花生油中黃曲霉毒素B1高效液相色譜 檢測(cè)方法的探索與研究

◎ 唐國芳

（貴州省黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556000）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是常見的食品污染物之一，其危害極大。黃曲霉毒素有很多種，其中黃曲霉毒素B1（AFTB1）毒性最強(qiáng)，它的毒性比砒霜強(qiáng)幾十倍，對(duì)肝臟有嚴(yán)重的損傷，是Ⅰ類致癌物。AFTB1化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，很難溶于水，高溫高壓對(duì)它的破壞程度也很小，接近300 ℃時(shí)才開始裂解，所以一般的烹調(diào)方法對(duì)它基本上沒有作用?；ㄉ侨菀赘腥军S曲霉的農(nóng)作物之一，黃曲霉毒素對(duì)花生具有極高的親和性。黃曲霉的侵染和黃曲霉毒素的產(chǎn)生不僅發(fā)生在花生的種植過程中，而且在加工過程中也會(huì)產(chǎn)生。黃曲霉菌廣泛存在于土壤中，菌絲生長時(shí)易產(chǎn)生毒素，而生長在土壤之中的花生最容易感染黃曲霉毒素。制作花生油的過程中，大量的花生經(jīng)過壓榨，其中霉變花生所含的黃曲霉毒素很可能經(jīng)由這個(gè)過程出現(xiàn)在花生油中。

國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局規(guī)定，黃曲霉毒素B1作為重點(diǎn)食品污染物是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）[1]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，花生（油）和玉米（油）的黃曲霉毒素B1限值均為20 μg kg-1，在所有黃曲霉毒素B1限量的食物中限值最高。

本文根據(jù)中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心下達(dá)的能力驗(yàn)證計(jì)劃——《花生油中黃曲霉毒素B1的測(cè)定》（ACAS-PT833—2019），以中檢院提供的盲樣為樣品，以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》（GB 5009.22—2016）[2]標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件來探索花生油中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法，以加標(biāo)測(cè)回收率來驗(yàn)證方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀，熒光檢測(cè)器，光化學(xué)柱后衍生器，3 mL Pribolab黃曲霉毒素總量免疫親和柱。

甲醇-水（70+30）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，用水定容至1 000 mL；1% Triton X-100（或吐溫-20）的PBS： 取10 mL Triton X-100， 用PBS定 容 至1 000 mL。所用試劑均為分析純。

黃曲霉毒素B1（AFTB1）標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)值2.0 μg·mL-1，由國家農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所提供，編號(hào)SB05-195-2008。

1.2 分析步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制成200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用初始流動(dòng)相配制成濃度為0.625 ng·mL-1、1.250 ng·mL-1、2.500 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1、10.000 ng·mL-1、20.000 ng·mL-1、40.000 ng·mL-1的 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇-水溶液（70+30）提取液，渦旋混勻，置于渦旋振蕩器中振蕩20 min，在4 000 r·min-1下離心10 min，準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入40 mL左右1% Triton X-100（吐溫-20）的PBS，混勻，待過柱凈化。

1.3 樣品的凈化

1.3.1 免疫親和柱的準(zhǔn)備

將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。

1.3.2 試樣的凈化

免疫親和柱內(nèi)液體放棄后，將1.2.2處理好的樣品移至50 mL注射筒中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1～3 mL·min-1的速度穩(wěn)定下滴，待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)分兩次加入20 mL水，以穩(wěn)定的流速淋洗免疫親和柱，待水滴完后，用真空泵抽干親和柱，最后用4 mL甲醇分4次洗脫，控制洗脫速度在1～3 mL·min-1，收集洗脫液，在500 ℃下用氮?dú)饩従彺抵两?，用初始流?dòng)相定容至1 mL，渦旋30 s，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 加標(biāo)樣品的處理

稱取空白樣品5 g（精確至0.001 g），準(zhǔn)確加入0.5 mL 40 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，和樣品一起平行處理、凈化、上機(jī)檢測(cè)算回收率。

1.5 柱后光化學(xué)衍生法液相色譜參考條件

流動(dòng)相：A相甲醇，C相乙腈，D相水（體積比30∶10∶60）；色譜柱：Agilent Poroshell 120 C184.6×150 mm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：30 μL；柱溫：400 ℃；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)、以樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 樣品的測(cè)定

