示，明顯過(guò)量的氨基或醛基均會(huì)產(chǎn)生大量未反應(yīng)的殘留基團(tuán)，從而減緩凝膠化速率。另外，兩者的質(zhì)量比還會(huì)影響凝膠的平衡溶脹率、降解行為、微觀形貌和力學(xué)性能等。當(dāng)兩者質(zhì)量比為7/3時(shí)形成的水凝膠可為維持軟骨細(xì)胞表型和增強(qiáng)軟骨生成提供最佳的宿主組織模擬微環(huán)境。

1.2.2 點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)最經(jīng)典的點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry）反應(yīng)是銅鹽催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)，具有反應(yīng)迅速、立體選擇性強(qiáng)、產(chǎn)率高的特點(diǎn)。由于采用Cu+作為催化劑，因有毒重金屬的殘留，限制了其在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是可注射水凝膠領(lǐng)域。近年來(lái)，邁克爾加成反應(yīng)和DA加成化學(xué)反應(yīng)因無(wú)需加入有毒物質(zhì)也無(wú)毒副產(chǎn)物、具有好的生物安全性，而用于制備ChS類可注射醫(yī)用水凝膠。由于這兩種反應(yīng)具有“點(diǎn)擊化學(xué)”的特征，即可在溫和條件下進(jìn)行，且具有高選擇性和高產(chǎn)率特點(diǎn)，因此，很多文獻(xiàn)將它們也歸類為“點(diǎn)擊化學(xué)”范疇[73,74]。由此，本文在論述基于這兩種反應(yīng)的可注射水凝膠形成機(jī)理時(shí)，也將其歸為點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)一類。

邁克爾加成反應(yīng)是親核試劑（烯醇陰離子、―OH、―NH2和―SH等）進(jìn)攻α,β-不飽和羰基化合物的β位碳，最終形成新的C―C、C―O、C―N、C―S或C―X鍵。如圖2（d）所示，Bang等[45]為改善ChS類可注射水凝膠的細(xì)胞黏附性，將按圖2（b）中路線2制備的ChS-ADH與丙烯酸反應(yīng)，得到丙烯酸修飾的ChS（ChSacrylate），在ChS中引入α,β-不飽和羰基；并基于明膠（gelatin）在不同組織中較高的細(xì)胞黏附性，采用類似方法先后得到gelatin-ADH和三（2-羧乙基）膦功能化的明膠（gelatin-TCEP）。將ChS-acrylate和gelatin-TCEP兩者混合后，即發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，可在幾分鐘內(nèi)形成ChS-gelatin凝膠（圖5）。該凝膠溶脹率與聚合物溶液的濃度有關(guān)，具有良好的生物相容性和細(xì)胞黏附性，有望用作軟骨和骨修復(fù)材料。

圖5 可注射的ChS-gelatin水凝膠制備示意圖[45, 75]Fig. 5 Scheme of the preparation of the injectable ChS-gelatin hydrogel[45, 75]

DA加成反應(yīng)是發(fā)生在富電子二烯和缺電子二烯間的[4+2]環(huán)加成反應(yīng)，可以形成環(huán)己烯結(jié)構(gòu)。其反應(yīng)官能團(tuán)與體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)幾乎不發(fā)生反應(yīng)，且可在水溶液中自發(fā)進(jìn)行不需要任何催化劑，因此已用于制備可注射醫(yī)用水凝膠。在ChS類可注射水凝膠制備中，如圖2（b）中路線3所示，將羧基活化的ChS與糠胺反應(yīng)，引入富電子的呋喃結(jié)構(gòu)，得到呋喃接枝的ChS（ChS-F），然后與含有缺電子的雙烯化合物，如馬來(lái)酰亞胺改性的聚合物發(fā)生DA加成反應(yīng)，形成的交聯(lián)水凝膠可用作骨修復(fù)支架[41,55]。

