油茶籽仁中茶皂素的提取與分析

◎ 張洺榛，廖小麗

（1.湖北江曉環(huán)?？萍加邢薰?，湖北 武漢 430000；2.武漢海關(guān)技術(shù)中心，湖北 武漢 430000）

油茶作為21世紀(jì)重要的木本油料作物之一，近年來一直被作為研究熱點(diǎn)為廣大學(xué)者所熱衷。油茶的主要利用部分為油茶果，油茶果主要由油茶外殼、油茶籽殼、油茶籽仁三大組分構(gòu)成[1]，其中，油茶籽仁除含有大量的不飽和脂肪酸外，蛋白質(zhì)、糖類、茶皂素等也是其主要成分，同時(shí)油茶籽仁還含有植物甾醇、角鯊烯等微量活性成分。在這些組分當(dāng)中，茶皂素又是其中的熱點(diǎn)。茶皂素又被稱為茶皂苷，熔點(diǎn)約224 ℃，平均分子式為C57H90O26，相對分子質(zhì)量為1 200～2 800，是一種天然的糖苷化合物[2]，同時(shí)也具備這一類物質(zhì)的通性——易溶于乙醇和甲醇，但是難溶于無水甲醇和無水乙醇，不溶于石油醚、苯等有機(jī)試劑。由于其具備抗菌、抗病毒、降血脂等諸多優(yōu)勢，茶皂素被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)美、食品等領(lǐng)域[3]。

油茶是我國的特色植物，在國外的種植較為稀少，所以國外學(xué)者對于油茶及其相關(guān)物質(zhì)的研究不多[4]。而國內(nèi)學(xué)者提取茶皂素的方法主要分為水提法和醇提法兩種，經(jīng)有關(guān)學(xué)者試驗(yàn)得知，水提法提出來的茶皂素相對于醇提法來說雜質(zhì)多一些，但是水提法相對成本低廉，所以這兩種方法在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中都有所應(yīng)用[5]。本文采用80%熱乙醇溶液（75 ℃）進(jìn)行浸提，為了保證其得率，采用復(fù)提取的方法進(jìn)行提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采用湖南衡陽產(chǎn)地曬干帶殼茶籽。茶皂素分析標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，阿拉?。o水乙醇（AR）、硫酸（1.86 g·mL-1）、香草醛（AR）、石油醚（30～60 ℃，AR），試劑均為上海國藥集團(tuán)生產(chǎn)；純水（滿足實(shí)驗(yàn)室三級水及以上），實(shí)驗(yàn)室常用材料及耗材。

1.2 儀器與設(shè)備

E7221型紫外-可見分光度計(jì)及其配套器材；me2041型電子天平（感量為0.000 1 g）；HH-S1型恒溫水浴鍋；101-4B型鼓風(fēng)干燥機(jī)；HU10300/40B型超聲清洗機(jī)；2500型粉碎機(jī)。

1.3 溶液配制

80%乙醇溶液（V/V）：4份無水乙醇加1份純水，充分混勻；1 mg·mL-1茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100 mg樣品，用80%乙醇溶液溶解并定容至100 mL；77%硫酸溶液（V/V）：將77.00 mL硫酸（1.86 g·mL-1）用玻璃棒緩慢引流至盛有23.00 mL純水的200 mL燒杯中；8%香草醛溶液（W/V）：將4 g香草醛固體溶于50.00 mL的80%乙醇溶液中。

1.4 樣品預(yù)處理

1.4.1 去殼處理

將200 g左右茶籽裝在網(wǎng)袋中用木錘進(jìn)行捶打，使油茶籽殼與油茶籽仁分離，然后挑選出茶籽仁。在這個(gè)過程中需要將所有茶籽分離，保證樣品的均一性，同時(shí)在捶打過程中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制好力度，防止樣品破碎導(dǎo)致出油率過高出現(xiàn)黏連等現(xiàn)象，引入過大的誤差。

1.4.2 粉碎

將步驟1.4.1中分離的油茶籽仁放入粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后過20目篩，樣品過篩率要達(dá)到95%以上且不可以強(qiáng)行過篩，過篩完后將樣品混勻，裝袋備用。

1.4.3 含水率測定

通過重量法進(jìn)行含水率測定，在烘干、干燥、恒重后的鋁盒中加入步驟1.4.2中樣品（10.0±0.1）g，蓋上鋁盒放入烘箱烘干至恒重，以上遵循國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）。該步驟是為了能夠校正后面測定樣品的實(shí)際質(zhì)量，從而使結(jié)果誤差有效降低。

1.4.4 索氏提取

以石油醚做提取劑用感量為0.000 1 g的電子天平稱取步驟1.4.2中樣品（1.00±0.01）g，按照索氏提取的操作規(guī)程用濾紙將樣品包起來，折成適宜大小放入虹吸管進(jìn)行索氏提取，時(shí)間為6 h。該步驟是為了充分將油清除，防止后面在顯色時(shí)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.5 干燥