試樣中AFTB1的含量計(jì)算公式為：

式（1）中：X-試樣中AFTB1的含量，單位為μg·kg-1；C-進(jìn)樣溶液中AFTB1按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃度，單位為ng·mL-1；V1-試樣提取液體積，單位為mL；V3-樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，單位為mL；V2-用于免疫親和柱的分取樣品體積，單位為mL；m-樣品稱樣量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)線性系數(shù)達(dá)到0.999 9，線性范圍在0.625 ～ 40.000 ng·mL-1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

空白樣品加標(biāo)回收，回收率達(dá)到81.1%?？瞻准訕?biāo)圖譜圖如圖2所示。

用同樣的條件進(jìn)黃曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分離效果很好，如圖3所示。

圖2 空白加標(biāo)圖譜圖

圖3 黃曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)中檢院測(cè)試評(píng)價(jià)中心審核，與測(cè)試中心通報(bào)的指定值比較，兩個(gè)樣品Z值分別為0.1和0.2，獲得滿意結(jié)果。

2.2 實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

GB 5009.22—2016的分析方法中流動(dòng)相甲醇、乙腈、水的比例25∶25∶50，經(jīng)過探索，將甲醇、乙腈、水的比例調(diào)整為30∶10∶60，能讓AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG14種物質(zhì)達(dá)到理想的分離狀態(tài)。

在樣品前處理時(shí)加入吐溫試劑時(shí)，國標(biāo)添加量為23 mL，為了降低緩沖液中甲醇的濃度，本實(shí)驗(yàn)添加量為40 mL。AFTB1易溶于甲醇，先前上柱的提取液要棄去，讓提取液中提取出來AFTB1抗源與免疫親和柱中的AFTB1抗體能夠更充分有效的結(jié)合在一起。

洗脫的甲醇與國標(biāo)相比多了2 mL，這樣雖然增加了氮吹的時(shí)間，但能夠充分保證免疫親和柱與抗體結(jié)合的黃曲霉毒素B1能夠完全洗下來，提高回收率。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

免疫親和柱從冰箱中拿出來要放到室溫至少要在0.5 h以上。免疫親和柱內(nèi)真菌毒素的抗體在20～25 ℃時(shí)活性最強(qiáng)，所以樣品上柱凈化處理的環(huán)境溫度要控制在20～25 ℃。最后用甲醇洗脫時(shí)，第1 mL甲醇加進(jìn)去后，先把免疫親和柱的下端口堵住，溫育幾分鐘。氮吹結(jié)束用1 mL甲醇定容時(shí)要充分均勻，讓氮吹管壁上的黃曲霉毒素B1充分溶于甲醇中[3]。

做加標(biāo)回收，不要馬上加標(biāo)提取，充分混勻放置過夜，讓標(biāo)液有充分的時(shí)間和樣品混合，增加基質(zhì)的干擾，增加提取的難度。

黃曲霉毒素B1一般在中性溶液中較穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在pH 9～10的強(qiáng)堿溶液中迅速分解成幾乎無毒的鹽，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有裝過AFTB1的瓶子，器皿及AFTB1的殘留液均需過pH 9～10的強(qiáng)堿溶液中，使殘留液分解成無毒的鹽，避免對(duì)環(huán)境造成污染。

3 結(jié)論與討論

本次實(shí)驗(yàn)得到了花生油中黃曲霉毒素B1較為理想的檢測(cè)方法，此方法可推廣到黃曲霉毒素B族和G族的檢測(cè)，通過實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘莆仗岣呙庖哂H和柱回收率的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，對(duì)于其他真菌毒素的檢測(cè)提供了借鑒。

花生油深受廣大消費(fèi)者的喜愛，花生油中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素E等有益成分，經(jīng)常食用可以降低膽固醇，保護(hù)心腦血管[4-5]。花生油雖然營養(yǎng)價(jià)值豐富，但也不能長期食用，世界衛(wèi)生組織、中國糧農(nóng)組織和中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)等權(quán)威機(jī)構(gòu)研究得出，當(dāng)人體膳食中的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸的平衡比例達(dá)到1∶1∶1時(shí)，才是最健康、完美的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)。