DA反應(yīng)交聯(lián)的不足之處是凝膠化所需時(shí)間較長(zhǎng)（一般約0.5 h）。在注射入體內(nèi)后的凝膠化過(guò)程中，凝膠前體有可能進(jìn)入體液內(nèi)，帶來(lái)危險(xiǎn)。為解決這一問(wèn)題，通常是將另一種能快速凝膠化的體系與DA反應(yīng)體系聯(lián)用。這種同時(shí)采用多種交聯(lián)方式形成的水凝膠還有望具有可調(diào)節(jié)的力學(xué)強(qiáng)度、溶脹率和降解行為，而這些特性對(duì)于骨修復(fù)支架材料的體內(nèi)修復(fù)效果至關(guān)重要。

1.2.3 酰胺鍵交聯(lián)如圖2（b）中路線4所示，經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺活化的ChS（ChS-NHS），可與含伯胺的聚合物形成酰胺鍵交聯(lián)的水凝膠。例如，Strehin等[76]以PEG-（NH2）6為交聯(lián)劑和力學(xué)強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，與ChS-NHS混合后在37 ℃反應(yīng)10 min發(fā)生凝膠化。改變兩者的投料比并不影響體系的凝膠化時(shí)間，但PEG-（NH2）6含量增大時(shí)可增強(qiáng)水凝膠的力學(xué)性能。因ChS-NHS也可以和周邊組織中蛋白質(zhì)上的氨基發(fā)生反應(yīng)，故該水凝膠具有較高的黏附強(qiáng)度（比纖維蛋白膠的黏附強(qiáng)度高約10倍）。

類似于ChS，膠原蛋白也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具有有利于細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞黏附點(diǎn)，常用于細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的仿生構(gòu)建和軟骨組織工程。雖然膠原蛋白（I型和II型）可在生理?xiàng)l件下自組裝形成短的納米纖維，但無(wú)法形成水凝膠，故研究人員將膠原蛋白與ChS-NHS混合，得到物理和化學(xué)雙交聯(lián)的可注射水凝膠，用于輸送細(xì)胞和組織工程支架[43,58,59]。其中的化學(xué)交聯(lián)即是通過(guò)ChS-NHS上的活化羧基和膠原蛋白上的氨基在生理?xiàng)l件下形成酰胺鍵而實(shí)現(xiàn)的。例如，Gao課題組[58]制備了I型膠原蛋白與ChS-NHS組成的水凝膠。由于II型膠原蛋白（Col II）比I型具有更好的維持軟骨細(xì)胞表型、促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化的能力，該課題組又制備了Col II-ChS可注射和自交聯(lián)的水凝膠[59]。這兩個(gè)體系中均無(wú)需任何催化劑。由于此體系中化學(xué)交聯(lián)的速率比自組裝的物理交聯(lián)快，故凝膠化時(shí)間主要由化學(xué)交聯(lián)來(lái)決定，其隨體系中ChS-NHS用量的增大以及NHS取代度的升高而變短（幾分鐘內(nèi)）。凝膠的吸水性也隨著ChS-NHS用量的增加而增加。

另外，Zhou等[43]將未經(jīng)NHS活化的ChS與Col II混合后，以無(wú)毒、有抗炎促軟骨修復(fù)作用的京尼平作為生物交聯(lián)劑，制備包封脂肪來(lái)源干細(xì)胞的水凝膠，用于治療髓核變性。京尼平的羥基和酯基等活性基團(tuán)可與膠原蛋白上的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。該體系在37 ℃下可于6 min內(nèi)形成凝膠。由于京尼平交聯(lián)劑的毒性低，所形成的水凝膠具有良好的生物相容性，可促進(jìn)髓核特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)退化髓核的再生。但其不足之處是京尼平交聯(lián)中會(huì)產(chǎn)生深藍(lán)色色素，影響其使用。