將索氏提取完成后的濾紙包取出，放入鼓風(fēng)干燥機(jī)中（70±2）℃恒溫烘干30 min，將殘留的石油醚蒸發(fā)耗盡。

1.4.6 乙醇提取

將干燥后的濾紙包放入100 mL的錐形瓶中，加入50 mL的80%乙醇溶液，封上封口膜，在75 ℃的條件下恒溫水浴提取2 h，其間超聲3～5次，到時(shí)間后將燒瓶中的殘余液直接轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，并用80%乙醇溶液清洗幾遍，清洗濾液也轉(zhuǎn)移至同一個(gè)250 mL容量瓶中。重復(fù)以上步驟進(jìn)行乙醇復(fù)提取。

1.4.7 轉(zhuǎn)移、定容

將兩次提取液最終都放置在一起，并按照定容相關(guān)操作用80%乙醇溶液定容至刻度線。期間，定容至250 mL容量瓶約2/3處進(jìn)行充分搖勻，定容結(jié)束后蓋上玻璃塞進(jìn)行上下?lián)u勻，再將玻璃塞旋轉(zhuǎn)180°后再度搖勻，確保溶液的均一性。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 上機(jī)前

用移液管準(zhǔn)確吸取1 mL步驟1.5.7中定容后的溶液至玻璃試管中，加入0.5 mL的8%香草醛溶液，再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液，充分混勻后60 ℃水浴15 min，緊接著冰水浴10 min。

1.5.2 上機(jī)測試

將步驟1.5.1中冰水浴后的樣品用紫外-可見分光光度計(jì)在533 nm進(jìn)行測試，記錄下吸光度A。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取次數(shù)確定

在本次實(shí)驗(yàn)中，提取率與提取次數(shù)的關(guān)系如表1所示。

表1 油茶中茶皂素提取率與提取次數(shù)的關(guān)系表

假設(shè)在第4次茶皂苷提取完全，在第1～3次的相對得率分別為76.56%、94.36%、97.32%，出于綠色化學(xué)理念和實(shí)驗(yàn)成本等多方面進(jìn)行綜合考量，提取2次是最佳實(shí)驗(yàn)方案。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與確定

選取6支玻璃試管，編號1、2、3、4、5和6，用移液管分別準(zhǔn)確吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的1 mg·mL-1的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入80%乙醇溶液0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0.0 mL；再分別加入0.5 mL的8%香草醛溶液，然后再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液，充分混勻后60 ℃水浴15 min，緊接著冰水浴10 min。

最大吸收波長的選擇：將2、4、6號管的溶液在400～780 nm，間隔1 nm區(qū)間進(jìn)行光譜掃描，最終確定533 nm為最大吸收波長，即實(shí)驗(yàn)測定波長。

按照以上操作，以吸光度為縱坐標(biāo)，以茶皂素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為y=0.796 7x-0.004 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

圖1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 油茶籽仁中茶皂素含量測定

測得樣品濃度分別為16.05%、16.18%、16.14%，平均濃度為16.12%。經(jīng)過測定，茶籽含水率為5.73%，則茶皂素的實(shí)際濃度為17.10%。

2.4 精密度試驗(yàn)

經(jīng)過計(jì)算，相關(guān)數(shù)據(jù)相對平均偏差為0.33%，符合化學(xué)分析相關(guān)要求，即數(shù)據(jù)證明有效。

2.5 加標(biāo)回收率

重新選擇6根玻璃試管，分別加入0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL樣品，再分別加入0.1 mL的1 mg·mL-1茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用80%乙醇溶液補(bǔ)到1 mL，再加入0.5 mL的8%香草醛溶液，然后再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液，充分混勻后60 ℃水浴15 min，緊接著冰水浴10 min。經(jīng)測定，該方法的加標(biāo)回收率為95.8%～101.3%如表2所示，符合化學(xué)分析相關(guān)要求，即數(shù)據(jù)證明有效。

表2 加標(biāo)回收率測試原始數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

通過香草醛-濃硫酸法測定茶皂素含量，雖然在整個(gè)過程中會受到油脂的干擾以及反應(yīng)時(shí)間的影響，但是相對于HPLC測定茶皂素來說，此方法更為便捷、消耗時(shí)間也更少，不需要進(jìn)行過多的操作，為后續(xù)的類似實(shí)驗(yàn)處理提供了便捷途徑。

本方法各項(xiàng)指標(biāo)均符合化學(xué)分析的相關(guān)要求，但由于實(shí)驗(yàn)影響因素較多，所以導(dǎo)致部分細(xì)節(jié)方面有待商榷，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)該更加注重一些細(xì)節(jié)性的問題，使油茶果中茶皂素的提取和測定更加精確。同時(shí)，由于茶皂素物質(zhì)組成較為復(fù)雜，導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)不一定是最佳的測試條件，這也是茶皂素目前為止沒有制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的原因之一。對于茶皂素測定的進(jìn)一步規(guī)范化，還有待其他學(xué)者的進(jìn)一步深入研學(xué)，從而找到一個(gè)公認(rèn)的優(yōu)良方法。