1.2.4 其他化學(xué)交聯(lián)方式除上述席夫堿、點(diǎn)擊反應(yīng)和形成酰胺鍵的化學(xué)交聯(lián)外，還有光化學(xué)交聯(lián)和動(dòng)態(tài)金屬配位交聯(lián)等交聯(lián)方式。Brown等[61]在由ChS和甲基丙烯酸酐反應(yīng)得到的硫酸軟骨素甲基丙烯酸酯（mChS，見(jiàn)圖2（c））中加入光引發(fā)劑，在低強(qiáng)度的紫外光（320～390 nm，10 mW/cm2）照射下，體系發(fā)生光聚合反應(yīng)，得到原位水凝膠。當(dāng)在mChS單體溶液中加入脂肪干細(xì)胞和脫細(xì)胞脂肪組織時(shí)，光聚合的水凝膠可用作脂肪組織工程的支架材料。另外，Ornell等[77]以甲基丙烯酸縮水甘油酯代替上述的甲基丙烯酸酐與ChS反應(yīng)，得到生物相容性更好的光聚合前體聚合物硫酸軟骨素甲基丙烯酸縮水甘油酯（ChS-GMA，見(jiàn)圖2（c））。然后在光引發(fā)劑存在下用紫外光（365 nm，10 mW/cm2）輻照得到ChS-GMA水凝膠。該水凝膠可通過(guò)靜電吸附作用負(fù)載陽(yáng)離子型化療藥物如阿霉素和舒尼替尼。通過(guò)調(diào)控該體系的組成和ChS-GMA中甲基丙烯酸酯取代度，可以很方便地調(diào)節(jié)藥物的負(fù)載和釋放，有望用于瘤內(nèi)注射治療實(shí)體瘤。

另外，Dai等[44]制備了一種基于ChS和Fe3+之間的動(dòng)態(tài)金屬-配體配位化學(xué)的可注射金屬水凝膠。該水凝膠同時(shí)具有生物黏附性、自愈合性和多重響應(yīng)性。將含有Fe3+和ChS的溶液在室溫下混合后，因Fe3+與ChS鏈上的―OH、―COOH和―NH―可快速絡(luò)合，在10 s內(nèi)即形成凝膠。該水凝膠的組織黏附性優(yōu)于商用纖維蛋白膠，是一種優(yōu)良的生物黏合劑。另外，在pH、離子、中性分子絡(luò)合劑和氧化還原反應(yīng)等外界刺激下，通過(guò)凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變，可快速去除生物黏附。

1.3 酶催化交聯(lián)的ChS類可注射水凝膠

酶催化交聯(lián)是指線性聚合物或小分子在生物酶催化下發(fā)生的交聯(lián)反應(yīng)，具有專一、高效、反應(yīng)條件溫和（在生理?xiàng)l件下反應(yīng)）、反應(yīng)速率可調(diào)和、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[48]。已有報(bào)道將辣根過(guò)氧化物酶（HRP）用于制備ChS類可注射水凝膠[62,63,78]。HRP是一種單鏈β型血紅素蛋白，是過(guò)氧化物酶中應(yīng)用最廣泛的一種，可與H2O2一起引發(fā)苯酚或苯胺衍生物產(chǎn)生自由基而發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。基于這個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)，將羧基活化的ChS與酪胺（TA）的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)（圖2（b）中路線5），其產(chǎn)物ChS-TA可與自身或含酪胺結(jié)構(gòu)的其他聚合物在HRP和H2O2的作用下經(jīng)共價(jià)交聯(lián)形成水凝膠。其交聯(lián)機(jī)制是：HRP首先被H2O2氧化形成氧化型Fe（IV）卟啉陽(yáng)離子自由基，該自由基將ChS-TA中的還原態(tài)酚羥基氧化為苯氧自由基，然后形成苯氧鄰位的C―C鍵，或鄰位的碳與苯氧的氧相連，由此得到三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[79]。在原位凝膠形成過(guò)程中，帶活性自由基的ChS-TA也可能與細(xì)胞外基質(zhì)中酪氨酸分子上的酚羥基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而使凝膠更好地與宿主組織結(jié)合在一起。

FDA批準(zhǔn)的普蘭多糖具有高黏附性和強(qiáng)的力學(xué)性能，ChS具有抗炎、促進(jìn)傷口愈合等生物活性，Yan課題組[62]以HRP為催化劑，以H2O2為氧化劑，在生理?xiàng)l件下將ChS-TA和酪胺化普蘭多糖（CMP-TA）交聯(lián)得到可注射水凝膠，用于軟骨組織工程。CMP-TA的制備方法與ChS-TA類似，也是TA的氨基與普蘭多糖中活化的羧基反應(yīng)而制得。CMP-TA和ChS-TA的溶液與HRP和H2O2簡(jiǎn)單混合即可快速形成水凝膠。通過(guò)改變兩種聚合物的質(zhì)量比、濃度以及HRP和H2O2的濃度，可以方便地調(diào)節(jié)體系的理化性質(zhì)，如凝膠化時(shí)間、凝膠力學(xué)性能和降解行為等。例如，在濃度為0.6 U/mL的HRP和1 mmol/L的H2O2作用下，當(dāng)CMP-TA/ChS-TA的質(zhì)量比從純CMP-TA轉(zhuǎn)變?yōu)榧僀hS-TA時(shí)，凝膠化時(shí)間從36 s顯著增加到287 s。這說(shuō)明體系的凝膠化時(shí)間隨ChS-TA含量的增大而增加。這可歸因于ChS-TA中含有更多的酸根離子（如和），具有較大的空間位阻，或通過(guò)靜電作用與酶的活性位點(diǎn)發(fā)生相互作用，從而降低了凝膠化速率。這種可注射水凝膠還具有細(xì)胞相容性好和組織相容性好等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)兩者的質(zhì)量比為3∶1時(shí)，水凝膠具有最好的維持軟骨細(xì)胞表型和增強(qiáng)軟骨形成的效果。另外，ChS-TA的加入也明顯減弱了CMP-TA水凝膠的炎癥反應(yīng)。

基于透明質(zhì)酸（HA）良好的彈性和短鏈ChS的能量耗散性，Zhang等[63]采用類似方法，將酪胺修飾的HA（HA-TA）和ChS-TA在H2O2和HRP作用下，形成可包封骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的可注射水凝膠，用于骨組織修復(fù)和再生（圖6）。改變H2O2和HRP的濃度，可以方便地調(diào)節(jié)體系的凝膠化時(shí)間在幾分鐘到幾秒之間，也可調(diào)節(jié)凝膠的力學(xué)性能。例如，當(dāng)HRP的濃度為1.5 U/mL、H2O2濃度為4 mmol/L時(shí)，體系的凝膠化時(shí)間為15 s，凝膠孔徑為100～300 μm，有利于凝膠內(nèi)細(xì)胞的存活，也便于骨修復(fù)操作。

圖6 酶催化交聯(lián)的包封BMSCs的ChS/HA可注射水凝膠的制備路線[63]Fig. 6 Synthesis route of BMSCs-laden ChS/HA injectable hydrogel with enzyme-catalyzed crosslinking[63]

2 ChS類可注射水凝膠的性能調(diào)控

ChS類可注射水凝膠已被用于骨及軟骨修復(fù)、生物黏合劑、藥物輸送和細(xì)胞治療等醫(yī)用領(lǐng)域。ChS類可注射水凝膠作為功能材料，不僅需要具有良好的生物相容性，還需有適宜的性能，如合適的凝膠化時(shí)間、較高的且可調(diào)控的力學(xué)強(qiáng)度、可調(diào)控的降解行為以及黏附性和自愈合性等。本文在論述以上各種ChS類可注射水凝膠的制備時(shí)，雖已提及相關(guān)的凝膠性能，但有些具體研究未能歸納其中?，F(xiàn)將相關(guān)調(diào)控凝膠化時(shí)間、增強(qiáng)力學(xué)性能和黏附性等的研究簡(jiǎn)介于此。

2.1 調(diào)控凝膠化時(shí)間

如前所述，采用熱交聯(lián)和酶交聯(lián)的體系一般具有較短的凝膠化時(shí)間，而DA反應(yīng)交聯(lián)則需要較長(zhǎng)時(shí)間（有的長(zhǎng)達(dá)幾十分鐘）[80]。為縮短單一DA化學(xué)交聯(lián)體系的凝膠化時(shí)間，通常采用物理交聯(lián)與化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合的雙交聯(lián)方式[41,55]。例如，Liu課題組[55]報(bào)道了一種基于非共價(jià)和DA加成雙交聯(lián)、自增強(qiáng)的ChS類可注射水凝膠。該體系在注射入體內(nèi)后，通過(guò)環(huán)糊精與金剛烷間的主客體識(shí)別的超分子相互作用，以及PNIPAM溫敏性的sol-gel轉(zhuǎn)變來(lái)實(shí)現(xiàn)體系的迅速凝膠化。然后通過(guò)呋喃接枝的ChS（ChS-F）和馬來(lái)酰亞胺封端的聚乙二醇（PEG-AMI）間發(fā)生DA加成反應(yīng)交聯(lián)（如圖2（b）中路線3）。這種物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)的聯(lián)用，使整個(gè)體系的凝膠化時(shí)間在90 s以內(nèi)。這種聯(lián)用技術(shù)不僅克服了單一DA反應(yīng)交聯(lián)凝膠化時(shí)間長(zhǎng)的缺陷，還提高了水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度（儲(chǔ)能模量達(dá)到25 MPa）和含水量（＞98 %），為開(kāi)發(fā)高性能的可注射水凝膠提供了新途徑。該課題組還采用類似方法，以馬來(lái)酰亞胺封端的溫敏聚合物F127（F127-AMI）為親雙烯體交聯(lián)劑，與前述的呋喃接枝的ChS（ChS-F）發(fā)生DA加成反應(yīng)，在體外合成了溫敏性F127@ChS共聚物。然后和前述的PEG-AMI混合，制備了熱交聯(lián)和DA化學(xué)交聯(lián)雙重交聯(lián)的可注射水凝膠F127@ChS-PEG，也用于彌補(bǔ)單一的DA反應(yīng)交聯(lián)體系凝膠化時(shí)間長(zhǎng)的缺陷[41]。低質(zhì)量濃度（20 g/L）的F127@ChS溫敏共聚物可以在生理溫度下發(fā)生sol-gel轉(zhuǎn)變，作為物理交聯(lián)部分，使體系快速凝膠化。當(dāng)F127@ChS的質(zhì)量濃度從20 g/L增加到60 g/L時(shí)，凝膠化時(shí)間也隨之從140 s減少到40 s。

另外，Liu課題組[64]還通過(guò)DA反應(yīng)和形成動(dòng)態(tài)酰腙鍵制備了多重化學(xué)交聯(lián)的F127@ChS-PEG-OChS水凝膠。這里，動(dòng)態(tài)酰腙鍵賦予體系可注射性和自愈合性，縮短了單純DA反應(yīng)交聯(lián)的凝膠化時(shí)間。但DA交聯(lián)可增強(qiáng)水凝膠在體內(nèi)的穩(wěn)定性，并調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的性能。具體做法是，首先將上述經(jīng)DA反應(yīng)形成的F127@ChS-F溫敏聚合物，通過(guò)EDC/NHS反應(yīng)體系活化羧基，再與己二酰肼反應(yīng)，得到F127@ChS-F-ADH。然后將一定量的PEG-AMI與F127@ChS-F-ADH均勻混合，并與氧化的ChS分別裝入雙管注射器中，同時(shí)擠壓形成F127@ChS-PEG-OChS水凝膠。在此體系中，AMI殘基和呋喃基團(tuán)之間發(fā)生DA化學(xué)反應(yīng)，而ADH殘基和OChS的醛基間形成動(dòng)態(tài)的酰腙鍵。通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)密度和聚合物含量，可以很方便地調(diào)節(jié)體系的凝膠化時(shí)間從幾分鐘減少到幾秒鐘。

2.2 增強(qiáng)凝膠的力學(xué)性能

一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)調(diào)節(jié)體系組分組成和交聯(lián)密度，可以改善凝膠的力學(xué)性能[57,63]。而凝膠體系的交聯(lián)方式不僅影響體系的凝膠化過(guò)程，也影響凝膠形成后的力學(xué)性能。由此，可采用多種交聯(lián)方式聯(lián)用，形成二重甚至三重交聯(lián)的凝膠體系[41,56]，來(lái)改善凝膠的力學(xué)性能。例如在上述F127@ChS-PEG可注射水凝膠中，殘留在F127@ChS上的呋喃基團(tuán)與PEG-AMI上的馬來(lái)酰亞胺殘基進(jìn)一步發(fā)生DA加成反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)，使所形成的水凝膠的剪切存儲(chǔ)模量從單純熱交聯(lián)的F127@ChS水凝膠的100 Pa左右增強(qiáng)到1 kPa以上，且隨著PEG-AMI用量的增大而增大[41]。這種可注射水凝膠負(fù)載骨修復(fù)因子后在大鼠顱骨缺損治療中表現(xiàn)出良好的修復(fù)效果。

Shen等[78]采用基于兩種酶的兩步交聯(lián)法來(lái)構(gòu)建高強(qiáng)度的3D打印水凝膠。該水凝膠的前體由甲基丙烯酸甘油酯和酪胺修飾的ChS（GMA-ChS-TA）、辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、丙烯酰胺和水組成。其交聯(lián)過(guò)程包括兩步：（1）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2，在H2O2和辣根過(guò)氧化物酶共同作用下，GMA-ChS-TA中的酪氨被氧化，發(fā)生酶介導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)，形成力學(xué)強(qiáng)度較弱的水凝膠I；（2）GMAChS-TA中的酪胺繼續(xù)被辣根過(guò)氧化物酶/葡萄糖氧化酶催化氧化，形成α-碳自由基，引發(fā)體系中含雙鍵的丙烯酰胺和甲基丙烯酸甘油酯中的雙鍵發(fā)生自由基共聚，形成復(fù)合水凝膠II。由此兩步交聯(lián)反應(yīng)得到的凝膠II比凝膠I具有更高的抗壓縮性能和楊氏模量。通過(guò)調(diào)控共聚單體的用量，可調(diào)控凝膠II的力學(xué)性能。該方法也可用于制備高力學(xué)強(qiáng)度的可注射水凝膠。

另外，在ChS可注射水凝膠體系中引入共價(jià)交聯(lián)的氧化石墨烯，也可增強(qiáng)凝膠的力學(xué)性能。氧化石墨烯不僅具有優(yōu)越的電子、光學(xué)、界面、化學(xué)和力學(xué)性能，還可以在水中降解為腐殖酸類的結(jié)構(gòu)；也可被酶降解為細(xì)胞相容性產(chǎn)物[81]。據(jù)此，Tang等[60]將伯胺共價(jià)修飾的氧化石墨烯與前述羧基活化的ChS反應(yīng)，生成酰胺鍵交聯(lián)的復(fù)合水凝膠。該體系可在10 min內(nèi)原位凝膠化。與一般的ChS凝膠相比，復(fù)合水凝膠的剛度增加320%，韌性增加70%。

2.3 增強(qiáng)凝膠的組織黏附性

作為軟骨和骨修復(fù)等組織工程材料時(shí)，凝膠與周圍組織的黏附性也是一個(gè)重要的指標(biāo)。雖然ChS自身具有一定的組織黏附性，但為進(jìn)一步增強(qiáng)支架與宿主組織之間的結(jié)合，可在凝膠體系中引入另外的黏附性更強(qiáng)的材料，如明膠[45]、膠原蛋白[58,59]和普魯蘭多糖[54]等。

另外，Wiltsey等[50]在其前期工作基礎(chǔ)上，基于海藻酸鹽中含有大量的羧基，可與組織中蛋白質(zhì)上帶正電的區(qū)域經(jīng)靜電作用而相互吸引帶來(lái)強(qiáng)的生物黏附性，將海藻酸鈣顆粒分散在聚（N-異丙基丙烯酰胺）接枝ChS（PNIPAM-g-ChS）的凝膠中，可明顯增強(qiáng)凝膠的黏附性[82]。結(jié)果表明，50 g/L的PNIPAM-g-ChS分散體中摻入50 mg/mL或75 mg/mL的海藻酸鈣顆粒后，形成凝膠的黏附抗拉強(qiáng)度提高了4倍。海藻酸鈣微粒的摻入也顯著提高了PNIPAM-g-ChS的溶脹能力，有助于在組織缺陷中保持空間填充的形狀。此外，該課題組還將此PNIPAM-g-ChS共聚物與含醛基的OChS共混，利用OChS中的醛基與組織中的氨基形成席夫堿而增加其組織黏附性[42]。但多余的活性醛基會(huì)損害包封細(xì)胞的活力，因此該課題組將明膠包封在脂質(zhì)體中與共聚物共混，在生理溫度下脂質(zhì)體熔化，釋放的明膠再與體系中多余的醛基發(fā)生反應(yīng)，從而減少殘余醛基對(duì)細(xì)胞活力的影響。該方法在增強(qiáng)凝膠組織黏附性的同時(shí)，還降低了毒副反應(yīng)，是一種很好的構(gòu)建黏附性生物支架的方法。

近年來(lái)，仿貽貝水凝膠由于其超強(qiáng)的黏附性能受到廣泛關(guān)注。其強(qiáng)的黏附性主要來(lái)自于鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可通過(guò)氫鍵、疏水作用和π-π堆積等非共價(jià)鍵作用，以及形成席夫堿、邁克爾加成和形成硼酸-兒茶酚絡(luò)合物等共價(jià)作用，而對(duì)多種物質(zhì)具有黏附性[83-85]。Han等[86]將仿貽貝的、具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的聚多巴胺引入到ChS類水凝膠中，形成聚多巴胺-ChS-聚丙烯酰胺復(fù)合水凝膠，以增加對(duì)軟骨細(xì)胞的黏附性，促進(jìn)軟骨再生。該策略有望用于ChS類可注射黏附性水凝膠的構(gòu)建中。

3 結(jié)論及展望

硫酸軟骨素類可注射水凝膠由于其主要組成單元硫酸軟骨素本身是細(xì)胞基質(zhì)的主要成分，還具有促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)、調(diào)控生長(zhǎng)因子、促進(jìn)傷口愈合等多種生理功能，因此其用于軟骨和骨修復(fù)等組織工程材料時(shí)，具有其他可注射水凝膠不可比擬的優(yōu)勢(shì)。其凝膠化方式主要有物理熱誘導(dǎo)的凝膠化、形成席夫堿、點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)、形成酰胺鍵和光交聯(lián)等化學(xué)交聯(lián)，也有溫和的酶交聯(lián)等。這些方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。如熱誘導(dǎo)的凝膠化體系一般為單組分，具有操作方便、凝膠化快、無(wú)毒副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，但形成的凝膠力學(xué)性能較差?；瘜W(xué)交聯(lián)可很好地改善凝膠的力學(xué)性能，但一般為雙組分，需要雙管推注，操作上比單組分熱誘導(dǎo)的交聯(lián)體系繁瑣；另外也可能有副產(chǎn)物帶來(lái)潛在的毒性；有的體系還需要和物理交聯(lián)等其他交聯(lián)方法聯(lián)用以減少反應(yīng)時(shí)間，形成多重網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。酶交聯(lián)具有溫和、反應(yīng)專一等優(yōu)點(diǎn)，但也具有和化學(xué)交聯(lián)類似的多組分注射問(wèn)題。因此，發(fā)展基于硫酸軟骨素的更便于使用、凝膠化時(shí)間適宜和良好力學(xué)性能的可注射水凝膠是值得深入研究的方向。同時(shí)，應(yīng)擴(kuò)展凝膠化體系組成，增強(qiáng)其組織黏附性和自愈合性。這些研究結(jié)果將有利于硫酸軟骨素類可注射水凝膠的臨床轉(zhuǎn)化。

另外，對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于硫酸軟骨素的可注射水凝膠，有兩個(gè)問(wèn)題值得關(guān)注。其一是ChS的來(lái)源以及其生物效應(yīng)。不同于具有特定結(jié)構(gòu)的合成高分子，來(lái)自于動(dòng)物組織提取的ChS因來(lái)源不同，而具有不同的類型，而不同類型的ChS具有不同的生理活性。例如在胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)最多的ChS-C，可促進(jìn)腦軸突的生長(zhǎng)和再生；成年期表達(dá)最豐富的ChS-A卻使神經(jīng)系統(tǒng)可塑性下降，對(duì)記憶產(chǎn)生不利影響[87]。商業(yè)上使用的硫酸軟骨素多提取于雞、牛、豬和鯊魚(yú)等，其中提取于鯊魚(yú)軟骨的以ChS-C為主[88]，而提取于豬軟骨的以ChS-A為主[35]。研究結(jié)果證實(shí)，外源ChS-E可抑制小鼠骨肉瘤細(xì)胞增殖，而CS-A和CS-C則沒(méi)有此效果[89]。因此，在構(gòu)建生物醫(yī)用的基于ChS的可注射水凝膠時(shí)，要注意其來(lái)源及類型，以及由此帶來(lái)的生物效應(yīng)。然而，欲獲得純的單一組成的ChS仍是一個(gè)挑戰(zhàn)性課題，因此目前ChS原料純度低以及由此帶來(lái)的性能上的不確定性，制約了具有獨(dú)特生物功能的ChS類可注射水凝膠體系的開(kāi)發(fā)。預(yù)期隨著單一組分ChS可控制備或純化技術(shù)的進(jìn)步，將會(huì)進(jìn)一步深化ChS類型和分子量等物性參數(shù)對(duì)可注射水凝膠的凝膠化行為、凝膠的力學(xué)強(qiáng)度、黏附性和生物活性等的系統(tǒng)性研究[90]。而這些研究將有助于充分發(fā)揮ChS本身的生物功能、深化物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系、以及發(fā)展更好的組織工程材料和其他生物醫(yī)用材料。其二，尚缺乏多種響應(yīng)性ChS類水凝膠的構(gòu)建和研究。眾所周知，響應(yīng)性的水凝膠有利于包載藥物或者細(xì)胞以及生物分子等的可控釋放[91]，但目前僅限于基于ChS的溫度敏感型水凝膠的研究，而對(duì)于氧化還原響應(yīng)型、酶響應(yīng)型等體系的研究還有待深入。

目前ChS類可注射水凝膠主要用于細(xì)胞治療以及骨和軟骨修復(fù)等，基于此類水凝膠的優(yōu)良特性，可拓展其用途到其他領(lǐng)域，如利用其抗炎抗凝血等特性可用于心臟瓣膜組織工程、利用其抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等特性用于構(gòu)造腫瘤的瘤內(nèi)注射藥物載體和血管介入栓塞材料等。筆者相信，隨著越來(lái)越多研究者的加入和研究的深化，基于硫酸軟骨素類可注射水凝膠必將在生物醫(yī)用材料方面發(fā)揮更大的作用。